缓释富血小板血浆的复合支架材料及其制备方法与应用

1.本发明属于生物材料及生物医学工程技术领域，具体涉及一种缓释富血小板血浆的复合支架材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.prp是通过离心从全血中提取出的富含大量血小板的血浆浓缩物，血小板可被钙离子/凝血酶激活，血小板被激活的同时，血浆中丰富的纤维蛋白原会转化为紧密堆积的聚合纤维蛋白网络，形成prp凝胶。prp可通过活化血小板的脱粒作用分泌多种高浓度的生长因子，这些生长因子可以诱导细胞内特定基因表达，进而促进细胞增殖、细胞外基质形成、血管生成等，作为再生医学的创新工具，prp在促进难愈性损伤组织的修复方面已得到了较为广泛的应用，并表现出很好的促创伤愈合能力。然而prp的产量并不高，加之prp凝胶自身的机械性能较差，且创伤部位的多酶环境往往会导致其快速降解，使得凝胶坍塌流失、生长因子突释、无法稳定存在于创伤部位在创伤修复各个阶段发挥作用，这大大降低了对生长因子的利用效率并限制了其临床应用。因此能够使prp在支架材料中缓释的技术至关重要。
3.专利cn105030826a公开了一种复合型血小板凝胶及其制备方法，该复合型血小板凝胶是由壳聚糖与prp混合液被活化得到，其微观结构为：prp被活化得到的纤维蛋白网状结构连接于壳聚糖分子构成凝胶载体支架，血小板来源的细胞因子粘附、锚着于凝胶载体支架中，形成复合型血小板凝胶，具体的过程是：先将壳聚糖与prp冻融裂解液混合，再加入活化剂静置，将prp中的纤维蛋白原活化成纤维蛋白网状结构。与单一prp相比，该凝胶体系可改善血小板源性生长因子和活性物质突释问题，但其至少存在以下缺点：
4.(1)上述制备过程中，是将凝胶的形成和富血小板血浆活化过程一步完成，也就是说，在凝胶形成的过程中，富血小板也会释放出生长因子，当体系中凝胶还未形成时，一部分生长因子由于没有凝胶支架进行粘附，而流失至凝胶体系之外，使得最终形成的凝胶体系中生长因子的负载量要小于富血小板释放的总量；
5.(2)该专利仅公开可以采用壳聚糖与prp通过上述方法进行结合使用，由于不同材料具有不同的成胶时间、成胶强度等性能，当采用与壳聚糖成胶性能不同的材料时，所形成的凝胶性能也会不同，缓释效果也会有差异，因此上述方法并不一定适合其他材料与prp结合使用，因此不具有普适性。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种缓释富血小板血浆的复合支架材料及其制备方法与应用，先获得具有3d多孔结构的支架载体，再将prp与激活剂加入至支架载体中，prp被激活后，释放的生长因子直接粘附在支架载体中，避免了生长因子的流失，提高了负载量，且prp凝胶与支架载体网络互穿，形成了一种“双网络”复合支架，有利于提高缓释效果；上述方式允许将prp与各种类型的组织工程支架结合，包括水凝胶支架、3d打印支架以及新型材料支架等，支架制备材料的选取也可根据所需针对性选择，因此本发明prp复合
支架有更广泛的应用范围。
7.本发明具体是通过如下技术方案来实现的。
8.本发明的第一个目的是提供一种缓释富血小板血浆的复合支架材料，将prp与其激活剂装载至具有3d多孔结构的支架载体上，使得prp在支架载体的大孔中激活形成凝胶并与支架载体网络互穿，由此形成具有缓释富血小板血浆的复合支架材料。
9.多孔支架的大孔给予prp凝胶壁垒和支撑作用，使用此方式进行prp的负载具有缓释prp的作用，可用于生物支架的体内移植后治疗效果的长期维持，优先解决prp负载后的突释问题。
10.优选的，激活剂包括但不限于ca
2
、凝血酶原。
11.优选的，所述支架载体包括但不限于水凝胶支架材料、3d打印支架材料。
12.更优选的，所述水凝胶支架材料包括但不限于透明质酸、聚赖氨酸、丝素、明胶、海藻酸钠、胶原基材料。
13.优选的，所述水凝胶支架材料的制备方法为：
14.将材料配制成溶液，加入交联剂或在模具中自行交联后，置于-20℃反应24h，之后冷冻干燥，获得具有多孔结构的水凝胶支架材料。
15.本发明的第二个目的是提供所述缓释富血小板血浆的复合支架材料的制备方法，包括以下步骤：
16.s1、制备具有3d多孔结构的支架载体；
17.获取prp；
18.s2、将s1获取的prp与激活剂混合均匀后，在富血小板血浆成胶之前(1min以内)注入s1支架材料中，室温静置即可。
19.优选的，s2中，室温静置至少5min。
20.本发明的第三个目的是提供上述缓释富血小板血浆的复合支架材料在制备慢性创伤修复材料中的应用。
21.本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
22.1、本发明利用ca
2
将血小板激活使其释放生长因子，使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白网络，形成prp凝胶；同时利用支架材料的大孔壁垒作用，使得prp在支架的大孔中形成凝胶并与支架载体网络互穿，达到缓释prp的目的。具体的，本发明首先获得具有3d多孔结构的支架载体，再将prp与激活剂加入至支架载体中，prp被激活后，释放的生长因子直接粘附在支架载体中，避免了生长因子的流失，提高了负载量；且prp凝胶与支架载体网络互穿，形成了一种“双网络”复合支架(“双网络”是指，支架本身和prp凝胶网络两层交联网络)，有利于提高prp缓释效果，延长其在体内的作用时间，减少了血液提取次数，也对于不能反复手术移植病例提供了长期有效的治疗方法，大大减轻患者痛苦；同时prp的加入也赋予了支架材料更强的生物活性，复合支架材料将二者优势充分发挥，实现了一加一大于二的协同效应。
23.2、上述制备方法对prp的激活方式选择机体内天然存在的ca
2
激活法，且不引入其他化学交联剂，既能响应创伤微环境进行缓释，且不会对其生物活性产生任何破坏，允许将prp与各种类型的组织工程支架结合，包括水凝胶支架、3d打印支架以及新型材料支架等，支架制备材料的选取也可根据所需针对性选择，因此本发明prp复合支架有更广泛的应用
范围。
附图说明
24.图1为prp凝胶和prp负载前后支架的表面形貌；
25.图2为prp负载前后释放情况；
26.图3为ii型糖尿病大鼠皮肤创伤修复；
27.图4为ii型糖尿病大鼠治疗后创伤部位炎症、血管生成相关指标表达情况。
具体实施方式
28.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
29.下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
30.支架材料在组织工程领域已有着非常广泛的应用，组织工程支架通常良好的生物相容性，合适的降解性能匹配新组织的再生速度；较高的孔隙率和3d多孔结构，有利于细胞的迁移和血管的浸润，营养物质的输送和代谢废物的排出以及一定的机械强度，能满足体内复杂的力学环境；prp临床治疗的来源通常是自体血液，无免疫原性；prp中的多种生长因子是人体正常状态下的生理比例组合，分别可以于创伤愈合过程中的不同阶段相互联系以发挥更优越的协同作用，是单一重组生长因子难以企及的独特优势；本发明利用3d多孔结构支架中的大孔壁垒作用，将prp与其激活剂装载至复合支架上，使得prp在支架的大孔中激活形成凝胶并与支架载体网络互穿，由此形成具有缓释prp的复合支架，该负载方式充分保证了prp的活性。上述prp的来源包括人和动物，对其制备方法不作限制。
31.下面通过以下实施例对本发明缓释富血小板血浆的复合支架材料进行具体说明。
32.实施例1
33.以透明质酸、聚赖氨酸为原料，先制备透明质酸/聚赖氨酸水凝胶支架，将prp和葡萄糖酸钙溶液注入水凝胶支架中，prp在水凝胶的大孔中被激活形成凝胶并与水凝胶支架载体网络互穿，制得缓释prp的复合支架材料。
34.上述缓释prp的复合支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
35.1)支架材料制备：室温下，配置5％的透明质酸(ha，1.42
×
106da)水溶液并向其中加入螯合剂edc溶解搅拌2h使得羧基充分活化，得到反应液i。配置2％的聚赖氨酸(ε-pll)水溶液并向其中加入辅助螯合剂nhs，后用naoh溶液调节ph至8.0，得到反应液ii。将反应液ii加入到反应液i中搅拌均匀后倒入模具中，室温交联1h上，得到ha/ε-pll水凝胶。成胶后将其放入-20℃反应24h，充分预冻，后转移至冷冻干燥机冷冻干燥24h，获得具有多孔结构的ha/ε-pll水凝胶支架。
36.2)prp悬液的获取：获取新鲜无菌抗凝血，通过二次离心法制备prp：
①
室温下以3500rpm离心15分钟。
②
离心后可观察到血液分为3层，由上自下分别为血浆层、buffy coat层、红细胞层，收集血浆层和buffy coat层以及部分红细胞，放入带有血清分离胶的无菌分离管中，3500rpm离心15分钟，离心后，可见血浆和未激活的prp位于分离胶上部，红细胞位于分离胶下部，弃去下层红细胞，收集分离胶层上的prp。以上所有步骤均在超净工作台内
操作。收集混匀后进行血液分析鉴定以测定血小板含量。用血浆稀释血小板至生理浓度的4倍，即得到未激活的prp悬液。
37.3)将未激活的prp悬液与10％的葡萄糖酸钙溶液以10∶1比例混合均匀后立即注冻干的多孔支架中，使得prp在支架的孔中激活成胶，室温静置5min，即可将prp负载到多孔支架内部，负载前后的表面形貌如图1所示。
38.如图1所示，制备的水凝胶为多孔结构，将prp注射至水凝胶后，prp可与水凝胶复合，释放的活性物质直接可粘附在水凝胶骨架上，避免活性物质的流失，提高负载量，且有助于活性物质的缓慢释放。
39.实施例2
40.以蚕丝为原料，制备丝素多孔支架，将prp和葡萄糖酸钙溶液注入支架中，prp在支架的大孔中被激活形成凝胶并与支架载体网络互穿，制得缓释prp的复合支架材料。
41.上述缓释prp的复合支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
42.1)支架材料制备：称取蚕丝溶于9.3m的溴化锂溶液中配成配制20％(w/v)的蚕丝溶液，置于水浴锅中60℃加热4h后，采用3500da透析袋透析48h；随后，更换20％g/ml的peg溶液继续透析6-10h得到浓缩丝素蛋白溶液；采用10000rpm，4℃，离心20分钟后除去杂质，并通过称重法确定浓缩丝素蛋白浓度，加入适量蒸馏水使浓度为6％；加0.25％戊二醛后，置于-20℃反应24h，转移至冷冻干燥机冷冻干燥24h，获得具有多孔结构的丝素多孔支架；
43.2)prp悬液的获取：获取新鲜无菌抗凝血，通过二次离心法制备prp：
①
室温下以3500rpm离心15分钟。
②
离心后可观察到血液分为3层，由上自下分别为血浆层、buffy coat层、红细胞层，收集血浆层和buffy coat层以及部分红细胞，放入带有血清分离胶的无菌分离管中，3500rpm离心15分钟，离心后，可见血浆和未激活的prp位于分离胶上部，红细胞位于分离胶下部，弃去下层红细胞，收集分离胶层上的prp。以上所有步骤均在超净工作台内操作。收集混匀后进行血液分析鉴定以测定血小板含量。用血浆稀释血小板至生理浓度的4倍，即得到未激活的prp悬液。
44.3)将未激活的prp悬液与10％的葡萄糖酸钙溶液以10∶1比例混合均匀后立即注冻干的多孔支架中，使得prp在支架的孔中激活成胶，室温静置5min，即可将prp负载到多孔支架内部。
45.实施例3
46.以胶原蛋白为原料，制备支架，将prp和葡萄糖酸钙溶液注入支架中，prp在支架的大孔中被激活形成凝胶并与支架载体网络互穿，制得缓释prp的复合支架材料。
47.上述缓释prp的复合支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
48.1)支架材料制备：2％胶原蛋白和0.135μm氢氧化纳混合液置于-20℃反应24h；
49.2)prp悬液的获取：获取新鲜无菌抗凝血，通过二次离心法制备prp：
①
室温下以3500rpm离心15分钟。
②
离心后可观察到血液分为3层，由上自下分别为血浆层、buffy coat层、红细胞层，收集血浆层和buffy coat层以及部分红细胞，放入带有血清分离胶的无菌分离管中，3500rpm离心15分钟，离心后，可见血浆和未激活的prp位于分离胶上部，红细胞位于分离胶下部，弃去下层红细胞，收集分离胶层上的prp。以上所有步骤均在超净工作台内操作。收集混匀后进行血液分析鉴定以测定血小板含量。用血浆稀释血小板至生理浓度的4倍，即得到未激活的prp悬液。
50.3)将未激活的prp悬液与10％的葡萄糖酸钙溶液以10∶1比例混合均匀后立即注冻干的多孔支架中，使得prp在支架的孔中激活成胶，室温静置5min，即可将prp负载到多孔支架内部。转移至冷冻干燥机冷冻干燥24h，获得具有多孔结构的胶原多孔支架。
51.下面对上述实施例制备的材料进行性能检测。
52.一、总蛋白释放试验
53.分别将支架、prp和实施例1中的prp负载支架、加入到4.0ml模拟体液中置于垂直混悬仪上，37℃条件下检测prp的释放效率，分别于4h、12h、24h、2d、4d、7d取反应液200μl并补充模拟体液200μl。反应结束后，用bca试剂盒检测反应液中总蛋白的浓度。经过支架负载后，能有效实现prp的缓释，如图2所示，由图2可见，prp释放速度较快，而将prp负载在水凝胶支架后，释放速率减慢，说明本发明的策略能降低prp产生的活性物质释放速率，具有缓释效果。
54.二、创面愈合试验
55.为充分还原慢性皮肤创伤的发病条件，对sd大鼠进行高糖高脂喂养8周后进行腹腔注射2mg/ml的链脲佐菌素(stz)，注射剂量为20mg/kg来造模ii型糖尿病大鼠。当血糖≥10mmol/l同时伴有多饮多尿、体重下降即成模。选取成模大鼠采用3％的戊巴比妥钠进行麻醉(静脉注射40mg/kg)，随后采用无菌皮肤环钻在其背部制备8mm
×
8mm的全层皮肤缺损，并移植空支架、prp和实施例1中的prp负载支架。分别在7、14、21天处死动物收集缺损组织，于oct中固定包埋，包埋后的样本进行6μm冷冻切片，切片复水后进行he染色观察细胞的分布，免疫荧光染色观察血小板-内皮细胞粘附分子(cd31)、α平滑肌肌动蛋白(α-sma)、诱导型一氧化氮合酶(inos)、巨噬细胞精氨酸酶(arg-1)等特定蛋白的形成，以此评估再生情况。
56.结果如图3和图4所示，支架负载prp组能更有效的修复皮肤缺损，组织学染色分析显示支架负载prp组能更有效的上皮化过程与胶原蛋白的沉积。免疫荧光染色显示支架负载prp组能够明显的促进血管的生成并缩短伤口炎症期到增殖期的过渡时间，减轻了炎症反应。以上结果证明本发明制备的prp负载支架起到了缓释作用，延长了作用时间，具有更优良的治疗效果。
57.通过上述结果可说明，本发明提供的方法可适合不同组织工程支架材料与prp结合，且制备的复合支架材料具有prp缓释作用，能够有效促进慢性皮肤创伤的愈合。另外，还需要说明的是，本发明采用的先制备具有3d多孔结构的支架载体，再将prp与激活剂加入至支架载体中，相比于在支架载体制备过程中将prp混合进去，本发明还有如下优势：
58.(1)在支架材料制备过程中将prp混合进去，体系中存在的交联剂以及其他物质可能会在搅拌混合的过程中破坏prp的活性，造成prp的损失。而本发明“直接激活”的负载方式，是一种“物理方式”的负载，在激活prp的过程，没有其他化学物质的干扰，不会对其生物活性产生任何破坏。
59.(2)本发明的所采用的负载方式更能够保证prp复合支架制备过程的无菌性。获取支架材料后，可先将支架材料通过酒精、紫外等方式进行灭菌，而后将获取的无菌prp与其激活剂直接注入支架中。而将prp直接与材料混合无法保证材料的无菌性，且为保证prp的活性，将prp加入其中后获得的复合材料不可通过酒精、辐照等方式灭菌。
60.(3)本发明所采用的负载方式更能够保证prp复合支架的“现用现取”。在不用时可以将prp于-80℃保存、灭菌支架密封保存；在需要时，将prp取出，加入适量激活剂，混合注
入支架中即可。prp与支架材料的制备过程“互不干扰”，混合过程又没有“隔阂”，易保存、易获取、临床可行性更高。
61.(4)本发明所采用的负载方式能够有效实现prp的缓释，支架材料的大孔壁垒作用能够使得prp缓慢释放生长因子到伤口部位，有效服务于伤口恢复的各个时期。纯物理方式的负载使得prp凝胶网络本身与支架材料没有化学交联，不仅不会对支架本身性能产生任何不利影响，且大大加强的支架的生物活性，实现了1 1＞2的效果。
62.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。