UPLC-MS/MS法同时测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物浓度的方法

uplc-ms/ms法同时测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物浓度的方法
技术领域
1.本发明涉及一种检测人血浆中药物浓度的方法，具体涉及一种 uplc-ms/ms法同时测定人血浆生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物 lbq657浓度的方法。


背景技术：

2.沙库巴曲/缬沙坦(lcz696，商品名诺欣妥)是一种双重的血管紧张素受体拮抗剂(arb)和脑啡肽酶抑制剂(nepi)，通过降低射血分数不仅有利于治疗心力衰竭，而且可能对高血压也有效。lcz696由沙库巴曲(nepi 的一种非活性前药)和缬沙坦(一种arb)组成，摩尔比为1:1。经口服后，沙库巴曲和缬沙坦迅速被吸收并分解为沙库巴曲和缬沙坦，沙库巴曲迅速转化为lbq657(nepi的活性代谢物)。沙库巴曲和缬沙坦主要通过肾脏途径排泄。沙库巴曲和缬沙坦在射血分数减少的心力衰竭、高血压伴肾功能不全、肾功能损害、血液透析伴心衰的患者中的药代动力学已有报道。然而，沙库巴曲和缬沙坦在经腹膜透析的终末期肾病患者中的药代动力学尚不清楚。
3.为了调查经腹膜透析的终末期肾病患者中缬沙坦、沙库巴曲的药物动力学，需要建立一种快速、敏感、准确uplc-ms/ms方法来检测口服lcz696 后血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657的浓度。
4.uplc-ms/ms提高了分析通量，节省了样品和溶剂分析时间。例如文献 1(cn110031568a)提供了一种uplc-ms/ms测定了人血浆生物样品中的缬沙坦、沙库巴曲、lbq657的方法，使用的内标缬沙坦-d3，内标与待测物只相差3个质量数，但彼此之间的干扰大；流动相的洗脱方法为等度洗脱。但等度洗脱对于色谱柱来说极容易残留生物样品中的物质，极容易造成色谱柱的损坏；此外等度洗脱的峰宽较梯度洗脱宽，灵敏度不如梯度洗脱的高，需要加大进样量，对于质谱的污染大大增加。uplc-ms/ms检测方法若采用梯度洗脱的方法，为了实现良好的重现性，对于流动相的选择要求更高；另外，uplc-ms/ms应用梯度洗脱时极容易残留，并且主要是残留在进样阀，要解决残留问题，就要对流动相性质及其起始比例、洗针液及其洗针程序、进样阀的转动等有更高要求。文献2(raja harandha等发表的文章 development and validation of a reliable and rapid lc-ms/ms method forsimultaneous quantification of sacubitril and valsartan in rat plasma and itsapplication to a pharmacokinetic study.[j]biomedical chromatography,2016) 采用甲酸-乙腈蛋白沉淀法，并采用uplc-ms/ms检测大鼠血浆样品中的沙库巴曲和缬沙坦。该方法虽然采用蛋白沉淀法，但是并未对处理后的样品进行稀释，后续一方面会对色谱柱造成较大破坏，另一方面也会因为样品中的杂质较多对液相系统和质谱造成堵塞。文献3(cn112415114a)虽然给出同时定量检测健康人血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657浓度的方法，但其中缬沙坦的定量上限(uloq)为16000ng/ml、沙库巴曲的定量上限(uloq) 为4000ng/ml和lbq657的定量上限(uloq)为8000ng/ml。文献4 (cn112415114a)采用hplc-ms/ms法测定心衰患者中经血液透析后血浆和超滤液中缬沙坦和lbq657的浓度，两个分析物的
血浆uloq均为7500 ng/ml；文献5([j].中国临床药理学与治疗学,2010,15(07):809-813)快速灵敏的lc-ms/ms法测定人血浆中缬沙坦浓度，虽然采用的进样量有所减少，但线性范围大大减小，缬沙坦的定量上限仅为3100ng/ml。
[0005]
慢性肾衰终末期病人的三个化合物的线性范围难以预测，且三个化合物的线性范围差异大，这对于同时测定三个化合物的难度进一步加大。
[0006]
文献6([j].华西药学杂志,2014,29(03):295-297.doi:10.13375/j.cnki. wcjps.2014.03.021)lc-ms/ms法测定人血浆中的缬沙坦及其人体生物等效性，采取的血浆样品量为0.5ml，但还会造成仪器中较多样品残留，减少仪器使用寿命；以及文献7([j].中国药房,2016,27(05):619-621)lc-ms/ms法测定人血浆及尿液中缬沙坦的浓度及其药动学研究，采用的处理方式过于复杂，步骤过多容易出错。
[0007]
因此，目前已有的检测人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657浓度的方法并不适用于慢性肾衰患者临床药代动力学研究的样本检测。本领域急需能够用于检测慢性肾病终末期患者血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657的浓度的快速灵敏的方法，同时还需解决残留问题。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种uplc-ms/ms法同时测定人血浆生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物lbq657浓度的方法，解决了不能快速灵敏地同时检测慢性肾病终末期患者血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657浓度的问题。本发明应用了梯度洗脱的方式，并解决了化合物的残留，而且进样量比较少大大降低对仪器的污染。
[0009]
为了达到上述目的，本发明提供了一种uplc-ms/ms法同时测定人血浆生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物lbq657浓度的方法，该方法针对的是慢性肾病终末期患者血浆样品；该方法包含：采用乙腈蛋白沉淀法对样品进行前处理，样品前处理后采用等体积的稀释剂进行稀释，其中所述稀释剂为50％乙腈-0.1％甲酸水(体积百分数)；采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测：温度：40℃，流动相：a相0.1％甲酸水溶液，b 相是体积比为50:50:0.2的甲醇-乙腈-甲酸，洗脱方式：梯度洗脱。
[0010]
其中洗脱梯度洗脱条件：
[0011]
0min时，流动相流速为0.3ml/min，流动相中的b相含量65％；
[0012]
1.50min时，流动相流速为0.3ml/min，流动相中的b相含量80％；
[0013]
2.00min时，流动相流速为0.3ml/min，流动相中的b相含量98％；
[0014]
2.60min时，流动相流速为0.3ml/min，冲洗自动进样器高压阀；
[0015]
2.61～3.00min时，流动相流速为0.6ml/min，流动相中的b相含量98％；
[0016]
3.01min时，流动相流速为0.6ml/min，流动相中的b相含量65％；
[0017]
3.51min时，流动相流速为0.3ml/min，流动相中的b相含量65％；
[0018]
4.00min时，流动相流速为0.3ml/min，停止进样。
[0019]
所述的流动相b相的含量是体积百分数；a相的含量为1-b相含量。在反相色谱柱起始梯度设置成65％的b相，是让目标化合物有保留；0-1.5min 流动相b相梯度的上升是将目标化合物缬沙坦、沙库巴曲和lbq657洗脱出来；1.50-3min 98％的b相是将色谱柱脂溶性的杂质洗脱出来，3.01-4min的 b相恢复成起始梯度65％，是为了平衡色谱柱。
[0020]
所述的超高效液相色谱串联质谱中，高效液相色谱仪是岛津lc-30ad 超高效液相色谱，串联质谱仪是日本岛津公司8060型串联质谱仪。
[0021]
优选地，所述的高效液相色谱仪，色谱柱：acquityuplc beh c
18
，规格为2.1mm
×
50mm，1.7μm。
[0022]
优选地，所述的高效液相色谱仪，配有自动进样器，该自动进样器为 sil-30ac ht自动进样器。
[0023]
优选地，所述的所述串联质谱仪，配有turbo ionspray离子源以及 labsolutions 6.70数据处理系统。
[0024]
优选地，所述的所述串联质谱仪，辅助数据处理软件为microsoft office。
[0025]
优选地，所述的自动进样器温度设为15℃。
[0026]
优选地，所述的超高效液相色谱串联质谱的进样溶剂含有机相比例超过了75％。该进样溶剂中含有的机相比例指的是样品沉淀离心后取上清与稀释剂等比例混匀之后的有机相体积百分含量，样品沉淀离心后上清液的有机相含量几乎是100％。在反相高效液相色谱的使用过程中，如果采用梯度洗脱，则进样溶剂有机相的比例要求高于流动相有机相的初始比例，不然会有严重的溶剂效应，导致色谱峰变形。
[0027]
所述的超高效液相色谱串联质谱，在洗针时，洗针程序为：洗针液r0及外置泵r3连通的溶液均为甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸(25:25:25:25:1,v/v)，洗针程序为洗针液r0清洗进样针的外壁，进样前后各润洗3s，洗针速度35 μl/s，洗针体积500μl，外置泵r3的程序为清洗泵-》清洗进样口，用于进一步在进样前后清洗进样针的外壁。所述的清洗泵-》清洗进样口的具体操作就是在液相采集方法中自动进样器洗针程序中增设外置泵r3用来在进样前后清洗进样针的外壁。
[0028]
所述的超高效液相色谱串联质谱的分析中所用内标为待分析物的氘代衍生物，选用缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和lbq657-d4。
[0029]
所述的超高效液相色谱串联质谱的进样量为0.5μl。所述的进样量是血浆样本已经经过蛋白沉淀并进行稀释处理后进样到液质联用仪器分析所用的量。
[0030]
本发明提供了一种所述的uplc-ms/ms法同时测定人血浆生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物lbq657浓度的方法在缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物lbq657临床药代动力学研究中的用途。
[0031]
本发明的一种uplc-ms/ms法同时测定人血浆生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物lbq657浓度的方法，解决了不能快速灵敏地同时检测慢性肾病终末期患者血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657浓度的问题。具有以下优点：
[0032]
1、本发明前处理采用乙腈作为沉淀剂，并进一步稀释进样，采用1：1 稀释比例，进样量仅为0.5μl，大大降低了对仪器的污染。
[0033]
2、本发明与现有文献相比，血浆样本量(前处理过程中每一个样本的血浆用量)为0.05ml，从源头上减少了仪器中样品残留，延长了仪器使用寿命。
[0034]
3、本发明使用内标缬沙坦-d9，可以大大减少缬沙坦与内标之间的干扰。
[0035]
4、传统的血浆检测方法存在明显的缬沙坦残留，本发明采用外置泵洗涤进样针、增加自动进样器高压阀的冲洗与梯度洗脱结合的办法，初始有机相得比例由40％提高到65％。
[0036]
5、本发明所测量的为腹膜透析患者血浆中缬沙坦、沙库巴曲和lbq657 浓度，由于患者具有慢性肾病，导致三个化合物的代谢周期延长，药物的峰值浓度更大，因而具有更大的线性范围。
[0037]
6、本发明应用于终末期肾病患者的血样分析，分析腹膜透析对药物的代谢的影响以及腹膜透析患者肾功能对药物清除的影响，定量上限进一步提高。
附图说明
[0038]
图1为本发明缬沙坦、沙库巴曲和lbq657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲
ꢀ‑
d4和lbq-d4的二级全扫描质谱图一。图中(a)缬沙坦、(b)沙库巴曲、 (c)lbq657。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
[0039]
图2为本发明缬沙坦、沙库巴曲和lbq657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲
ꢀ‑
d4和lbq-d4的二级全扫描质谱图二。图中(d)缬沙坦-d9、(e)沙库巴曲-d4、 (f)lbq657-d4。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
[0040]
图3为本发明uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图一。图中，a：空白血浆；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
[0041]
图4为本发明uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图二。图中，b：加标空白血浆；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
[0042]
图5为本发明uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图三。图中，c：给药血浆样品；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
[0043]
图6为本发明方法验证阶段代表性标准曲线图。图中，a：缬沙坦；b：沙库巴曲；c：lbq657。横坐标：待测物的浓度；纵坐标：待测物与内标的峰面积比。
[0044]
图7为本发明腹膜透析患者服用诺欣妥后的血药浓度图(均值
±
标准差)。图中：a：缬沙坦；b：沙库巴曲；c：lbq657。bid：每天给药两次；qd：每天给药一次。
具体实施方式
[0045]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
本发明以下实验例中使用的实验药品、材料、试剂以及分子结构式：
[0047]
1、药品及试剂名称
[0048][0049][0050]
2、结构式
[0051]
lcz696由沙库巴曲和缬沙坦组成，缬沙坦、沙库巴曲和lbq657以及本发明中使用的内标物质缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和lbq-d4的化学结构式分别为以下式a、式b、式c、式d、式e和式f。
[0052]
[0053][0054]
实验例1工作液的制备
[0055]
1、工作液稀释剂，其制备方法包括：
[0056]
在200ml溶剂瓶中加入50ml甲醇、50ml水，超声混匀后于室温下储存，标记为溶剂d。
[0057]
2、缬沙坦、沙库巴曲和lbq657混合标准曲线系列工作液，其制备方法包括：
[0058]
(1)取缬沙坦(xst)、沙库巴曲(skb)和lbq657(lbq)分别用甲醇、dmso、dmso配制成1.00mg/ml缬沙坦、沙库巴曲和lbq657的储备液，转移至透明聚丙烯管中-40℃冰箱冷冻保存。
[0059]
(2)将步骤(1)中配成的缬沙坦、沙库巴曲和lbq657储备液用50％甲醇(溶剂d)按表1所示稀释成下列浓度的标准系列工作液，并在-40℃条件下储存备用。
[0060][0061]
[0062]
3、缬沙坦、沙库巴曲和lbq657质控工作液，其制备方法与标准系列工作液的过程基本相同，区别在于：
[0063]
在步骤(2)中，将步骤(1)中配成的缬沙坦、沙库巴曲和lbq657储备液用50％甲醇(溶剂d)按表2所示稀释成下列浓度的质控样品工作液，并在
ꢀ‑
40℃条件下储存备用。
[0064][0065]
4、内标工作液，其制备方法包括：
[0066]
(1)精密称取缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和lbq-d4(内标)分别用甲醇、 dmso、dmso溶解配成浓度为1.00mg/ml缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和lbq-d4的储备液。
[0067]
(2)将步骤(1)中配成的缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和lbq657-d4储备液用乙腈按表3所示稀释成下列浓度的内标工作溶液，-40℃冰箱冷冻保存。
[0068][0069]
实验例2血浆样品前处理
[0070]
1、空白血浆样品，其制备方法包括：
[0071]
(1)取空白人血浆(健康人的血浆)50μl，置于1.5ml聚丙烯管中，加入乙腈150μl，室温涡旋2min制得样品。
[0072]
(2)将步骤(1)中制得的样品于室温下在转速为14000rpm下离心5 min，转移50μl上清液至另一干净的聚丙烯管中，用50μl 50％乙腈含0.1％甲酸将上清液稀释，再涡旋1min混匀，得到用于进行uplc-ms/ms分析测定的溶液。
[0073]
2、零点血浆样品，其制备方法与空白血浆样品的过程基本相同，区别在于：
[0074]
在步骤(1)中，取空白人血浆50μl，置于1.5ml离心管中，加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min制得样品。
[0075]
3、标准曲线样品，其制备方法与空白血浆样品的过程基本相同，区别在于：
[0076]
在步骤(1)中，取实验例1制备的10μl标准系列工作液加至190μl 空白人血浆中，分别配制成缬沙坦/沙库巴曲/lbq657浓度为8.00/2.00/30.0、 16.0/4.00/60.0、40.0/10.0/150、100/25.0/375、400/100/1500、1000/250/3750、 4000/1000/15000、8000/2000/30000ng/ml的混合标准血浆样品；混匀后，再分别取该标准血浆样品50μl，加入150μl内标工作液，涡流混合2min制得样品。
[0077]
4、质控血浆样品，其制备方法与空白血浆样品的过程基本相同，区别在于：
[0078]
在步骤(1)中，取实验例1制备的10μl质控工作液加至190μl空白人血浆中，分别配制成缬沙坦/沙库巴曲/lbq657浓度为8.00/2.00/30.0、24.0/6.00/90.0、200/50.0/750、6000/1500/22500ng/ml的混合质控血浆样品，混匀后，再分别取该混合质控血浆样品50μl，加入150μl内标工作液，涡流混合2min制得样品。
[0079]
5、未知血浆样品，其制备方法与空白血浆样品的过程基本相同，区别在于：
[0080]
在步骤(1)中，取慢性肾病终末期患者服用诺欣妥后血浆样品50μl，置于1.5ml离心管中，加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合 2min制得样品。
[0081]
实验例3测试血浆样品的稳定性
[0082]
质控血浆样品的稳定性，其方法包括：
[0083]
(1)取实验例1制备质控样品工作溶液hqc\mqc\lqc三个水平的工作液20μl，置于1.5ml离心管中，加入380μl空白人血浆，涡旋2min制备成缬沙坦、沙库巴曲、lbq657的高、中、低三个浓度的血浆样品，分装成6份，每份50μl。
[0084]
(2)将步骤(1)制备的血浆样品在室温下放置14小时后，加入实验例 1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，考察制备的样品室温放置14小时的稳定性。
[0085]
(3)将步骤(1)制备的血浆样品加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，考察制备的样品室温放置23小时的稳定性。
[0086]
(4)将步骤(1)制备的血浆样品加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，考察制得的样品在自动进样器中放置37小时的稳定性。
[0087]
(5)将步骤(1)制备的血浆样品加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，考察制得的1个样品重复进样6次的稳定性。
[0088]
(6)将步骤(1)制备的血浆样品先冻存在-80℃冰箱12小时后，取出在室温下融化，再储存在-80℃冰箱，如此重复5次后，取出，加入实验例1 制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，考察制得的样品循环冻融5次后的稳定性。
[0089]
(7)将步骤(1)制备的血浆样品分别在-40℃和-80℃冰箱储存86天后，取出在室温下融化，加入实验例1制备的150μl内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白血浆样品的步骤(2)制得样品，分别考察制得的样品在
ꢀ‑
40℃和-80℃储存86天的稳定性。
[0090]
上述稳定性实验的结果见表4。
[0091][0092]
实验例4uplc-ms/ms分析测定
[0093]
1、主要仪器
[0094]
超高效液相色谱-质谱联用仪(uplc-ms/ms)是岛津lc-30ad超高效液相色谱，配有电喷雾离子源以及labsolutions 6.70数据处理系统，液相色谱系统包括sil-30ac ht自动进样器。xpe26电子分析天平(mettler公司)；vx
‑ⅱ
多管涡旋振荡器(天根生化科技(北京)有限公司)；5810r 离心机(德国eppendorf公司)。
[0095]
2、试验条件与结果
[0096]
(1)色谱
[0097]
色谱条件：所用的分析柱为美国waters公司的色谱柱，其规格为1.7μm， 2.1
×
50mmacquityuplc beh c
18
，流动相a为0.1％甲酸水溶液。流动相 b为甲醇-乙腈-甲酸(50:50:0.2，v/v)的混合溶液，柱温40℃，洗脱梯度为 0min(65％b)
→
1.50min(80％b)
→
2.0min(98％b)
→
2.60min(autosamplerinse)
→
3.00min(98％b)
→
3.01min(65％b)
→
3.51min(65％b)
→
4.0min (stop)，流动相流速0.30ml/min～0.6ml/min。
[0098]
如图3所示，uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图一。图中，a：空白血浆；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0099]
如图4所示，uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图二。图中，b：加标空白血浆；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0100]
如图5所示，uplc-ms/ms测定人血浆中缬沙坦、沙库巴曲及lbq657 色谱图三。图中，c：给药血浆样品；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0101]
(2)质谱
[0102]
质谱条件：电喷雾离子化源，正离子方式检测；检测器电压为2.22kv；接口温度为300℃，加热块温度为400℃；碰撞诱导解离cid gas为270kpa；雾化气流：3l/min；加热气流：15l/min；干燥气流：15l/min；扫描方式为多反应监测模式即mrm模式，用于定量分析的离子对分别为：
[0103]
缬沙坦：m/z 436.00
→
m/z 291.10，其ce为-20v；
[0104]
缬沙坦-d9：m/z 445.00
→
m/z 300.20，其ce为-20v；
[0105]
沙库巴曲：m/z 412.25
→
m/z266.15，其ce为-20v；
[0106]
沙库巴曲-d4：m/z 416.25
→
m/z 266.15，其ce为-20v；
[0107]
lbq657：m/z 384.20
→
m/z 266.15，其ce为-30v；
[0108]
lbq-d4：m/z 388.20
→
m/z 266.15，其ce为-30v；每一个通道的扫描时间为30msec。
[0109]
采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测，解决其残留的洗针程序为：洗针液r0及外置泵r3均为甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸，所述的甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸的体积比为25:25:25:25:1；洗针程序为r0清洗进样针的外壁，进样前后各润洗3s，洗针速度35μl/s，洗针体积500μl，外置泵r3的程序为清洗泵-》清洗进样口(rinse pump-》rinse port)，用于进一步清洗进样针的外壁。解决其残留的方法一是在化合物出峰之后，增加自动进样阀的高压阀的冲洗，在2.60min在autosample模块增加冲洗(rinse) 命令，用流动相冲洗高压阀；解决其残留的方法二是在所有化合物出峰后提高色谱柱的流速，流速在2.61～3.01min为0.6ml/min，此时有机相比例为 98％，增加对系统及色谱柱脂溶性物质的洗脱。
[0110]
如图1所示，缬沙坦、沙库巴曲和lbq657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲
ꢀ‑
d4和lbq-d4的二级全扫描质谱图一。图中(a)缬沙坦、(b)沙库巴曲、 (c)lbq657。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
[0111]
如图2所示，缬沙坦、沙库巴曲和lbq657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲
ꢀ‑
d4和lbq-d4的二级全扫描质谱图二。图中(d)缬沙坦-d9、(e)沙库巴曲-d4、 (f)lbq657-d4。横坐标：质荷
比；纵坐标：强度。
[0112]
3、数据处理与分析
[0113]
应用labsolutions 6.70药代动力学软件对所测数据进行分析，并采用辅助数据处理软件microsoft office 2010，获得药物的药代动力学参数见表5。
[0114][0115][0116]
注：浓度以均值
±
标准差表示，n代表计算的样本量。bid：每天给药两次；qd：每天给药一次。
[0117]
4、uplc-ms/ms定量方法学验证
[0118]
(1)标准曲线
[0119]
标准曲线样品为实验例2中的制备的标准曲线样品，以待测物的浓度(即标准曲线样品)为横坐标(x)，待测物与内标的峰面积比为纵坐标，用加权 (w＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得缬沙坦、沙库巴曲、lbq657的直线回归方程，得出标准曲线。
[0120]
如图6所示，方法验证阶段代表性标准曲线图。图中，a：缬沙坦；b：沙库巴曲；c：lbq657。横坐标：待测物的浓度；纵坐标：待测物与内标的峰面积比。结果表明缬沙坦(a)在血浆8～8000ng/ml范围内，沙库巴曲 (b)在血浆2～2000ng/ml，lbq657(c)在血浆30～30000ng/ml范围内线性关系良好。
[0121]
(2)未知血浆样品测定与质量控制
[0122]
对实验例2中制备的未知血浆样品分析，并以当日的标准曲线计算各时间点样品中缬沙坦、沙库巴曲、lbq657的浓度，由质控血浆样品决定当日数据的取舍。要求每个分析批的质控样品的准确度(re)在理论值的
±
15％范围内，可以有1/3的浓度点超限，但同一浓度至少有50％符合标准。
[0123]
5、实际应用
[0124]
40名腹膜透析患者口服诺欣妥后，于不同时间点取血样，采用实验例4 中的方法测定血浆中缬沙坦、沙库巴曲、lbq657浓度，并绘制平均血药浓度-时间曲线，结果显示，同一剂量时药物浓度-时间曲线吻合，不同剂量时药物浓度-时间曲线变化趋势相同，参见图7。
[0125]
本发明采用uplc-ms/ms法同时测定人血浆样品中缬沙坦、沙库巴曲、 lbq657的浓度。血浆样品经处理后，采用esi源，以mrm扫描方式进行定量分析，血浆中的内源性物质不干扰缬沙坦、沙库巴曲、lbq657的测定。本发明方法准确、选择性强，并且符合nmpa颁布的“化学药物临床药代动力学研究技术指导原则”([h]gcl1-2)有关要求，适合缬沙坦、沙库巴曲、 lbq657在人血浆中药物动力学研究。
[0126]
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。