一种山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途

1.本发明属于药物制备技术领域，具体地说，尤其涉及一种山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途。


背景技术：

2.我国的心血管疾病患病率高，且目前仍处于持续上升阶段，其中《中国心血管健康与疾病报告2021》指出：心血管疾病在我国发病率高，约有3.30亿人患有心血管疾病，2019年农村、城市心血管病分别占死因的46.74％和44.26％。目前心血管疾病仍然是我国居民死亡的首要原因，每5例死亡患者中就有2例死于心血管疾病，心血管疾病给国家、社会、家庭带来的经济负担日渐加重。
3.长期的高血压病、心脏瓣膜病、先天性心脏病、冠状动脉粥样硬化心脏病等多种心血管疾病最终可导致心力衰竭，心肌肥厚是这些疾病的发展过程中共同的病理反应。心肌肥厚的特征是心肌细胞肥大、心壁肥厚、心室尺寸过度增加，并导致心脏舒张功能障碍，由于肥厚的心肌耗氧量增加，心肌氧的供需失衡进一步诱发心律失常、心肌梗死、猝死等，因此，心肌肥厚被认为是心血管疾病发病率和死亡率的预测指标。心肌肥厚多出现于心血管疾病的早期，消除致病因素后可以一定程度上逆转心肌肥厚。故抑制和扭转心肌肥厚的发生对降低心血管疾病的发病率及死亡率至关重要。
4.心肌肥厚的特点是心肌细胞变大，肌节结构分离，蛋白质合成增强以及心房利钠肽(atrial natriuretic factor，anp)、脑钠肽(brain natriureticfactor，bnp)、β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-mhc)等胎儿基因重新表达。在心肌肥厚的众多影响因素中肾素-血管紧张素-醛固酮系统 (renin angiotension aldosterone system，raas)的激活是引起的病理性心肌肥厚的起始和关键步骤之一。机体长期激活rass，将导致自身处于一个高血压的状态，同时产生的肾素、血管紧张素、醛固酮引起心肌细胞肥大，导致心脏重构。血管紧张素ii是raas系统最为重要的体液因子之一。血管紧张素ii 直接激活心脏中的炎症反应，并可通过血管收缩和水钠潴留来调节动脉血压的升高。这些作用可导致病理性心肌肥厚。如何切实有效解决血管紧张素ii诱导的心脏肥大已成为当前亟待解决的问题。
5.而目前对于山海棠素药理活性作用的研究尚不多。上世纪90年代杨峻等研究发现，山海棠素可以抑制巴豆油和二甲苯诱导的小鼠迟发性超敏反应，减轻小牛血清白蛋白导致的大小鼠迟发性超敏反应，降低小鼠血清中igg含量，提高大小鼠循环中补体含量。近年来，宋献美等发现，山海棠素可保护iga肾病大鼠的肾功能，减轻肾间质纤维化，改善thl细胞/th2细胞平衡失调。yang等报道，山海棠素具有抗雄激素活性、降低雄激素受体表达的作用。但未有山海棠素可以减轻血管紧张素ii诱导心肌肥厚的报道。因此，将山海棠素有效运用于心肌肥厚病症药物制备中具有重大意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供了一种有效减轻血管紧张素ⅱ诱导的心肌肥厚的山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途。
7.为了实现上述技术目的，本发明山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途采用的技术方案为：
8.一种山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途，包括将山海棠素应用于动物实验和体外细胞实验中；
9.所述动物实验包括分为对照组、血管紧张素ⅱ组以及血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的三组实验组，所述对照组在小鼠皮下植入注有生理盐水的微型渗透泵4周，所述血管紧张素ⅱ组在皮下植入注有剂量为1.46mg/kg/d血管紧张素ⅱ的微型渗透泵4周，所述血管紧张素ⅱ复合山海棠素组在皮下植入注有剂量为1.46mg/kg/d血管紧张素ⅱ的微型渗透泵4周，同时以3mg/kg/d山海棠素灌胃，4周后进行心脏m型超声检测，并留取心脏组织；
10.所述体外细胞实验包括将体外原代培养乳鼠心肌细胞分为体外对照组、体外血管紧张素ⅱ组以及体外血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的三组实验组，所述体外对照组在含有10％胎牛血清的dmem培养基培养细胞48h，所述体外血管紧张素ⅱ组在含有10％胎牛血清和4umol/l血管紧张素ⅱ的dmem培养基干预细胞 48h，所述体外血管紧张素ⅱ复合山海棠素组在含有10％胎牛血清、4umol/l血管紧张素ⅱ以及100ug/l山海棠素的dmem培养基干预细胞48h，48h后对细胞进行实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)、免疫荧光等检测。
11.优选的，所述动物实验和体外细胞实验包括he染色、心脏m型超声检测、心脏组织实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)、细胞免疫荧光染色以及心肌细胞实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)。
12.优选的，所述对照组、血管紧张素ⅱ组以及血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的实验，每组均采用8只小鼠，小鼠为体重25～28g、8周龄的雄性c57bl/6j 小鼠。_
13.优选的，所述山海棠素为雷酚内脂，经卫矛科植物昆明海棠分离制得。
14.优选的，所述山海棠素分子结
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.本发明将山海棠素应用于心肌肥厚病症药物制备中，并对比血管紧张素ⅱ诱导的心肌肥厚病症进行he染色、心脏m型超声检测、心脏组织实时荧光定量聚合酶链反应、细胞免疫荧光染色以及心肌细胞实时荧光定量聚合酶链反应的实验对比，经山海棠素治疗后能够明显降低血管紧张素ⅱ诱导的心肌肥厚，减小收缩期心脏前后壁厚度以及舒张期心脏前后壁厚度，升高舒张期早期二尖瓣血流峰值速度/舒张期末期二尖瓣血流峰值速度(e/a值)，令心脏中心房利钠肽 (anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量减少，明显缩小心肌细胞体积以及减低心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链 (β-mhc)mrna含量。
附图说明
17.图1为用血管紧张素ii造模以及用山海棠素治疗后,小鼠心脏苏木素-伊红 (hematoxylin-eosin，he)染色结果；
18.图2为血管紧张素ii造模以及用山海棠素治疗后,心脏m型超声检测小鼠心肌肥厚结果；
19.图3为血管紧张素ii造模以及用山海棠素治疗后,心脏m型超声检测小鼠心脏舒张功能结果；
20.图4为实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)法研究血管紧张素ii造模以及用山海棠素治疗后，小鼠心脏心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量的结果；
21.图5为免疫荧光法检测山海棠素在体外对血管紧张素ii诱导的心肌细胞肥大的影响结果；
22.图6为实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)法研究山海棠素在体外对血管紧张素ii诱导的心肌细胞心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链 (β-mhc)mrna含量的影响结果。
具体实施方式
23.下面结合具体实施方式，对发明进一步说明：
24.一种山海棠素在心肌肥厚病症药物制备中的用途，包括将山海棠素应用于动物实验和体外细胞实验中；
25.所述动物实验包括分为对照组、血管紧张素ⅱ组以及血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的三组实验，所述对照组在皮下植入注有生理盐水的微型渗透泵4周，所述血管紧张素ⅱ组在皮下植入注有剂量为1.46mg/kg/d血管紧张素ⅱ的微型渗透泵4周，所述血管紧张素ⅱ复合山海棠素组在皮下植入注有剂量为 1.46mg/kg/d血管紧张素ⅱ的微型渗透泵4周，同时以3mg/kg/d山海棠素灌胃， 4周后进行心脏m型超声检测，并留取心脏组织，所述对照组、血管紧张素ⅱ组以及血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的实验，每组均采用8只小鼠，小鼠为体重 25～28g、8周龄的雄性c57bl/6j小鼠；
26.所述体外细胞实验包括将体外原代培养乳鼠心肌细胞分为体外对照组、体外血管紧张素ⅱ组以及体外血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的三组实验，所述体外对照组在含有10％胎牛血清的dmem培养基培养细胞48h，所述体外血管紧张素ⅱ组在含有10％胎牛血清和4umol/l血管紧张素ⅱ的dmem培养基干预细胞 48h，所述体外血管紧张素ⅱ复合山海棠素组在含有10％胎牛血清、4umol/l血管紧张素ⅱ以及100ug/l山海棠素的dmem培养基干预细胞48h，48h后对细胞进行q-pcr、免疫荧光等检测。
27.实施例1、小鼠心脏染色he染色
28.s1摘眼球取血，放尽小鼠体内血液，取出小鼠心脏，在磷酸盐缓冲液(pbs) 中清洗，轻柔挤压心脏，将心脏中残余的血排除，直至心脏中挤压出的液体完全清澈；
29.s2将心脏从pbs中取出，彻底吸干pbs，,将心脏从中间位置以水平面切开，放入10％多聚甲醛中固定；
30.s3取出小鼠心脏，将心脏在中间位置以水平面切开，放入10％多聚甲醛中固定,石
蜡包埋，2μm切片，染色前常规脱蜡至水,苏木素染核10min，清水震洗3次，盐酸酒精分化1s，清水震洗3次,伊红染色30s，清水震洗1次。晾干、封片、观察。
31.由图1看出，经血管紧张素ⅱ造模后，小鼠心脏较对照组肥大，而血管紧张素ⅱ复合山海棠素组小鼠心脏肥大程度较血管紧张素ⅱ组明显减轻。
32.实施例2、小鼠心脏m型超声检测
33.s1采用2％异氟烷/100％氧气轻度麻醉小鼠，小鼠平卧于加热板，经胸骨旁长轴测定心脏二维m型超声；
34.s2采用无创性经胸高分辨率小鼠心脏超声影像系统检测小鼠心脏结构和功能，探头频率为30mhz；
35.s3检测指标包括：左心室舒张末期前壁厚度、左心室收缩末期前壁厚度、左心室舒张末期后壁厚度、左心室收缩末期后壁厚度、左心室舒张早期二尖瓣血流峰值速度与舒张末期二尖瓣血流峰值速度比值等。
36.由图2看出，使用血管紧张素ⅱ造模以后，血管紧张素ⅱ组小鼠的收缩期心脏前壁、后壁厚度，舒张期心脏前壁、后壁厚度等反映心肌肥厚的指标较对照组明显增加，而血管紧张素ⅱ复合山海棠素组小鼠的收缩期心脏前壁、后壁厚度，舒张期心脏前壁、后壁厚度等指标较血管紧张素ⅱ组明显降低。
37.由图3看出，使用血管紧张素ⅱ造模后，舒张期早期二尖瓣血流峰值速度/ 舒张期末期二尖瓣血流峰值速度(e/a比值)较对照组明显降低，血管紧张素ⅱ复合山海棠素组小鼠的e/a比值较血管紧张素ⅱ组升高。
38.实施例3、小鼠心脏组织实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)
39.心肌组织rna的提取：s1灭菌后刀片切取心脏5mg左右，液氮中预冷5min，高硼硅玻璃研磨器中研磨至无肉眼可见组织块，加入1mltrizol试剂，室温下静置5min后将液体转移至1.5mlep管中后加入200ul三氯甲烷,剧烈震荡25s，室温放置3min。
40.s2离心机提前预冷，在4℃环境中，以12000rpm的速度离心15min，此时可见ep管内液体分3层，吸取上层无色液体，转移至新ep管中，加入等体积的异丙醇并震荡混匀。
41.s3在4℃环境中，以12000rpm的速度离心15min，离心结束后ep管底部可见rna沉淀，去掉上层清液，再加入100％酒精1ml，洗涤后再次以7500rpm的速度离心5min。
42.s4rna洗涤结束后，吸走ep管内水分，并根据rna的量加入20μl depc水重新溶解rna，rna浓度检测仪进行rna浓度及纯度的检测，od260/280的比值应控制在在1.8-2.0区间。
43.反转录(rt)反应：反应体系(20ul)：5
×
mix 4μl、总rna 1000ng、rnasefree dh2o补足体积至20ul，加样后在掌上离心机中离心1min，离心结束后于逆转录仪上进行逆转录反应，反应程序为37℃15min—85℃5s—4℃至结束，逆转录完毕后的cdna保存于-80℃备用。
44.实时荧光定量聚合酶链(rt-pcr)反应：反应体系(10ul)：sybr 5μl、前引物0.4μl、后引物0.4μl、dna 1μl、rnase free dh2o 3.2μl，加完样后，封口膜密封pcr测试板，将加好样品的pcr测试板置于4度离心3000rpm 的速度离心5min，并防止震荡，进行q-pcr反应。
45.由图4看出，使用血管紧张素ⅱ造模后，小鼠心脏中心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量较对照组明显增加，血管紧张素ⅱ复合山海棠素
组的小鼠心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量较血管紧张素ii组减少。
46.实施例4、乳鼠细胞免疫荧光染色
47.在24孔板中预先放入无菌玻片，将乳鼠心肌细胞于24孔板中培养，干预 48小时。pbs轻柔清洗3次，每次3min，予4％多聚甲醛固定细胞15min，pbs 清洗3次，每次5分钟，0.2％triton破膜20min，pbs清洗3次，每次5分钟 3％bsa室温下固定1小时，pbs清洗3次，每次5分钟，选取肌钙蛋白一抗溶液于4℃孵育过夜，pbs清洗3次，每次5分钟。相对应的二抗溶液于37℃孵育 1小时。pbs清洗3次，每次5分钟。dapi染核10min，pbs清洗。荧光显微镜观察、拍照。
48.由图5看出，相比对照组，血管紧张素ⅱ组心肌细胞体积明显增大，血管紧张素ⅱ复合山海棠素组的心肌细胞体积较血管紧张素ⅱ组明显缩小。
49.实施例5、小鼠心肌细胞实时荧光定量聚合酶链反应(q-pcr)
50.心肌细胞rna的提取：s1细胞干预结束后，用pbs洗涤细胞一次，每孔加入1mltrizol试剂，室温静置约5分钟，轻轻吹打混匀，将混匀液置入1.5ml 无酶ep管中。
51.s2每个ep管中加入0.2ml三氯甲烷，剧烈震荡20s，冰浴10min，等待冰浴结束后，移至4度离心机内，12000rpm，离心15min，此时可见ep管内液体分三层。
52.s3用移液枪将上层无色水相转移至1.5ml ep管，按1：1的体积比例加入异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min,再次在4度离心机内以12000rpm离心 10min，离心结束后，去除上层清液，加入1ml100％乙醇震荡、洗涤，短时间内置于冰上充分干燥，加depc水20ul水溶解，混匀，存于-80度保存备用。
53.s4采用rna浓度测定仪检测rna浓度和纯度，rna浓度检测仪进行rna浓度及纯度的检测，od260/280的比值应控制在在1.8-2.0区间。
54.反转录(rt)反应：反应体系(20ul)：5
×
mix 4μl、总rna 1000ng、rnasefree dh2o补足体积至20ul，加样后在掌上离心机中离心1min，离心结束后于逆转录仪上进行逆转录反应，反应程序为37℃15min—85℃5s—4℃至结束。逆转录完毕后的cdna保存于-80℃备用。
55.实时荧光定量聚合酶链(rt-pcr)反应：反应体系(10ul)：sybr 5μl、前引物0.4μl、后引物0.4μl、dna 1μl、rnase free dh2o 3.2μl，加完样后，封口膜密封pcr测试板，将加好样品的pcr测试板置于4度离心3000rpm 的速度离心5min，并防止震荡，并进行q-pcr反应。
56.由图6看出，血管紧张素ii组的心肌细胞中心房利钠肽(anp)、脑钠肽 (bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量较对照组明显增加,血管紧张素 ii复合山海棠素组的心肌细胞中心房利钠肽(anp)、脑钠肽(bnp)、β-肌球蛋白重链(β-mhc)mrna含量较血管紧张素ii组明显减低。
57.综上，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明实施的范围，凡依本发明权利要求范围的形状、构造、特征及精神所为的均等变化与修饰，均应包括于本发明的权利要求范围内。