一种含米诺地尔的缓释微针及其制备方法与应用

1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种含米诺地尔的缓释微针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.雄激素源性脱发的确切发病原因尚未明确，但已肯定遗传因素与雄激素的作用与发病有关。除遗传因素外，雄激素的作用主要表现为睾酮与毛囊中的雄激素性受体结合后，会被细胞质中的5α-还原酶转化为二氢睾酮，二氢睾酮进入细胞核对代谢产生影响，能对毛囊产生毒性作用，使毛囊萎缩。据世界卫生组织统计，我国男性的患病率为21.3％，女性患病率约为6.0％。且近几年，有研究报道，雄激素源性脱发也常在青少年人群中出现，但其患病率目前尚不清楚。虽然脱发不是一类危及生命的重大疾病，但由脱发导致的身体与形象的变化，已经严重影响到患者的心理健康和生活质量。
3.目前，由美国食品药品监督管理局(u.s.food and drug administration,fda)批准用于治疗雄激素源性脱发的药物只有口服非那雄胺和外用涂抹米诺地尔溶液两种治疗方式。口服药物会进入体内血液循环，部分药物由于首过效应而被代谢从而影响其生物利用度，体循环中的药物还会引起对机体其他器官的副作用。外用涂抹药物使用方便，且属于局部给药，但是，由于存在皮肤-角质层屏障，导致药物的经皮吸收率低。因此，患者需频繁、重复给药，容易引起皮肤过敏、皮肤炎症等副作用。
4.综上，现有技术中治疗雄激素源性脱发存在的治疗不足：(1)避免频繁、重复给药，实现药物的长期释放。(2)有效提高药物生物利用度。因此，为了解决上述问题，有必要开发一种针对雄激素源性脱发全新的治疗产品。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种聚乙烯醇-plga的共混基质及其制备方法与应用，能够实现治疗药物米诺地尔的长期缓慢释放，提高治疗药物米诺地尔的生物利用度。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.在本发明的第一方面，提供了一种含米诺地尔的缓释微针的制备方法，所述方法包括：将plga溶解在体积比为(10-20)：1的三氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液中，获得plga溶液；将米诺地尔溶解在冰醋酸中，获得米诺地尔溶液；将所述米诺地尔溶液加入到所述plga溶液中，获得油相溶液；其中，所述米诺地尔溶液与所述plga溶液的体积比为1：(4-6)；
8.将聚乙烯醇在超纯水中溶解，获得水相溶液；
9.将所述油相溶液滴加入所述水相溶液中，获得白色乳状液，后经搅拌获得载药plga微球，经离心、洗涤和干燥，获得载药plga微球粉末；其中，所述油相溶液与所述水相溶液的体积比为1：(2-10)；
10.将聚乙烯醇和蔗糖分散于超纯水中溶解，获得混合溶液；向所述混合溶液中加入所述载药plga微球粉末混匀，获得针尖基质溶液；
11.将所述针尖基质溶液加入到微针模具中抽真空并离心，干燥后微针脱模，获得含米诺地尔的缓释微针。
12.在本发明的第二方面，提供了一种所述的方法获得的含米诺地尔的缓释微针。
13.在本发明的第三方面，提供了所述的含米诺地尔的缓释微针在制备用于治疗雄激素源性脱发产品中的应用。
14.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
15.1、本发明提供的一种含米诺地尔的缓释微针及其制备方法与应用，本发明的载药缓释微针能够实现治疗药物米诺地尔的长期缓慢释放，结合微针技术的应用，提高治疗药物米诺地尔的生物利用度。当微针穿透皮肤后，伴随着微针的溶解，plga微球能够稳定的留在皮下实现长期的药物缓慢释放，释放出来的米诺地尔通过舒张血管平滑肌、增加局部血流、促进皮下组织中毛囊再生，来达到显著促进毛发再生，有效增加毛发再生效果的目的。我们发明的载药缓释微针主要通过降低给药频率和提高药物生物利用度来改善用药安全性和提高患者依从性。
16.2、本技术的技术难点在于如何控制载药plga微球的粒径在10-20μm之间，使得其顺利装进微针，载药微球的粒径过大将无法装进微针，粒径过小由于微针基质的阻力无法很好的填充至微针尖端。本技术发明人通过实验发现：通过单乳法并控制参数：将plga溶解在体积比为(10-20)：1的三氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液中；所述米诺地尔溶液与所述plga溶液的体积比为1：(4-6)；所述油相溶液与所述水相溶液的体积比为1：(2-10)；能够将微球的粒径控制在10-20μm之间，使其能够更好的装进微针。
17.3、本发明中测定了载药的plga微球在磷酸盐缓冲溶液中具有很好的长达28天的药物释放效率。药物的累积释放率可以达到接近100％。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
19.图1为载药plga缓释微球的粒径分布图。
20.图2为微球中米诺地尔在28天内的体外药物释放。
21.图3为单一方法和复合方法将plga微球装进微针尖端的对比图。
22.图4为载微球微针的体外皮肤穿刺图。
23.图5为微球中包裹的荧光染料尼罗红在体内逐渐释放的量化结果图。
24.图6为经不同给药方式后，皮下组织中的荧光强度量化图。
25.图7为载药缓释微针应用于雄激素源性脱发小鼠模型后，促进毛发的再生面积量图。
26.图8为载药缓释微针应用于雄激素源性脱发小鼠模型后，促进毛发的再生密度量图。
27.图9为载药缓释微针应用于雄激素源性脱发小鼠模型后，促进再生毛发直径的量化结果图。
28.图10为载药缓释微针应用于雄激素源性脱发小鼠模型后，促进再生毛囊长度的量化结果图。
29.图11为载药缓释微针应用于雄激素源性脱发小鼠模型后，促进真皮层厚度的量化结果图。
具体实施方式
30.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
31.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
32.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
33.下面将结合实施例、对比例及实验数据对本技术的一种含米诺地尔的缓释微针及其制备方法与应用进行详细说明。
34.实施例1、含米诺地尔的缓释微针及其制备方法
35.1、包裹米诺地尔的plga缓释微球的制备
36.本实施例包括按质量百分比计的以下原料：
[0037][0038]
本实施例的制备方法：
[0039]
a、按照处方配比，在40℃下，将plga(50:50，分子量5k-30k)经过磁力搅拌溶解在三氯甲烷和乙酸乙酯中形成透明澄清的溶液(plga溶液)；将处方量的米诺地尔溶解在冰醋酸中后加到上述plga溶液中，获得油相溶液；
[0040]
b、按照处方配比，在室温下，将2％聚乙烯醇(分子量12k-15k)在超纯水中溶解形成聚乙烯醇溶液，即为水相；
[0041]
c、在室温下，将a溶液逐滴加入步骤b所述溶液中后，使用涡旋仪涡旋90s后，形成稳定的白色乳状液。经磁力搅拌器800转，4-5h搅拌，使有机溶剂充分挥发后，得到载药plga微球。离心、洗涤三次后经冷冻干燥机干燥，得载药微球粉末。由图1可知，微球的粒径分布在10-20μm之间，平均粒径为15μm。
[0042]
该实施例中，三氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为为19：1。米诺地尔溶液与plga溶液
的体积比为1:5；油相溶液与水相溶液的体积比为1:5；
[0043]
2、载药缓释微球微针的制备
[0044][0045]
本实施例的制备方法：
[0046]
a、取实施例1中制备得到的载药plga微球白色粉末；
[0047]
b、按照处方配比，称取180mg聚乙烯醇(分子量12k-15k)和180mg蔗糖分散于1ml水中，搅拌至充分溶解，加入处方比例的载药plga微球冻干粉，搅拌至混合均匀。取100μl上述针尖基质平铺到微针模具上，通过在真空板上抽真空20min后,使用离心机4200转，5min离心，重复操作，直至去除掉背衬上多余的基质溶液并使载药微球充分填充进模具中的针尖部分；
[0048]
c、按照处方配比，称取180mg聚乙烯醇(分子量12k-15k)和180mg蔗糖分散于1ml水中，搅拌至充分溶解。不加入载药微球粉末作为空白基质溶液。随后，取100μl的空白基质溶液加入到离心后的模具上。通过在真空板上抽真空2h后，置于磁力搅拌器上40℃干燥24h，使用亚克力板脱模后，得含米诺地尔的缓释微针。
[0049]
实施例2
[0050]
该实施例中，三氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为为10：1。米诺地尔溶液与所述plga溶液的体积比为1：4；所述油相溶液与所述水相溶液的体积比为1：2；其他步骤同实施例1。
[0051]
具体地，本实施例包括按质量百分比计的以下原料：
[0052][0053]
实施例3
[0054]
该实施例中，三氯甲烷和乙酸乙酯的体积比为为20：1。米诺地尔溶液与所述plga溶液的体积比为1：6；所述油相溶液与所述水相溶液的体积比为1：10；其他步骤同实施例1。
[0055]
具体地，本实施例包括按质量百分比计的以下原料：
[0056][0057]
对比例1
[0058]
该对比例中，plga的溶剂为100％三氯甲烷，其他步骤均同实施例1。
[0059]
对比例2
[0060]
该对比例中，plga的溶剂为100％乙酸乙酯，其他步骤均同实施例1。
[0061]
对比例3
[0062]
该对比例中，米诺地尔溶液与plga溶液的体积比为1：2，其他步骤均同实施例1。
[0063]
对比例4
[0064]
该对比例中，米诺地尔溶液与plga溶液的体积比为1：1，其他步骤均同实施例1。
[0065]
对比例5
[0066]
该对比例中，油相溶液与水相溶液的体积比为1：2，其他步骤均同实施例1。
[0067]
对比例6
[0068]
该对比例中，油相溶液与水相溶液的体积比为1：1，其他步骤均同实施例1。
[0069]
实验例1、载药plga微球的粒径的测定
[0070]
测定实施例1和对比例1-对比例6中载药plga微球的粒径如表1所示。
[0071]
表1
[0072]
组别粒径实施例115μm实施例216μm实施例317μm对比例1500μm-1mm对比例2500μm-1mm对比例35μm-1μm对比例4500nm-1000nm对比例5200μm-500μm对比例6500μm-800μm
[0073]
由表1可知，
[0074]
对比例1中，plga溶剂为100％三氯甲烷，不在本发明实施例(10-20)：1的范围内，微球粒径500μm-1mm，无法装进微针；
[0075]
对比例2中，plga溶剂为100％乙酸乙酯，不在本发明实施例(10-20)：1的范围内，微球粒径500μm-1mm，无法装进微针；
[0076]
对比例3中，米诺地尔溶液与plga溶液的体积比为1：2，大于本发明实施例1：(2-10)的范围，微球粒径5μm-1μm，无法填充至微针尖端；
[0077]
对比例4中，米诺地尔溶液与plga溶液的体积比为1：1，小于本发明实施例1：(2-10)的范围，微球粒径500nm-1000nm，无法填充至微针尖端；
[0078]
对比例5中，油相溶液与水相溶液的体积比为1：2，大于本发明实施例1：(2-10)的范围，微球粒径200μm-500μm，无法填充至微针尖端；
[0079]
对比例6中，油相溶液与水相溶液的体积比为1：1，小于本发明实施例1：(2-10)的范围，微球粒径500μm-800μm，无法装进微针；
[0080]
实施例1中，通过单乳法并控制参数：将plga溶解在体积比为(10-20)：1的三氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液中；所述米诺地尔溶液与所述plga溶液的体积比为1：(4-6)；所述油相溶液与所述水相溶液的体积比为1：(2-10)；能够将微球的粒径控制在10-20um之间，使其能够更好的装进微针。任何一个参数不在本发明实施例的范围内，均不能装进微针。
[0081]
实验例2、对实施例1制备得到的载药微球的体外释放药物情况进行了测定
[0082]
体外释放实验方法：将整个载微球微针溶于1ml去离子水中，待微球溶出后，离心、洗涤三次后，冷冻干燥，得一个微针中的载球量。随后往微球粉末中加入2ml ph＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲溶液中，于37℃的摇床孵育，每隔预定的时间间隔离心，收集上清液，并用等体积的新鲜缓冲液代替。使用紫外分光光度计测定上清液中的米诺地尔的浓度。
[0083]
结果：由图2可知，药物在初始释放阶段释放速率较快，14天后，药物的释放速率逐渐减慢，到第28天时，药物基本释放完毕。药物的最终累积释放量可以达到几乎100％，表明plga微球可以实现为期一个月左右的药物缓释且具有较好的释药效率。
[0084]
实验例3、将实施例1制备得到的载微球微针进行体外皮肤穿刺实验
[0085]
体外皮肤穿刺实验方法：以荧光染料尼罗红为模拟药物，制备载微球微针。随后，取离体的大鼠背部皮肤，用铆钉将皮肤固定在砧板上。取干燥的微针用大拇指将其按压进皮肤时开始计时，按压50s后，在皮肤上停留20min后，将微针揭下。使用荧光显微镜观察皮肤的穿刺情况。
[0086]
结果：由图4可以看到，皮肤上留下了清晰的10
×
10微针整列的荧光点。结果表明，几乎百分之百的微针都可以扎入皮肤。
[0087]
实验例4、载荧光染料尼罗红的微球微针在大鼠体内药物释放动力学
[0088]
实验方法：将成年sd大鼠经异戊巴比妥钠麻醉后，使用剃毛器剃除大鼠背部毛发，并使用薇婷脱毛膏脱除细小毛发，在此过程中，保证大鼠背部皮肤无损伤。采用包裹尼罗红微球的微针，模拟药物在体内的动态释放过程。将微针插入sd大鼠背部皮肤后，按压50s,微针停留20min后，将微针背衬部分揭下。所有实验动物均在避光条件下饲养。使用荧光显微镜记录第1、4、7、10、14、17、20、25、30、35天内大鼠体内随着微球降解荧光染料释放情况。所有的拍摄条件一致。然后，使用imagej量化尼罗红的荧光强度，将第一天的荧光强度进行归一化处理后计算后续荧光强度。
[0089]
结果：由图5荧光强度的量化结果可知，到第25天之后，大部分的荧光基本消失，整个释放过程中，荧光呈稳定衰减趋势，表明药物在进行长期缓慢释放。
[0090]
实验例5、以荧光染料尼罗红为模拟药物，采用不同给药方式后，药物的经皮渗透对比实验
[0091]
实验方法：使用尼罗红为模拟药物，分别制备包裹尼罗红的微球、尼罗红溶液、负载尼罗红的载药微球微针。使用异戊巴比妥钠对雄性c57bl/6小鼠进行麻醉后，对其背部进行脱毛处理，注意避免损伤背部皮肤。随后，在其背部皮肤上分别给予涂抹包裹尼罗红的微球、尼罗红溶液、载包裹尼罗红的微球微针，于24h后，处死小鼠，取涂抹处与扎针处的皮肤包埋后，进行冷冻切片，使用倒置荧光显微镜拍摄各组的体内经皮渗透情况。并对皮下组织不同深度中的荧光强度进行量化，来反映药物的经皮渗透情况。
[0092]
结果：由图6可知，涂抹微球组与涂抹溶液组的荧光只停留在皮肤表面，随着皮下组织中深度增加，无荧光出现。而在应用微针组，皮下组织中的荧光强度较高。通过以上对比试验可充分说明，微针剂型的使用可以有效地将载药微球递送至皮下进行长期药物释放，有效提高药物米诺地尔的经皮吸收率。
[0093]
实验例6、载微球微针的体内治疗效果评估
[0094]
实验方法：雄激素性脱发模型的建立：5周龄雄性c57bl/6小鼠适应一周后，使用剃毛器剔除小鼠背部毛发，并使用薇婷脱毛膏将老鼠背部细小毛发脱掉后待老鼠适应一天。一天后，小鼠背部涂抹0.2％睾酮溶液，溶剂为50％乙醇。按照0.1ml/cm2的量局部涂抹于小鼠背部脱毛区域。随后，将小鼠随机进行分组，分别为对照组、负载空白微球微针组、载药微球微针组(28天内给药一次)、载药微球微针组(28天内每周给药一次)、每天外用涂抹5％米诺地尔溶液组。各组中的小鼠每天涂抹0.2％睾酮溶液，持续42天。除此之外，空白微球微针组、载药微球微针组(给药一次)于第一天开始涂抹睾酮溶液时给予一次微针。载药微球微针组(每周给药一次)于第一天开始涂抹睾酮溶液时给予一次微针后，一周后再次给予一次微针，持续四周。外用涂抹5％米诺地尔组每天涂抹一次且其涂抹大小与微针阵列大小一致。各组小鼠一直观察到第42天，42天后，对毛发再生面积及再生密度进行量化，并对各组中再生毛发的直径进行量化，用来评估载药微球微针的治疗效果。最后，将毛发生长部位的皮肤组织进行he染色，评估皮下组织中毛囊的再生情况。
[0095]
结果：由图7可知，每周微针治疗组促进毛发再生面积明显优于每天外用涂抹米诺地尔溶液组，且相比对照组，能够显著促进毛发再生；而每月给药一次的治疗组与每天外用涂抹米诺地尔溶液组具有类似的效果。由图8可知，到第42天时，每周微针治疗组促进毛发再生密度也明显优于每天外用涂抹米诺地尔溶液组。其次，通过对各组再生毛发的直径进行量化，由图9可知，每周微针治疗组促进再生毛发的直径明显高于每天外用涂抹米诺地尔溶液组。随后，通过量化皮下组织中再生毛囊的长度，由图10可知，每周微针治疗组促进皮下组织中毛囊的再生长度明显优于每天外用涂抹米诺地尔溶液组。最后，由图11可知，每周微针治疗组由于促进毛囊再生长度效果最好，因此显著增加了真皮层的厚度。
[0096]
从雄激素源性脱发模型小鼠治疗实验结果可知，相较于其他给药组别，本发明的载药缓释微针每月给药一次即可取得与每天涂抹米诺地尔溶液相类似的治疗效果，而每周给予一次微针治疗后具有最好的治疗效果。相较于外用涂抹米诺地尔溶液治疗组，微针即能安全方便给药也可有效提高药物生物利用度。微针作用于脱发区域，将载药缓释微球直接递送进入皮肤，载药缓释微球可直接在毛囊附近进行长期的药物缓慢释放，避免患者频繁给药，提高患者的依从性。微球释放出来的米诺地尔可以通过扩张血管平滑肌、增加局部血流，有效促进毛囊再生，从而到达促进毛发再生的目的，对于毛发生长具有重要的意义。
[0097]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他
性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0098]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0099]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。