一种用于浮游植物定量分析样本永久装片的制备方法

1.本发明属于浮游植物鉴定检验技术领域，尤其涉及一种用于浮游植物定量分析样本永久装片的制备方法。


背景技术：

2.浮游植物通过光合作用固定太阳能，合成其他生物所需要的有机物，浮游植物的这个生产过程是水生态系统运转的能源提供者，是整个生态系统的基础，是食物链的第一环节，是浮游动物和其他水生动物直接和间接的饵料。水体生物生产力以及鱼产力的大小往往决定于浮游植物初级生产力的高低，另外，浮游植物由于个体较小，对环境的变化反应迅速，并且很多种类对环境具有一定的偏好，因此常常作为指示种，用来评价水体营养状态和水环境质量。
3.在养殖水体中，浮游植物能够为养殖生物提供溶氧，吸收水体中氨氮、亚硝酸盐等有害物质，起到净化养殖水质的作用。因此，对浮游植物的调查和研究是进行渔业资源调查和淡(海)水环境质量和健康评价以及水产养殖中具有较大的指导意义。对浮游植物的定量研究、确定浮游植物的丰度和生物量是对水体环境调查的一个最基本的也是一个必测指标。
4.现有的浮游植物的定量研究方法也比较成熟，主要采取以下方法：
5.1)采集较大体积的水样(一般为0.5-2l)，用鲁哥试剂进行固定，沉淀24-48小时后，采用虹吸法移出上清液，最后浓缩至30-50ml,然后吸取0.1ml水样进行固定制片，用特制的浮游植物计数框在显微镜下通过行格法或者视野法进行计数。
6.2)采集体积100ml以内的水样经固定后，取一定量，稍作沉淀后在倒置显微镜下观察。
7.以上两种方法虽然操作并不难，但主要存在以下缺陷：
8.1)对于第一种方法，在一些贫营养水体、一些河流和水库以及海洋环境中，浮游植物的丰度特别低，这时候需要采集2l以上的水样进行高度的浓缩才可能在显微镜下观察到足够多个体。水样的采样量越大，用的固定剂(鲁哥试剂和福尔马林，分别加入水样体积的1％和4％)越多，产生的污染也越多，并且尤其当需要采集较多采样点的时候，水样的体积大，且不方便运输和携带，拿回实验室还需要较多的场地来进行处理和浓缩，增加样品的采集和处理难度，在处理水样的过程中，固定后的浮游植物定量样品需要经充分沉淀(一般应超过48小时)，当利用虹吸管慢慢吸去上清液时，虹吸时管口要始终低于水面，流速、流量不能太大，在沉淀和虹吸过程不可摇动，如搅动了底部应重新沉淀。在吸至澄清液的1/3时，应逐渐减缓流速(或转移到500ml样品瓶中，再静置48小时)，最后浓缩为包含沉淀物的水样20
–
25ml(或30
–
40ml)，放入30(或50)ml的定量样品瓶中，最后，用吸出的少量上清液冲洗沉淀器2
–
3次，一并倒入样品瓶中，定容到30(或50)ml。如样品的水量超过30(或50)ml，可静置24小时后再吸去多余水量(上清液)。
9.除存在上述问题以外，最后浓缩的水样因为含有福尔马林和鲁哥试剂，使浮游植
物观察者暴露在福尔马林环境中，对身体存在一定伤害。一方面因为这两种固定剂容易挥发，且样品的体积也比较大。另一方面样品基本无法长久保存，一般样品在计数完后就丢弃了，给日后对样品的追溯和检查造成极大的困难，特制的浮游植物计数框价格昂贵，且一旦被做成装片后不能重复使用，浪费极大，在操作过程中是取0.1ml水样于0.1ml的浮游植物计数框内，在操作过程中容易造成误差。
10.2)对于第二种方法，倒置显微镜价格昂贵，而且在观察时也需要等待样品沉淀。同样，也存在对观察者身体不利、样品也很难长期保存等弊端。
11.针对现有技术中水样采样量大、样品不易保存、处理环节多、使观察者处于不安全环境暴露中、成本高，这对于通过浮游植物定量分析来开展水体生态研究形成了障碍，通过一种快速有效的手段来进行浮游植物的定量研究、确定浮游植物的丰度和生物量是亟需要解决的问题。


技术实现要素：

12.本发明的目的是为了克服现有浮游植物定量分析采样量大、样品不易保存、处理环节多、使观察者处于不安全环境暴露中、成本高的缺陷，提供一种用于浮游植物定量分析样本永久装片的制备方法。
13.本发明采用以下技术方案：
14.一种用于浮游植物定量分析样本永久装片的制备方法，其步骤是：
15.a、用鲁哥试剂固定采集的水样，摇匀水样，根据浮游植物丰度的高低，使用移液管精确抽取100ml以内的水样，准确记录抽取水样的体积，将水样过滤于有机滤膜上，过滤物被吸附在有机滤膜上；
16.b、在载玻片滴加一定浓度的戊二醛固定液，将有机滤膜上的过滤物朝上并移入至戊二醛固定液中；
17.c、载玻片在加热板上恒温至有机滤膜变为透明，载玻片在通风橱内冷却并自然干燥；
18.d、干燥过的有机滤膜上滴上戊二醛固定液，取盖玻片对样品进行盖片，在通风橱内自然晾干；
19.e、制备好显微镜计数的永久玻片，放置在载玻片盒内以备稍后观察。
20.为了提高浮游植物定量分析的精准度，使用移液管移取水样在5-100ml之间。在移液管移取水样时准确记录所移取水样的体积，方便完成装片观察并对水中浮游植物个数进行计算。本发明中只需将经过鲁哥试剂固定的水样，轻轻的将水样充分摇匀，即可用移液管移取100ml以内的水样并进行后续的处理。进一步地，可以通过根据浮游植物丰度的高低，进行抽取水样，能够提高浮游植物定量分析的精准度。与第一种方法中，需要采集2l以上的水样进行高度的浓缩，同时水样需要经充分沉淀(一般应超过48小时)，在沉淀和虹吸过程不可摇动，搅动了底部应重新沉淀的现有技术相比，本发明取样量少和处理速度快，不需要沉淀水样，不需要通过吸取上层清液进行浓缩样品等操作步骤，减少了处理环节，降低了操作的误差。
21.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述有机滤膜的孔径为1.2μm，直径为25mm。由于水样中添加了鲁哥试剂并含有大量有机物质，无机滤膜容易被试剂或部分有机
物质溶解从而在滤纸表面中引入新的杂质不利于观察，有机滤膜由高分子制成，具有稳定性好、耐有机溶剂、易于保存的优点，适合制作永久玻片，进一步地，为了方便计算水中浮游植物个数，有机滤膜形状应尽量规整便于测量，能够通过计算得出有效过滤水样的有机滤膜的面积，孔径为1.2μm的有机滤膜能充分过滤并吸附尽量多的过滤物，选择直径为25mm的有机滤膜，其外形规整容易获取，方便后续观察并计算有机滤膜的面积。
22.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述戊二醛固定液为50％浓度的戊二醛溶液。纯度在98％以上的戊二醛在室温下可保存数日不变，50％戊二醛水溶液聚合反应不显著，与第一种方法使用的固定剂福尔马林溶液中的主要成分为甲醛的现有技术相比，甲醛具有极快的挥发速度，容易对操作者身体造成伤害，戊二醛常温下挥发性更低，能够减少操作者长时间暴露在不安全环境中，戊二醛对糖原、核蛋白、微管、内质网等膜系统和细胞基质具有较好的固定作用，而福尔马林中的甲醛渗透力强，甲醛对酶的活性保存好，但是对细胞基质的保存不如戊二醛，所以利用戊二醛作为固定液固定的浮游植物可以保存更长的时间，更加适合制作永久玻片，制作的永久玻片没有异味方便操作者观察。
23.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述加热板的温度控制在60-70℃。采用这样的温度进行处理，加热板能够均匀地对载玻片上的有机滤膜进行加热，处理时间在20分钟时，载玻片上的有机滤膜变为透明，此时将载玻片从加热板上移开，能够避免有机滤膜变形皱缩从而影响最终装片的效果。
24.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述载玻片的尺寸为50mmx75mm。与第一种方法使用昂贵的特制浮游植物计数框进行计算或者第二种方法使用倒置显微镜的现有技术相比，采用这种尺寸的载玻片，具有通用性强材料容易获取、加工简单准确、成品率高、成本低的优点，相对于浮游植物计数框不能重复使用，载玻片透光性好，材质稳定，更加适合观察和长时间保存。
25.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述鲁哥试剂的加入量为水样体积的1％-1.5％。鲁哥试剂可以用于细胞染色，使细胞核着色从而更易观察，适合用于保存浮游植物样本。
26.为了提高浮游植物定量分析的精准度和便捷性，所述浮游植物丰度的高低根据水体叶绿素a含量法或根据目测法进行判断。当水体中浮游植物丰度较高，则过滤水的体积较小，反之则过滤较高体积的水样。
27.为了提高浮游植物定量分析的精准度，所述水体叶绿素a含量法为根据水体含有的水体叶绿素a来判断，当叶绿素a含量在5μg/l以下时,过滤水样50-100ml,当叶绿素a含量为5-20μg/l之间时，过滤水样20-50ml,当叶绿素a含量在20μg/l以上时，过滤水样5-20ml。进一步地，叶绿素a的含量可以使用分光光度法检测，也可以使用市面上叶绿素快速检测装置进行测定。
28.为了提高浮游植物定量分析的便捷性，所述目测法为根据水体的浑浊度来判断，水体颜色深，过滤的水样在5-50ml之间，水体透明度高，过滤的水样50-100ml之间。
29.本发明相对于现有技术，有以下优点：
30.本发明取样量少和处理速度快，不需要沉淀水样，不需要通过吸取上层清液进行浓缩样品等操作步骤，减少了处理环节，降低了操作的误差，本发明在观察时基本无味，操作过程中不需要接触到大量的福尔马林溶液，减少了操作者暴露在不安全的环境中，降低
了试剂对身体造成的伤害，本发明使用载玻片装片和观察，具有成本低、易于保存能够重复利用、方便日常追溯观察的优点，本发明操作简单快捷，适合应用到不同的场景进行操作，适用于与环境科学和水产养殖相关的教育、科研以及监测机构进行水体生态研究。
具体实施方式
31.以下实施方式中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
32.1、鲁哥试剂固定水样：称取20g碘化钾溶于200ml含冰醋酸20ml的蒸馏水中，待完全溶解后，加入10g碘，搅拌至碘完全溶解，溶解后贮存于密闭的棕色试剂瓶中避光保存。用采水器采集水样，立即添加鲁哥试剂进行固定，鲁哥试剂用量为水样体积的1％-1.5％；
33.2、移取水样：将经过鲁哥试剂固定的水样，轻轻的将水样充分摇匀，使用移液管移取体积50ml的水样，为了提高精准度，可以根据浮游植物丰度的高低，使用移液管精确移取5-100ml水样，记录移取水样的体积；
34.所述浮游植物丰度的高低根据水体叶绿素含量法或根据目测法进行判断；所述水体叶绿素含量法为根据水体含有的水体叶绿素来判断，当水体叶绿素含量在5μg/l以下时,过滤水样50-100ml,当叶绿素含量为5-20μg/l之间时，过滤水样20-50ml,当叶绿素含量在20μg/l以上时，过滤水样5-20ml；
35.所述目测法为根据水体的浑浊度来判断，如果没有叶绿素的数据，简单的根据水体的浑浊度来判断，颜色越深，过滤的水样越少，透明度越高，过滤的水样越多；
36.3、过滤水样：将水样过滤于孔径为1.2μm，直径为25mm有机滤膜上，过滤完毕后，用镊子小心取出有机滤膜，镊子要避免触碰到有机滤膜中有过滤物的地方，轻轻的将有机滤膜放在吸水滤纸上吸除有机滤膜上多余的水分；
37.4、用戊二醛固定液固定浮游植物：在通风橱中，准备好50mmx75mm洁净的载玻片以及50％浓度的戊二醛固定液，用滴管吸取少量固定液，将滴管垂直于载玻片并将一滴50％戊二醛固定液滴于载玻片正中，用镊子将有机滤膜的一端轻轻放入玻片上的50％戊二醛固定液中，过滤物朝上，并把有机滤膜缓缓移入到50％戊二醛固定液正中，再将三滴醛类固定液以垂直的方式滴加在有机滤膜中央，三滴溶液都应该放在同一个地方，使液体自然在有机滤膜上流动，此时应避免戊二醛溶液流出有机滤膜的边界，一旦流出戊二醛溶液流出到有机滤膜的边界，迅速用滴管吸走有机滤膜边界上多余的固定液。重新添加到有机滤膜上的空白区域，避免滴管在滴加时触碰到有机滤膜；
38.5、干燥：预热加热板至60-70℃恒温，在通风橱内，将经过处理的载玻片放在已经达到恒温的加热板上大致20分钟，直到载玻片上的有机滤膜变为透明，这时，将载玻片及时从加热板上移开，以免进一步的加热使有机滤膜变形皱缩，载玻片在通风橱内冷却至少30分钟，然后待载玻片自然干燥至少12小时；
39.6、加盖玻片固定：待有机滤膜完全干燥后，在有机滤膜上滴上1滴50％戊二醛固定液，在有机滤膜上表面加盖玻片，在盖玻片放下的时候要避免产生气泡，让盖玻片在固定剂上慢慢展开，然后在通风橱内至少一天自然晾干。用于显微镜计数的永久玻片做好后，可以将永久玻片放置在载玻片盒内以备稍后检查。
40.样本观察的计数方法：
41.本装片的技术方法一般采取视野法进行计数。具体方法如下：
42.在显微镜下随机选择50-100个视野，对每个视野中的浮游植物进行分门别类计数。水中浮游植物个数(细胞数)n，可按下式计算：
43.n＝(a/an)*n
44.式中a——有机滤膜的面积(mm2)；
45.an——每个视野的面积(mm2)；
46.n——平均每个视野中浮游植物的个数；
47.水样的浮游藻类细胞密度ρ(cells/ml)，可按下式计算：
48.ρ＝n/v
ml
[0049]vml
——过滤水样的体积；
[0050]
样本观察的计数：
[0051]
假如用移液管精确吸取10ml固定好的水样，做好装片后，置于10
×
40倍的显微镜下观察，共观察50个视野，合计观察到藻类细胞500个，即平均每个视野有10个藻细胞，此时n为10；以有机滤膜的直径为25mm计算，则滤膜面积为490.9mm2,此时a为490.9mm2；测得每个视野的直径为0.6mm，则每个视野的面积为0.283mm2，此时a/an为1735，则该装片在此显微镜下有1735个视野；由于平均每个视野有10个藻细胞，通过计算得出该装片共有17350个藻细胞；由于是用移液管精确吸取10ml固定的水样，即该水样的浮游藻类细胞密度为1735cells/ml，或者1.735
×
106ind./l。
[0052]
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
[0053]
实施例1
[0054]
1、鲁哥试剂固定水样：用采水器采集水样1，立即加入鲁哥试剂对水样1进行固定，鲁哥试剂用量为水样1体积的1.5％；
[0055]
2、移取水样：检测得出水体叶绿素含量为25μg/l，将经过鲁哥试剂固定的水样1，轻轻的将水样充分摇匀，使用移液管移取体积10ml的水样1；
[0056]
3、过滤水样：将水样过滤于孔径为1.2μm，直径为25mm有机滤膜上，过滤完毕后，用镊子小心取出有机滤膜，镊子要避免触碰到有机滤膜中有过滤物的地方，轻轻的将有机滤膜放在吸水滤纸上吸除有机滤膜上多余的水分；
[0057]
4、用戊二醛固定液固定浮游植物：在通风橱中，准备好50mmx75mm洁净的载玻片以及50％浓度的戊二醛固定液，用滴管吸取少量固定液，将滴管垂直于载玻片并将一滴50％戊二醛固定液滴于载玻片正中，用镊子将有机滤膜的一端轻轻放入玻片上的50％戊二醛固定液中，过滤物朝上，并把有机滤膜缓缓移入到50％戊二醛固定液正中，再将三滴醛类固定液以垂直的方式滴加在有机滤膜中央，三滴溶液都应该放在同一个地方，使液体自然在有机滤膜上流动，此时应避免戊二醛溶液有机滤膜的边界，一旦流出戊二醛溶液流出到有机滤膜的边界，迅速用滴管吸走有机滤膜边界上多余的固定液，重新添加到有机滤膜上的空白区域，避免滴管在滴加时触碰到有机滤膜；
[0058]
5、干燥：预热加热板至60℃恒温，在通风橱内，将经过处理的载玻片放在已经达到恒温的加热板上20分钟，直到载玻片上的有机滤膜变为透明，这时，将载玻片及时从加热板上移开，以免进一步的加热使有机滤膜变形皱缩，载玻片在通风橱内冷却30分钟，然后待载玻片自然干燥12小时；
[0059]
6、加盖玻片固定：待有机滤膜完全干燥后，在有机滤膜上滴上1滴50％戊二醛固定液，在有机滤膜上表面加盖玻片，在盖玻片放下的时候要避免产生气泡，让盖玻片在固定剂上慢慢展开，然后在通风橱内一天自然晾干，用于显微镜计数的永久玻片就做好了，可以将永久玻片放置在载玻片盒内以备稍后检查。
[0060]
根据实施例1的步骤制作三块用于浮游植物定量分析样本永久装片，分别为实施例1-1、实施例1-2、实施例1-3。
[0061]
实施例2
[0062]
与实施例1的区别在于：
[0063]
1、鲁哥试剂固定水样：用采水器采集水样2，立即加入鲁哥试剂对水样2进行固定，鲁哥试剂用量为水样2体积的1％；
[0064]
2、移取水样：检测得出水体叶绿素含量为5μg/l，将经过鲁哥试剂固定的水样2，轻轻的将水样充分摇匀，使用移液管移取体积100ml的水样2；
[0065]
根据实施例2的步骤制作三块用于浮游植物定量分析样本永久装片，分别为实施例2-1、实施例2-2、实施例2-3。
[0066]
实施例3
[0067]
与实施例1的区别在于：
[0068]
1、鲁哥试剂固定水样：用采水器采集水样3，立即加入鲁哥试剂对水样3进行固定，鲁哥试剂用量为水样3体积的1.5％；
[0069]
2、移取水样：目测浑浊度较低，将经过鲁哥试剂固定的水样3，轻轻的将水样充分摇匀，使用移液管移取体积100ml的水样3；
[0070]
根据实施例3的步骤制作三块用于浮游植物定量分析样本永久装片，分别为实施例3-1、实施例3-2、实施例3-3。
[0071]
实施例4
[0072]
本实施例是以现有的浮游植物的定量研究方法，通过采集较大体积的水样2l并进行固定，沉淀48小时后，采用虹吸法移出上清液，最后浓缩至30ml,然后吸取0.1ml水样于0.1ml的浮游植物计数框内制片进行观察，分别对水样1、水样2、水样3进行观察，获得实施例4-1、实施例4-2、实施例4-3。
[0073]
实施例5
[0074]
本实施例是以现有的浮游植物的定量研究方法，采集100ml的水样经固定后，取一定量稍作沉淀，分别对水样1、水样2、水样3在倒置显微镜下进行观察，获得实施例5-1、实施例5-2、实施例5-3。
[0075]
表1：实施例1-实施例3的样本观察计数结果的统计
[0076]
[0077][0078][0079]
由上表可知，实施例1测出的浮游藻类细胞密度的平均值为1619cells/ml，实施例2测出的浮游藻类细胞密度的平均值为76cells/ml，实施例3测出的浮游藻类细胞密度的平
均值为62cells/ml，从各实施例的数据得出，每次测量的误差较小，稳定性较好。
[0080]
实施例4与实施例5的样本观察计数结果的统计
[0081][0082]
对于水样1，实施例1测出的浮游藻类细胞密度的平均值为1619cells/ml，与实施例4-1和实施例5-1差别不明显，实施例2测出的浮游藻类细胞密度的平均值为76cells/ml，与实施例4-2和实施例5-2差别不明显，实施例3测出的浮游藻类细胞密度的平均值为62cells/ml，与实施例4-3和实施例5-3差别不明显，因此本发明制作所得的永久装片在检测精度上和现有技术相比差别不明显。
[0083]
本发明取样量少和处理速度快，不需要沉淀水样，不需要通过吸取上层清液进行浓缩样品等操作步骤，减少了处理环节，降低了操作的误差，本发明在观察时基本无味，操作过程中不需要接触到大量的福尔马林溶液，减少了操作者暴露在不安全的环境中，降低了试剂对身体造成的伤害，本发明使用载玻片装片和观察，具有稳定成本低，易于保存能够重复利用，方便日常追溯观察的优点，本发明操作简单快捷，适合应用到不同的场景进行操作，适用于与环境科学和水产养殖相关的教育、科研以及监测机构进行水体生态研究。
[0084]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代组合，均包含在本发明的保护范围内。