一种用于低氧点亮和外周/中心闭环根除肿瘤的纳米组装体及制备方法和应用

1.本发明属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域，具体涉及一种用于低氧点亮和外周/中心闭环根除肿瘤的纳米组装体及制备方法和应用。


背景技术：

2.尽管多种治疗方式在癌症治疗方面取得了有效的发展，但现有疗法的临床疗效仍低于预期。肿瘤是高度复杂的自我进化系统这一观点已被广泛认可，而大多数实体肿瘤的低氧微环境也导致了临床用药的强大耐药性。某些实体肿瘤的氧含量低于5％，甚至在某些局部下降到近乎0％。为了应对肿瘤低氧所带来的紧迫挑战，人们通过合理设计低氧激活的前药和低氧敏感的药物递送系统来开发应对低氧的特异性治疗方法。但是通过局部杀死位于常氧或低氧区域的肿瘤细胞来实现整个肿瘤根除几乎是不可能的，这也一直是临床癌症治疗亟待解决的难题。同时，感知肿瘤低氧区域对肿瘤的诊断和预后也尤为重要。迫切需要利用新兴的生物医学发现和生物医学纳米技术，开发用于全肿瘤根除和实时定位的综合抗肿瘤纳米药物。
3.近年来，铁死亡作为一种有前景的癌症治疗方向被广泛探索。作为一种有效的诱导剂，索拉非尼(srf)通过阻断胱氨酸/谷氨酸反向转运体系统的上游调控因子，从而减少谷胱甘肽(gsh)的产生，抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)在癌细胞中诱导肿瘤铁死亡。gpx4已经被认为是一种细胞脂质修复酶，可以抵抗肿瘤铁死亡过程中的脂质过氧化。尽管srf在常氧状态下具有强大的抗肿瘤活性，但大量研究表明，在低氧状态下，包括纤维肉瘤、肝细胞癌和恶性间皮瘤，索拉非尼的抗癌效果并不理想。显然，肿瘤低氧严重限制了srf对癌症的治疗效果。我们还发现srf对ct26结肠癌细胞、4t1乳腺癌细胞和b16-f10黑色素瘤细胞在低氧条件下的细胞毒性明显弱于其在常氧条件下，这可能与低氧条件下这些肿瘤细胞中谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,gr)活性的增高以及gsh的上调有关。
4.显然，利用协同疗法来打破铁死亡在低氧环境下的治疗困境，以及实现实时低氧定位是亟不可待的。然而，由于载体和药物之间的亲和力和生物相容性相差较大，利用传统的有机或无机纳米载体高效共载多种药物和(/或)探针仍然具有挑战性。近年来，由小分子共组装形成的无载体纳米药物已成为癌症协同治疗中一个有前景的纳米平台。与传统纳米药物相比，分子共组装纳米制剂具有易制备、重现性好、无载体、无辅料相关毒性、载药量高、给药效率好等优势。由于纳米组装体的形成是由药物之间的分子间相互作用驱动的，因此采用无载体共组装可以实现药物的高度同步传递。开发一种安全有效的纳米联合疗法，实现精确指导常/低氧肿瘤协同治疗、实时精确定位和破坏根植于低氧微环境中的肿瘤细胞是根除肿瘤的关键，也是当前亟待研究的重要课题。


技术实现要素：

5.基于现有技术存在的问题，本发明为了进一步解决索拉非尼在低氧条件下疗效
差，及单一疗法难以实现外周/中心肿瘤细胞闭环根除等问题。在此，我们设计了索拉非尼和低氧特异性开启荧光的花菁探针(cno)的二元杂化纳米组装体，以促进低氧照明和外周/中心闭环肿瘤根除。在常氧区域，索拉非尼可以在酸性肿瘤微环境中被释放出来，杀死肿瘤细胞。有趣的是，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)存在的情况下，硝基还原酶还原cno后，在低氧微环境中的肿瘤细胞可以精准消除。不仅如此，在开启荧光照明的过程中，cno对nadph的快速耗尽有助于阻断gr催化氧化型谷胱甘肽(gssg)向还原型谷胱甘肽(gsh)的转化。同时，cno从疏水性向亲水性的转变加速了低氧微环境中索拉非尼的释放。因此，cno和索拉非尼通过协同阻断低氧肿瘤细胞中gsh-gpx4抗氧化轴，有效诱导肿瘤铁死亡，实现外周/中心闭环肿瘤根除，而不会对正常组织造成叠加毒性。我们的研究为精确引导、高效、低毒的联合肿瘤治疗提供了一种新的联合给药模式。
6.本发明通过以下技术方案实现上述目的：
7.本发明提供了一种用于低氧照明和外周/中心闭环肿瘤根除的二元杂化纳米组装体，所述纳米组装体由索拉非尼和花菁探针通过分子间作用力共组装而成，并修饰以peg修饰剂，所述索拉非尼和花菁探针的摩尔比为4:1～1:3，优选为2:1；索拉非尼和花菁探针之和与peg修饰剂的质量比为60:40～80:20，优选为70:30。
8.进一步地，所述分子间作用力包括疏水力、π-π堆积、静电相互作用和氢键相互作用。
9.进一步地，所述peg修饰包括dspe-peg及其衍生物。peg的分子量为200-20000。
10.进一步地，所述低氧为氧气浓度0vol％～5vol％。
11.本发明还提供了一种用于低氧点亮和外周/中心闭环根除肿瘤的纳米组装体的制备方法，包括如下步骤：
12.将索拉非尼和花菁探针分别溶解到有机溶剂中，搅拌下混匀，将混匀后的溶液缓慢滴加到水中，自发形成均匀的共组装纳米粒，将peg修饰剂的有机溶剂在搅拌下滴加至共组装纳米粒中；除去有机溶剂，即得。
13.进一步地，所述的有机溶剂包括无水乙醇、甲醇或四氢呋喃中的至少一种。
14.进一步地，除去有机溶剂的方法包括在水浴下利用旋转蒸发仪除有机溶剂。当有机溶剂为无水乙醇时，水浴的温度为35-37℃。
15.本发明还提供了上述方法制备的索拉非尼和花菁探针共组装形成的二元杂化纳米组装体。
16.本发明还提供了索拉非尼和花菁探针共组装形成的二元杂化纳米组装体在制备药物递送系统中的应用。
17.本发明还提供了索拉非尼和花菁探针共组装形成的二元杂化纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
18.本发明还提供了索拉非尼和花菁探针共组装形成的二元杂化纳米组装体在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用系统中的应用。
19.本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
20.1.本发明制备srf和cno共组装形成的二元杂化纳米组装体，可用于低氧照明和外周/中心闭环肿瘤根除，索拉非尼通过减少谷胱甘肽(gsh)的生成诱导肿瘤铁死亡，cno通过对nadph的快速耗竭阻断gr催化氧化谷胱甘肽(gssg)向还原性谷胱甘肽(gsh)的转化并加
速低氧环境中srf的释放。
21.2.本发明的srf和cno共组装形成的二元杂化纳米组装体实现了载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为铁死亡治疗中srf与其他药物协同联用的组装提供了一个新策略，为开发无载体的杂化纳米组装体以及化疗-铁死亡联合治疗提供了一个有效的纳米平台。
附图说明
22.图1为本发明实施例1的(srf:cno＝2:1)比例下的sc纳米粒的马尔文粒径分布图。
23.图2为本发明实施例1的sc纳米粒的透射电镜图。
24.图3为本发明实施例2的sc纳米粒的胶体稳定性图。
25.图4为本发明实施例3的sc纳米粒的紫外吸收光谱图。
26.图5为本发明实施例3的sc纳米粒的分子作用力破坏图。
27.图6为本发明实施例4的sc纳米粒在常氧和低氧条件下4t1细胞cno和sc纳米粒的荧光点亮情况。
28.图7为本发明实施例4的sc纳米粒在含20mm na2s2o4的释放介质中，srf的累积释放量和cno的点亮值。
29.图8为本发明实施例5的协同细胞毒性考察的4t1细胞中不同配方在常氧和低氧条件下的细胞活力。
30.图9为本发明实施例5的协同细胞毒性考察的ct26细胞中不同配方在常氧和低氧条件下的细胞活力。
31.图10为本发明实施例5的协同细胞毒性考察的3t3细胞中不同配方在常氧条件下的细胞活力。
32.图11为本发明实施例6的细胞毒性机制探究的在常氧条件下，不同配方的4t1细胞在fer-1存在下的细胞活力。
33.图12为本发明实施例6的细胞毒性机制探究的在低氧条件下，不同配方的4t1细胞在fer-1存在下的细胞活力。
34.图13为本发明实施例7的sc纳米粒的脂质过氧化水平的共聚焦显微镜下的照片。
35.图14为本发明实施例8的sc纳米粒的gsh含量。
36.图15为本发明实施例8的sc纳米粒的细胞内nadp

/nadph比值。
37.图16为本发明实施例8的sc纳米粒的ros强度。
38.图17为本发明实施例9的sc纳米粒的gr和gpx4胞内表达。
39.图18为本发明实施例9的srf与cno联合作用增强铁死亡的机理。
40.图19为本发明实施例9的死/活染色处理后的mcts z-stack图。
41.图20为本发明实施例10的sc纳米粒的血药浓度-时间曲线图。
42.图21为本发明实施例11的cno和cy7分布的荧光图像和主要脏器的离体图像。
43.图22为本发明实施例11的注射2h或12h后主要器官cy7 cno的定量。
44.图23为本发明实施例11的注射12h后cy7-dp@sc nps在各器官的分布。
45.图24为本发明实施例11的4t1荷瘤小鼠cno和sc纳米粒荧光显像及主要脏器离体显像。
46.图25为本发明实施例11的sc纳米粒和cno注射后体内荧光强度的定量。
47.图26为本发明实施例11的sc纳米粒在注射12h后对不同器官的点亮作用。
48.图27为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠肿瘤生长曲线图。
49.图28为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠肿瘤图像。
50.图29为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠荷瘤率统计图。
51.图30为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤hif-1a染色图。
52.图31为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤内nadp

/nadph比率图。
53.图32为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤gsh含量图。
54.图33为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤内ros强度。
55.图34为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤gr和gpx4表达情况。
56.图35为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的4t1乳腺癌模型小鼠离体肿瘤h&e染色图。
57.图36为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠肿瘤生长曲线图。
58.图37为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠肿瘤图像。
59.图38为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠血常规检查。
60.图39为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠末次治疗后脾脏图。
61.图40为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠末次治疗ntr处理后外周及中心区免疫组化染色及h-score分析。
62.图41为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠末次治疗gr酶处理后外周及中心区免疫组化染色及h-score分析。
63.图42为本发明实施例12在体抗肿瘤实验的ct26结肠癌模型小鼠离体肿瘤h&e染色图。
具体实施方式
64.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
65.实施例1：sc纳米粒的制备
66.将不同摩尔比的srf和cno溶解到无水乙醇中，得5mg/ml(总浓度)含药溶液。搅拌下，将该溶液200μl缓缓滴加到1ml去离子水中，srf和cno自发形成均匀的纳米粒，然后采用旋转蒸发法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
67.检测所制备的纳米制剂的粒径、粒径分布结果见表1-2。
68.表1.纳米粒的粒径、粒径分布(4:1-2:1)
[0069][0070]
表2.纳米粒的粒径、粒径分布(1:1-1:3)
[0071][0072]
如表1-2所示，纳米粒的粒径都在100-450nm之间。其中srf:cno＝2:1和1:1时，纳米粒的粒径较小且分布较均匀。
[0073]
(1)非peg化的sc纳米粒的制备方法：将不同摩尔比的srf和cno溶解到无水乙醇中，得5mg/ml(总浓度)含药溶液。1000rpm搅拌下，将该溶液200μl缓缓滴加到1ml去离子水中，srf和cno自发形成均匀的纳米粒，然后采用旋转蒸发法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。
[0074]
(2)dspe-peg
2k
修饰的sc纳米粒的制备方法：分别将不同摩尔比的srf、cno和30wt％的dspe-peg
2k
溶解到无水乙醇中；在搅拌下，先srf和cno的混合溶液缓缓滴加到1ml去离子水中，再将dspe-peg
2k
的无水乙醇溶液在搅拌下滴加至上述溶液中，得到均匀sc纳米粒。然后经过旋转蒸发法除去纳米制剂中的有机溶剂，得到不含任何有机溶剂的纳米胶体溶液。结果证明，srf和cno的摩尔比为4:1～1:4时表现出良好的聚乙二醇化纳米组装性能；srf/cno为2:1时，sc纳米粒表现出均匀的球形形貌，粒径为113.24
±
4.25nm。通过动态光散射法检测所制备的纳米粒的粒径、粒径分布(表3和图1)。sc纳米粒的粒径和pdi较好，未peg化的纳米粒，zeta电位为-5mv左右，载药量约为100％；peg化的纳米粒，zeta电位为-16mv左右，载药量高达70％(表4)。通过透射电子显微镜测定实施例1中制备的sc纳米粒的粒径和形态，结果如图2，透射电镜图表明纳米粒为均一的球形。后文均采用srf：cno摩尔比为2:1条件下制备的sc纳米粒。
[0075]
注：后文sc纳米粒均指代采用peg修饰的sc纳米粒，非peg的sc纳米粒均指代未采用peg修饰的sc纳粒。
[0076]
表3.用30wt％dspe-peg
2k
制备的sc纳米粒的粒径、粒径分布(4:1-1:3)
[0077]
srf:cno摩尔比粒径(nm)粒径分布(pdi)4:1199.39
±
9.480.319
±
0.2733:1130.02
±
6.450.178
±
0.0582:1113.24
±
4.250.057
±
0.0311:1156.47
±
10.820.219
±
0.1961:2214.93
±
17.480.267
±
0.1431:3355.14
±
26.230.492
±
0.1011:4774.06
±
82.690.808
±
0.231
[0078]
表4.sc纳米粒的粒径、粒径分布及zeta电位
[0079][0080][0081]
实施例2：sc纳米粒的胶体稳定性试验
[0082]
将实施例1中制备的sc纳米粒(0.5mg/ml)各取出1ml，加入到10ml含有10％fbs的pbs(ph 7.4)中，在37℃的摇床中下孵育12小时，并且在预定的时间点(0，1，2，4，8和12小时)通过动态光散射法测定其粒径变化。结果如图3所示，sc纳米粒在含有10％fbs的pbs中胶体稳定性较好。
[0083]
实施例3：srf和cno组装机理分析
[0084]
通过紫外光谱扫描实验，初步研究纳米组装体的组装机理。使用酶标仪测定srf溶液剂、cno溶液剂、sc纳米粒的紫外吸收光谱。此外，为了进一步研究组装过程中可能涉及的力，进行了分子间力破坏实验。sc纳米粒加入不同浓度的氯化钠(0-80mm)、十二烷基硫酸钠(0-80mm)或尿素(0-80mm)的溶液中，37℃摇瓶孵育30分钟，使用malvern zetasizer对sc纳米粒的粒径进行表征。
[0085]
结果表明，sc nps中cno的紫外吸收峰显著向长波方向偏移，表明纳米组装中存在π-π堆叠相互作用(图4)。随后，我们通过分子间力破坏实验继续研究其组装机理。如图5所示，10mm十二烷基硫酸钠孵育后，sc nps的粒径显著增大，而相同浓度下，尿素和氯化钠对纳米粒的影响较小。结果表明，疏水力主导了srf和cno的纳米组装过程。因此，sc纳米粒的组装过程主要由π-π叠加和疏水力驱动。
[0086]
实施例4：纳米粒在低氧条件下的荧光点亮能力
[0087]
将4t1细胞(5
×
104细胞/孔，小鼠乳腺癌细胞)接种到24孔板，在常氧条件(氧气含量20vol％)下培养12小时，然后在低氧(氧气含量1vol％)或常氧条件下再培养12小时。向细胞中加入cno溶液剂和sc纳米粒(包含4μmcno、8μm srf、30wt％dspe-peg
2k
)，在低氧或常氧条件下再孵育6小时。然后，清洗细胞，进行细胞固定，最后用共聚焦显微镜分析细胞内的荧光点亮情况。
[0088]
如图6所示，cno溶液剂和sc纳米粒在低氧4t1细胞中均表现出低氧激活荧光特性，且呈时间依赖性；而在常氧条件下，4t1细胞未检测到荧光信号。这些结果表明，荧光开关变化是由低氧引起的。如图7所示，为sc纳米粒在含20mm na2s2o4的释放介质中，srf的累积释放量和cno的点亮值。在20mm na2s2o4存在的2小时内，低氧激活药物释放和荧光开关呈同步变化趋势。综上所述，sc nps表现出低氧激活药物释放和开启荧光特征，具有作为一种多功能纳米药物用于癌症治疗的潜力。
[0089]
实施例5：纳米粒的协同细胞毒性
[0090]
将4t1细胞(2
×
103细胞/孔)、ct26细胞(2
×
103细胞/孔，小鼠结肠癌细胞)、3t3细胞(2
×
103细胞/孔，小鼠胚胎细胞)接种到96孔板，在常氧条件下培养12h，再在低氧或常氧条件下再培养12h。向细胞中加入不同浓度的srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂(srf与cno按摩尔比2:1的混合溶液剂，后文的sc溶液剂均为该比例)、sc纳米粒，在低氧或常氧条件下再孵育48h。srf的剂量范围为0.2～30μm,cno的剂量范围为0.1～15μm，sc溶液剂为srf溶液剂和cno溶液剂的对应浓度的混合液。然后，加入35μl(5mg/ml)的mtt，在490nm(n＝3)的酶标仪上检测细胞活力。
[0091]
研究了常氧和低氧条件下cno溶液剂、srf溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒对4t1和ct26的细胞毒性。如图8-9所示，低氧条件下srf的细胞毒性被明显抑制。此外，cno溶液剂在低氧条件下的抗肿瘤增殖作用强于其在常氧条件下。这些结果表明，低氧对索拉非尼的抗肿瘤效果有显著抑制效应，而cno在低氧条件下不仅表现出开启的荧光，而且具有较强的细胞毒性。更重要的是，sc溶液剂和sc纳米粒在常氧和低氧条件下都表现出协同效应。此外，srf与cno组合在低氧条件下比常氧条件下表现出更强的协同细胞毒性，这表明其在低氧条件下具有很好的肿瘤根除潜力。
[0092]
二元纳米组装物(sc纳米粒)对nih-3t3细胞的细胞毒性比sc溶液剂和srf溶液剂更低(图10)，这应该归因于在常氧条件下正常细胞中sc纳米粒释放药物缓慢。这些结果表明，sc纳米粒对肿瘤细胞具有协同杀伤作用，对正常细胞具有良好的安全性。从以上数据可以明显看出，尤其是在低氧条件下sc纳米粒对肿瘤细胞具有协同细胞毒性。我们推测srf和cno在常氧和低氧条件下可能存在不同的协同机制。
[0093]
实施例6：纳米粒的诱导细胞死亡的机制
[0094]
将4t1细胞(2
×
103个/孔)在常氧条件下接种到96孔板中12小时，然后在低氧或常氧条件下再培养12h。我们测定了srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂、sc纳米粒(8μm srf、4μm cno、30wt％dspe-peg
2k
)在铁死亡抑制剂fer-1(5μm或10μm)作用下4t1细胞的细胞活力。孵育48小时后，采用mtt法测定细胞活力(n＝3)。
[0095]
结果如图11所示，常氧下srf溶液剂组、sc溶液剂组和sc纳米粒组的细胞活力随fer-1浓度的升高而逐渐升高。相比之下，在常氧和低氧条件下，fer-1对cno溶液剂处理组的细胞活力都影响不大(图12)。值得注意的是，srf的细胞毒性不仅显著降低，而且在低氧条件下细胞毒性几乎不受fer-1的影响。以上结果表明，在常氧和低氧条件下，单一的cno均不能诱导铁死亡，而低氧预处理后能显著抑制srf的铁死亡。更重要的是，srf/cno复合物(sc溶液剂和sc纳米粒)能够协同诱导低氧下的肿瘤细胞铁死亡。
[0096]
实施例7：脂质过氧化水平检测
[0097]
将4t1细胞(4
×
105个/孔)接种到6孔板中培养12小时，然后在低氧或常氧条件下
再培养12小时，检测4t1细胞的脂质过氧化情况。用srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒(8μm srf、4μm cno、30wt％dspe-peg
2k
)处理6小时后，用冷pbs洗涤细胞。然后，细胞悬浮于c11 bodipy 581/591脂质过氧化探针(20μm)中，37℃振荡床孵育30min。
[0098]
分别通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm)成像和流式细胞仪分析检测不同制剂处理4t1细胞的脂质过氧化水平。如图13所示，常氧和低氧条件下sc nps处理组脂质过氧化水平最高，fer-1显著抑制sc nps诱导的脂质过氧化。结果证实了sc nps具有良好的“闭环”杀伤肿瘤作用，在常氧和低氧条件下不仅都表现出协同的细胞毒作用，而且逆转了低氧对铁死亡的抑制作用。
[0099]
实施例8：gsh、nadp

/nadph比值和ros值检测
[0100]
将4t1细胞(4
×
105个/孔)接种到6孔板中，检测gsh含量、nadp

/nadph比值和ros值，培养方法同上。用srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒(8μm srf、4μm cno、30wt％dspe-peg
2k
)处理6小时后，用冷pbs消化细胞。在4℃条件下超声10分钟，再使用离心机1200转速离心3分钟，离心后上层清液加入相同体积沉淀剂，进一步使用3500转离心10分钟。用谷胱甘肽测定试剂盒进行谷胱甘肽定量。
[0101]
同样方法给药处理细胞，用冷pbs洗涤，收集细胞。然后，细胞悬浮于ros探针(dcfh-da,10μm)中，37℃摇床孵育30min。酶标仪检测细胞内荧光强度(e
x
:502nm,em:530nm)。
[0102]
同样方法给药处理细胞，用冷pbs洗涤，收集细胞。然后用200μl冷的nadph提取缓冲液裂解细胞。4℃，12000g离心10min。用nadp

/nadph试剂盒测定nadp

/nadph比值。
[0103]
结果如图14所示，低氧时，由于gr的上调，细胞内gsh水平升高，进而抑制srf诱导的铁死亡。有趣的是，研究发现低氧响应型off-on探针，也就是前文所述的花菁探针(cno)通过消耗nadph下调gr蛋白表达(图15)，导致细胞内gsh水平降低，ros积累增加(图16)。
[0104]
实施例9：gr和gpx4胞内表达及3d肿瘤球的z-stack图像
[0105]
将150mm培养皿中的4t1细胞(5
×
106)在常氧条件下培养12小时，然后在低氧或常氧条件下再培养12小时。此外，用不同的配方，包括srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒(8μm srf、4μm cno、30wt％dspe-peg
2k
)处理细胞6小时。然后，对细胞裂解液(含20ng蛋白)进行标准电泳，在4℃下进行抗体孵育。一抗的稀释比为1:50000(内参蛋白特异性抗体)、1:500(谷胱甘肽过氧化物酶4特异性抗体)和1:500(谷胱甘肽还原酶特异性抗体)。所有样品所孵二抗的稀释比为1:500。通过eclwestern blotting检测试剂显示蛋白条带，并使用bio-rad chemidoc进行监测。
[0106]
为了进一步验证sc纳米粒的协同作用机制，将4t1细胞(1
×
105个细胞)在24孔琼脂糖包被板中培养7天，建立多细胞肿瘤球形模型。然后分别用srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒(8μm srf、4μm cno、30wt％dspe-peg
2k
)处理3d肿瘤球体48h。然后，用pbs洗涤球粒，用calcein-am(4.5μm)染色1小时，再用pi(2μm)染色30分钟。在距离球粒顶部步幅40μm的距离使用clsm(e
x
:488nm,em:515nm和617nm)z-stack成像检测球粒。
[0107]
如图17所示，在常氧和低氧条件下，sc溶液剂和sc纳米粒均显著下调谷胱甘肽过氧化物酶4的表达，进一步证实了srf和cno协同诱导铁死亡的作用。此外，含srf的配方处理后，细胞内谷胱甘肽还原酶显著增加，表明在常氧条件下，srf可以诱导基于铁死亡的氧化应激。综上所述，srf和cno在细胞内的协同作用机制如图18所示，最终导致肿瘤细胞级联放
大铁死亡。在多细胞肿瘤球形模型中进一步验证了sc nps的协同作用。如图19所示，srf能有效杀死外部常氧的肿瘤细胞，而cno更容易诱导内部低氧的细胞死亡。相比之下，srf和cno组合(sc溶液剂和sc纳米粒)能够引起广泛的细胞死亡，实现显著的“中心/外周闭环”肿瘤杀伤效果。
[0108]
实施例10：纳米粒的药代动力学研究
[0109]
雄性sprague-dawley大鼠(180～220g)静脉注射游离cy7和cno混合溶液剂(1.95mg kg-1
cy7,10.38mg kg-1
cno)和cy7-peg
2k-dspe@sc纳米粒(15mg kg-1
srf,10.38mg kg-1
cno,9.56mg kg-1
cy7-peg
2k-dspe(cy7荧光染料-聚乙二醇-磷脂))(n＝3)，分别于0.033、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24h取血于肝素管，离心取上清。加入甲醇沉淀蛋白质并收集药物。最后，用酶标仪测定cy7和cno的总浓度(激发:730nm，发射:790nm)。结果如图20所示，游离cy7的血浆清除率快，半衰期短，药时曲线下面积小。相比之下，cy7-peg
2k-dspe@sc纳米粒的半衰期和auc值分别增加了3.9倍和2.8倍，显著延长了血液循环时间。
[0110]
实施例11：纳米粒的组织分布实验
[0111]
雌性balb/c小鼠在右后肢处皮下注射100μl4t1细胞(5
×
106)的pbs悬液。5天后，当肿瘤体积达到300mm3左右时，分别静脉注射cno溶液剂、sc纳米粒、cy7 cno混合溶液、cy7-dp@sc nps(15mg kg-1
srf、10.38mg kg-1
cno、9.56mg kg-1
cy7-peg
2k-dspe、1.95mg kg-1
cy7)200μl(n＝3)。在预定的时间点(1、2、4、8、12和24h)，小鼠被麻醉，用ivis成像系统成像。此外，在给药2h、12h后，处死小鼠，收集主要器官和肿瘤组织，通过ivis成像进一步分析。
[0112]
如图21所示，给药后游离药物可迅速从体内清除，而纳米粒在24小时内在肿瘤部位的肿瘤积累荧光高于cy7/cno混合溶液剂。生物分布结果与药代动力学结果一致。收集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织，分别在荧光最强时间点2h(cy7/cno混合溶液剂)和12h(cy7-dp@sc纳米粒)进行荧光分析和定量。如图22-23所示，cy7-dp@sc纳米粒不仅蓄积时间和强度明显优于cy7/cno混合溶液剂，而且在肿瘤中的蓄积量(38.27％)也高于在主要器官中的蓄积量。
[0113]
随后我们研究了肿瘤的低氧微环境中的荧光点亮情况。将cno溶液剂和sc纳米粒分别静脉注射到4t1荷瘤balb/c小鼠中。如图24-26所示，与cy7/cno混合溶液剂和cy7-dp@sc纳米粒相比，cno溶液剂和sc纳米粒表现出完全不同的荧光特性。如预期的那样，只有肿瘤(》70％)检测到较强的荧光信号，而其他器官的荧光较弱(图26)。cno和sc纳米粒的肿瘤特异性应归因于低氧条件下荧光的开启变化。这些结果进一步证实了cno在低氧肿瘤中的荧光点亮能力。值得注意的是，sc纳米粒的肿瘤荧光开启趋势与cy7-dp@sc纳米粒的肿瘤积累特征一致(图21和24)。这些结果表明，sc nps不仅具有长血液循环和肿瘤特异性积累的巨大优势，而且可以特异性开启肿瘤低氧部位的荧光，这必将有利于准确定位和治疗低氧肿瘤。
[0114]
实施例12：纳米粒的体内抗肿瘤实验
[0115]
采用异位4t1荷瘤小鼠模型，研究sc纳米粒在体内的协同抗肿瘤作用，模型建立方法与上述相同。当肿瘤体积达到平均约100mm3时，将小鼠随机分为5组(n＝5)。每隔2天(0、2、4、6、8和10天)给小鼠静脉注射生理盐水、srf溶液剂、cno溶液剂、sc溶液剂和sc纳米粒(15mg kg-1
srf、10.38mg kg-1
cno、30wt％dspe-peg
2k
)。每天记录肿瘤大小和体重。第一次治
疗后的第12天处死小鼠。同时采集血液进行肝肾功能分析。收集肿瘤及主要脏器作进一步病理分析。用h&e染色法对主要脏器进行组织病理学分析。将肿瘤称重匀浆，采用上述方法检测肿瘤nadp

/nadph比值、gsh含量、ros生成及谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶4的蛋白含量。对低氧诱导因子1的免疫荧光染色显示肿瘤内异质性低氧状态分布。同时对肿瘤标本进行h&e和tunel染色，分析肿瘤增殖情况。在雌性balb/c小鼠右后侧注射ct26细胞，建立另一荷瘤小鼠模型。给药方案与4t1肿瘤模型一致。经过各种处理后，处死小鼠，采集血样、脾脏和肿瘤组织，血样进行血常规检查。此外，通过免疫组化染色检测硝基还原酶蛋白和谷胱甘肽还原酶在肿瘤中的分布，探讨肿瘤微环境的重建。肿瘤切片进行tunel和h&e染色，clsm下观察。
[0116]
如图27-29所示，srf和cno单药治疗由于体内消除快，肿瘤积聚少，抑制肿瘤生长效果较差。srf和cno的混合溶液的抗癌活性强于srf和cno，说明两种药物具有协同作用。而二元杂化纳米组装体(sc纳米粒)在治疗过程中几乎完全抑制了肿瘤的生长，这应该归功于其血液循环长，肿瘤积聚量高，协同治疗效果好。通过表征低氧诱导因子1在肿瘤中的水平和分布来检测低氧情况。如图30所示，肿瘤中低氧的发生率与组织深度呈正相关。在体内验证了sc nps的协同作用机制。如图31-34所示，sc纳米粒诱导肿瘤组织中nadph和谷胱甘肽水平显著降低，ros积累显著增加。同时，sc纳米粒也下调了谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶4的表达，这与体外实验结果一致。肿瘤切片的h&e染色证实sc nps能明显抑制细胞增殖，最终消除肿瘤细胞(图35)。
[0117]
进一步验证sc纳米粒在小鼠ct26结肠癌模型中的肿瘤照明和外周/中心协同抗肿瘤作用。如图36-37所示，sc nps仍然表现出强大的抗肿瘤活性，在小鼠体内肿瘤几乎完全消除。相比之下，与sc nps相比，cno、srf和sc溶液剂组在ct26结肠荷瘤小鼠中表现出良好的治疗结果。这些结果与4t1肿瘤模型的上述结果一致，进一步说明sc nps具有协同治疗作用。血液分析和脾脏大小也显示srf溶液剂和sc溶液剂具有较强的毒性(图38-39)，这与4t1肿瘤模型的安全性评价结果一致。检测边缘常氧区和内部低氧生态位的硝基还原酶表达。如图40所示，在低氧环境中发现的硝基还原酶水平比在常氧环境中高得多。硝基还原酶通过催化cno还原为cnh，促进了肿瘤光照的点亮。研究治疗后肿瘤组织中谷胱甘肽还原酶水平。如图41所示，谷胱甘肽还原酶的含量与上述结果一致(外围:常氧；中心:低氧)，经含cno的制剂处理后，瘤内谷胱甘肽还原酶显著降低，而单独的srf对谷胱甘肽还原酶的表达几乎没有影响。谷胱甘肽还原酶的下调应归因于cno对nadph的消耗。此外，由h&e染色所示，具有外周/中心闭环效应的sc纳米粒诱导肿瘤组织中广泛的细胞死亡(图42)。综上所述，srf和cno的二元纳米共组装有望提供一种高效、低毒的疗法，用于实现低氧特异性照明和化疗-铁死亡联合治疗模式。
[0118]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。