快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法

1.本发明涉及农产品检测领域，特别是涉及快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法。


背景技术：

2.二溴磷是一种由敌敌畏与溴起反应而产生的有机磷杀虫剂。高效谱广，以触杀作用为主，兼有胃毒和熏蒸作用。其是一种内吸性的杀虫剂和杀螨剂，用于防治将要采收的蔬菜、果树等作物的害虫。
3.2021版《gb 2763》规定了2,4-滴等564种农药在376种（类）食品中10092项残留限量标准，与2019版《gb 2763》相比，2021版《gb 2763》 新增了81种农药，相应增加限量标准1343项。其中，二溴磷就是此次新增的农药之一，最新国标《gb/t 2763-2021 食品中农药最大残留限量》要求蔬菜水果中二溴磷限值为0.01mg/kg。虽然越来越多的企事业单位及各类科研院所已经开展了大量对二溴磷等新增农药检测方法的研究工作，但至今对于二溴磷这个农药品种来说，还没有一种适合于快检的检测方法或手段。
4.目前商业化检测二溴磷的方法主要有以下几种：第一是《ny/t 761-2008 蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》，通过气相色谱法进行检测；第二是《sn/t 0706-2013 出口动物源性食品中二溴磷残留量的测定》，方法中既记载了使用ecd检测器的气相色谱检测的方法，也记载了液相色谱-质谱/质谱检测法。以上方法均涉及到大型仪器设备，虽然可以检测二溴磷，但上述方法操作难度较大，处理步骤繁琐，耗时较长，方法容错率低，对于操作人员要求较高。对于日益增长的快速检测需求来说，还是不足以应对的。而且二溴磷在无水情况下稳定，在水中分解较快，现有的针对其他有机磷农药的快检方法很难对二溴磷进行准确地残留检测。因此需要开发不依赖大型仪器设备的快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法。
6.根据本发明的一个方面，提供了快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法，包括以下：步骤a，称取一定量的除去污泥的均质后的待测样品于烧杯中，加入乙二胺-n-丙基硅烷、十八烷基硅烷键合硅胶及乙腈，充分混匀后静置，经滤膜进行过滤，弃掉滤液，保留固体滤余物，得到第一待测物；加入乙二胺-n-丙基硅烷、十八烷基硅烷键合硅胶和乙腈，其中乙二胺-n-丙基硅烷用于吸附去除待测样品中的有机酸、色素、金属离子和酚类等杂质，其中十八烷基硅烷键合硅胶用于吸附去除待测样品中的油性杂质，乙腈作为溶剂提供环境条件，排除待测样品中其他杂质对二溴磷提取的干扰。滤膜对前处理后的待测样品进行过滤，得到的第一待测物中保留二溴磷，用于后续步骤对可能含有的二溴磷进行提取；步骤b，将第一待测物转移至第一离心管中，加入丙酮与正己烷的混合溶液，震荡
混匀，再次过滤，弃掉固体滤余物，保留滤液，得到第一待测液；丙酮与正己烷的混合溶液将第一待测物中保留的二溴磷提取到第一待测液中；步骤c，将第一待测液转移至第二离心管中，吹干，得到第二待测物，向第二待测物中加入十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液，轻摇混匀后，加入无水氯化铝的二氯甲烷溶液以及氢氧化钠的乙醇溶液，震摇混匀后，保持0-5℃冰浴反应，反应完毕后，得到第二待测液；本步骤的反应如下式（ⅰ）所示：式（ⅰ）本步骤中将无水氯化铝、十二烷硫醇连用，以n-甲基吡咯烷酮提供反应体系的溶剂环境，便于提高反应产率。无水氯化铝、十二烷硫醇在碱性条件下，分别与二溴磷在0-5℃冰浴条件下，进行二溴磷的羟基化反应，使二溴磷的磷酸酯基团转变为磷酸根基团。通过控制反应在低温状态进行，既可以保证该反应能有效进行，又可以避免单独使用无水氯化铝进行反应时反应过于剧烈而导致的危险，还也可以抑制副产物的产生。氯化铝属于强路易斯酸，单独使用无水氯化铝进行羟基化反应时，会产生盐酸气体，造成烟雾很大，氯化铝具有潮解性暴露在空气中时间久了，会在表面形成氧化膜，使氯化铝变得不活泼，本发明中将无水氯化铝溶解于二氯甲烷中，可以避免潮解，保证无水氯化铝的反应活性。十二烷硫醇在碱性条件下与二溴磷发生羟基化反应，使二溴磷的磷酸酯基团转变为磷酸根基团；二溴磷容易发生水解反应，二溴磷在碱性条件下水解时并列进行式（ⅳ）或式（ⅶ）两个反应，式（ⅳ）反应生成敌敌畏，敌敌畏进一步水解生成二氯乙醛、二氯乙醛进一步水解生成乙醛，如式（
ⅴ
）、式（ⅵ）所示，式（ⅶ）反应生成磷酸酯钠盐，具体反应式如下：式（ⅳ）式（
ⅴ
）式
（ⅵ）式（ⅶ）二溴磷发生上述一系列水解反应后，生成的副产物种类较多，很难利用水解后产物对二溴磷进行检测反应，导致很难对微量残留的二溴磷进行准确检测。因此，本技术选择在步骤c中对第二待测物中加入十二烷硫醇的n-甲基吡咯烷酮溶液、无水氯化铝的二氯甲烷溶液以及氢氧化钠的乙醇溶液进行冰浴反应，避免第二待测物中的二溴磷发生水解反应，使二溴磷发生羟基化反应，将二溴磷的磷酸酯基团转变为磷酸根基团；步骤d，向第二待测液中加入氢氧化钠溶液，轻摇混匀后，静置分层，取下层至第三离心管中，并加入饱和氯化钠溶液混匀，加热反应15min，反应完毕后冷却至室温，得到第三待测液；本步骤的反应如下式（ⅱ）、式（ⅲ）所示：式（ⅱ）式（ⅲ）本步骤中，1mol/l氢氧化钠溶液用于对步骤c中生产的产物进行萃取，并提供碱性环境，在加热条件下，使式（ⅰ）的反应产物脱去两个溴原子，生成双键，得到式（ⅱ）的反应产物；式（ⅱ）的反应产物在碱性环境加热条件下，反应生成二氯乙醛，得到的第三待测液中含有二氯乙醛；氢氧化钠溶液还可以抑制生成的二氯乙醛进行水解，提高二氯乙醛在第三待测液中的浓度，保证后续测定顺利进行；饱和的氯化钠溶液用于提供过量的钠离子，在反应体系中抑制磷酸钠的电离，以避免生成的磷酸钠提高反应体系的ph值，抑制二氯乙醛的分解；步骤e，向新制的氢氧化铜悬浊液中逐滴加入第三待测液，持续加热，并观察现象；第三待测液与新制的氢氧化铜悬浊液进行反应，如果第三待测液中含有二氯乙醛，二氯乙醛中的醛基会与氢氧化铜在加热条件下反应，生成砖红色氧化铜沉淀。如果第三待测液中不含有二氯乙醛，与氢氧化铜在加热条件下反应，没有砖红色氧化铜沉淀生成；
步骤f，结果判定：滴加第三待测液并加热后，产生砖红色沉淀，说明第三待测液中含有二氯乙醛，判定为阳性，即待测样品中含有二溴磷；滴加第三待测液并加热后，没有产生砖红色沉淀，说明第三待测液中不含有二氯乙醛或二氯乙醛浓度较低，判定为阴性，即待测样品中不含有二溴磷。
7.本发明的有益效果：相比于色谱法，本发明的检测方法通过化学反应的手段，将目标物二溴磷从待测样品中提取出来后，进行羟基化反应，将二溴磷的磷酸酯基团生成为磷酸根基团，再进行脱溴反应，生成双键，进一步水解，生成二氯乙醛，利用新制氢氧化铜悬浊液与二氯乙醛发生反应，对第三待测液中的二氯乙醛进行鉴定，进而实现对待测样品中二溴磷残留的检测。本发明的方法原理简单易懂，专属性强，灵敏度高，检测结果直观，检测结果正确率高，不需要大型的分析仪器，耗时相对较少，均摊分析成本极低，适用于对农产品中二溴磷残留的现场快速检验，具有很强的实用性。
8.在一些实施方式中，步骤b中丙酮与正己烷的混合溶液中丙酮与正己烷体积比为1:4。
9.在一些实施方式中，滤膜的孔径为0.45μm。
10.在一些实施方式中，步骤c中十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液中十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的质量比为1:9。n-甲基吡咯烷酮在式（ⅰ）的反应中作为分散剂，提供反应体系的溶剂环境，便于提高反应产率。
11.在一些实施方式中，步骤c中无水氯化铝的二氯甲烷溶液中无水氯化铝的质量分数为5%。
12.在一些实施方式中，步骤c中氢氧化钠的乙醇溶液中氢氧化钠的质量分数为2%。
13.在一些实施方式中，步骤d中氢氧化钠溶液的摩尔浓度为1mol/l。
14.在一些实施方式中，待测样品为蔬菜或水果。
15.在一些实施方式中，步骤d中加热反应的温度为65℃。
16.在一些实施方式中，步骤a中十八烷基硅烷键合硅胶的粒径为5-15μm，所述十八烷基硅烷键合硅胶的孔径：120
å
。
17.具体实施方式
18.下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
19.实施例1本实施例中乙二胺-n-丙基硅烷选择西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司供应的97%的乙二胺-n-丙基硅烷；十八烷基硅烷键合硅胶选择上海麦克林生化科技股份有限公司供应的o875153 十八烷基硅烷键合硅胶，其粒径为5-15μm，其孔径为120
å
，乙醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙醇，乙腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙腈，丙酮选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯丙酮，正己烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯正己烷，n-甲基吡咯烷酮选择国药集团化学试剂有限公司供应的色谱级n-甲基吡咯烷酮，十二烷硫醇选择国药集团化学试剂有限公司供应的98%的十二烷硫醇，二氯甲烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯二氯甲烷，无水氯化铝
选择国药集团化学试剂有限公司供应的99.999%的无水氯化铝，氢氧化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氢氧化钠，硫酸铜选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯五水硫酸铜；1mol/l氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠倒入烧杯中，用去离子水溶解后，用玻璃棒引流注入500ml容量瓶，然后定容至刻度线；饱和氯化钠水溶液（20℃）：称取36.0g氯化钠放入入烧杯中，用去离子水稀释，用玻璃棒引流注入100ml容量瓶，然后定容至刻度线；2%氢氧化钠的乙醇溶液：称取2g氢氧化钠放入烧杯中，先用少量乙醇（10ml-15ml）溶解后，再于天平上补足乙醇至100g；5%无水氯化铝的二氯甲烷溶液：称取5g无水氯化铝放入烧杯中，用95g二氯甲烷溶解；质量比为1:9的十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液：称取10g十二烷硫醇加入烧杯中，再称取90g n-甲基吡咯烷酮加入烧杯中混匀；新制的氢氧化铜悬浊液：在10ml试管中加入10%氢氧化钠溶液2ml，用滴管滴入质量分数2%硫酸铜溶液4-6滴，振荡，得到新制氢氧化铜悬浊液，现用现配；以下实施例2-5均采用本实施例1中的试剂。
20.实施例2本发明的快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法，包括以下：步骤a，称取50g的除去污泥的均质后的待测蔬菜样品于500ml烧杯中，加入500mg乙二胺-n-丙基硅烷、300mg十八烷基硅烷键合硅胶及20ml乙腈，充分混匀后静置，经0.45μm滤膜进行过滤，弃掉滤液，保留固体滤余物，得到第一待测物；步骤b，将第一待测物转移至15ml第一离心管中，加入5ml丙酮与正己烷的混合溶液，其中丙酮与正己烷的体积比为1:4，震荡混匀5min，再次过滤，弃掉固体滤余物，保留滤液，得到第一待测液；步骤c，将第一待测液转移至10ml第二离心管中，于50℃下氮气吹干，得到第二待测物，向第二待测物中加入3ml质量比为1:9的十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液，轻摇混匀10s后，加入3ml无水氯化铝的二氯甲烷溶液以及0.5ml氢氧化钠的乙醇溶液，震摇混匀后，保持0℃冰浴反应60min，反应完毕后，得到第二待测液；步骤d，向第二待测液中加入3ml 1mol/l氢氧化钠溶液，轻摇混匀10s后，静置分层，取下层水层至15ml第三离心管中，并加入1ml饱和氯化钠溶液混匀，在65℃下加热反应15min，反应完毕后冷却至室温，得到第三待测液；步骤e，向新制的氢氧化铜悬浊液中逐滴加入第三待测液，持续加热，并观察现象；步骤f，结果判定：向新制的氢氧化铜悬浊液中加入第三待测液并加热后，产生砖红色沉淀，说明第三待测液中含有二氯乙醛，判定为阳性，即待测蔬菜样品中含有二溴磷。
21.实施例3本发明的快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法，包括以下：步骤a，称取50g的除去污泥的均质后的待测水果样品于500ml烧杯中，加入450mg乙二胺-n-丙基硅烷、250mg 十八烷基硅烷键合硅胶及20ml乙腈，充分混匀后静置，经0.45μ
m滤膜进行过滤，弃掉滤液，保留固体滤余物，得到第一待测物；步骤b，将第一待测物转移至15ml第一离心管中，加入4ml丙酮与正己烷的混合溶液，其中丙酮与正己烷的体积比为1:4，震荡混匀5min，再次过滤，弃掉固体滤余物，保留滤液，得到第一待测液；步骤c，将第一待测液转移至10ml第二离心管中，于60℃下空气吹干，得到第二待测物，向第二待测物中加入2ml质量比为1:9的十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液，轻摇混匀10s后，加入2ml无水氯化铝的二氯甲烷溶液以及0.5ml氢氧化钠的乙醇溶液，震摇混匀后，保持5℃冰浴反应60min，反应完毕后，得到第二待测液；步骤d，向第二待测液中加入2ml 1mol/l氢氧化钠溶液，轻摇混匀10s后，静置分层，取下层水层至15ml第三离心管中，并加入1ml饱和氯化钠溶液混匀，在65℃下加热反应15min，反应完毕后冷却至室温，得到第三待测液；步骤e，向新制的氢氧化铜悬浊液中逐滴加入第三待测液，持续加热，并观察现象；步骤f，结果判定：向新制的氢氧化铜悬浊液中加入第三待测液并加热后，没有产生砖红色沉淀，说明第三待测液中不含有二氯乙醛或二氯乙醛浓度较低，判定为阴性，即待测样品中不含有二溴磷。
22.实施例4本发明的快速检测农产品中微量二溴磷残留的方法，包括以下：步骤a，称取50g的除去污泥的均质后的待测蔬菜样品于500ml烧杯中，加入500mg乙二胺-n-丙基硅烷、300mg 十八烷基硅烷键合硅胶及20ml乙腈，充分混匀后静置，经0.45μm滤膜进行过滤，弃掉滤液，保留固体滤余物，得到第一待测物；步骤b，将第一待测物转移至15ml第一离心管中，加入5ml丙酮与正己烷的混合溶液，其中丙酮与正己烷的体积比为1:4，震荡混匀5min，再次过滤，弃掉固体滤余物，保留滤液，得到第一待测液；步骤c，将第一待测液转移至10ml第二离心管中，于55℃下氮气吹干，得到第二待测物，向第二待测物中加入3ml质量比为1:9的十二烷硫醇与n-甲基吡咯烷酮的混合溶液，轻摇混匀10s后，加入3ml无水氯化铝的二氯甲烷溶液以及0.5ml氢氧化钠的乙醇溶液，震摇混匀后，保持2.5℃冰浴反应60min，反应完毕后，得到第二待测液；步骤d，向第二待测液中加入3ml 1mol/l氢氧化钠溶液，轻摇混匀10s后，静置分层，取下层水层至15ml第三离心管中，并加入1ml饱和氯化钠溶液混匀，在65℃下加热反应15min，反应完毕后冷却至室温，得到第三待测液；步骤e，向新制的氢氧化铜悬浊液中逐滴加入第三待测液，持续加热，并观察现象；步骤f，结果判定：向新制的氢氧化铜悬浊液中加入第三待测液并加热后，没有产生砖红色沉淀，说明第三待测液中不含有二氯乙醛或二氯乙醛浓度较低，判定为阴性，即待测样品中不含有二溴磷。
23.实施例5选取阴性待测蔬菜样品，按照0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg的浓度向阴性待测蔬菜样品中添加二溴磷，然后均质化处理，制备得到不同处理浓度的均质后的待测添加
样品（每个处理3个重复），以阴性待测蔬菜样品为对照样品（3个重复），参照实施例2的检测方法对均质后的待测添加样品、对照样品进行检测，检测结果见下表1。
24.表1 二溴磷梯度浓度添加实验检测结果由上述表1可知，本发明的检测方法可以对二溴磷含量≥0.01mg/kg的待测样品进行定性检测，符合最新国标《gb/t 2763-2021 食品中农药最大残留限量》对蔬菜水果中二溴磷限值为0.01mg/kg的检测要求，适用于对农产品中二溴磷残留的现场快速检验，具有很强的实用性。
25.以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。