植物中的重组腺相关病毒载体的制作方法

植物中的重组腺相关病毒载体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年2月7日提交的美国临时专利申请第62/971,750号的优先权的权益，在此通过引用的方式以其整体明确地并入。
3.对序列表的引用
4.本技术与电子格式的序列表一同提交。所述序列表以名称为seqlistingvcpro002wo.txt的文件提供，所述文件创建于2021年2月3日，并且大小为115,770字节。通过引用的方式将电子序列表中的信息以其整体并入本文。
技术领域
5.本公开涉及编码腺相关病毒(aav)的组分的核酸序列(例如经密码子优化用于在植物中表达的那些)以及由这些核酸序列表达的蛋白质。还公开了使用这些核酸序列在植物中产生功能性aav颗粒的方法。与病毒生产的常规工艺相比，本文所公开的植物中的aav产生提供了许多益处，包括效率、成本、纯度、产量、可扩展性和安全性。


背景技术：

6.腺相关病毒(aav)因其具有最小的免疫原性、高效性和相对安全性，已发现在用于体外转导至人细胞中和体内转导用于基因疗法二者中非常受欢迎。aav颗粒通常在哺乳动物或昆虫细胞培养系统中产生，但维持这些细胞培养物、纯化aav颗粒和获得足够的病毒滴度是困难且昂贵的。目前需要生产aav颗粒的改进的方法。


技术实现要素：

7.本文描述了涉及核酸的实施方式，所述核酸包含编码腺相关病毒(aav)蛋白的序列、基本上由编码腺相关病毒(aav)蛋白的序列组成或由编码腺相关病毒(aav)蛋白的序列组成。在一些实施方式中，aav是aav血清型1、aav血清型2、aav血清型3、aav血清型4、aav血清型5、aav血清型6、aav血清型7、aav血清型8、aav血清型9、aav血清型10、aav血清型11或aav血清型12。在一些实施方式中，aav是aav血清型2(aav2)，其为常用于研究和临床应用中的血清型。aav蛋白包括但不限于rep蛋白(rep78、rep68、rep52、rep40)、cap蛋白(vp1、vp2、vp3)或aap。可增强宿主细胞中aav的复制的腺病毒蛋白包括但不限于e4orf6、e1a、e2a、e2b和va。在一些实施方式中，包含编码aav蛋白的序列、基本上由编码aav蛋白的序列组成或由编码aav蛋白的序列组成的核酸在活宿主或无细胞系统中转录并翻译成aav蛋白。在其它实施方式中，包含编码aav蛋白的序列、基本上由编码aav蛋白的序列组成或由编码aav蛋白的序列组成的核酸与编码aav蛋白的野生型序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述核酸与编码野生型aav2蛋白的野生型序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述核酸经密码子优化用于植物中的改善的、增加的或增强的表达。在一些实施方式中，所述核酸与seq id no：2-seq id no：11具有至
少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性并编码aav2rep/rep78/rep68/rep52/rep48蛋白，与seq id no：15-seq id no：24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性并编码aav2 cap/vp1/vp2/vp3蛋白，与seq id no：28-seq id no：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性并编码aav2 aap蛋白，或与seq id no：40-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性并编码ad5 e4orf6蛋白。在一些实施方式中，所述核酸经密码子优化用于在本氏烟草(nicotiana benthamiana)、普通烟草(nicotiana tabacum)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、马铃薯(solanum tuberosum)、大麻(cannabis sativa)、荞麦(fagopyrum esculentum)、稻(oryza sativa)、玉蜀黍(zea mays)、类番茄茄(solanum lycopersicoides)、番茄(solanum lycopersicum)、莴苣(lactuca sativa)中表达。在一些实施方式中，重组核酸载体包括但不限于：peaq载体、aav颗粒、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)细胞、植物细胞、或包含编码aav蛋白的核酸的植物。另外描述了用于从植物中分离aav颗粒的方法，其中所述植物可属于烟草属(nicotiana)、拟南芥属(arabidopsis)、茄属(solanum)、大麻属(cannabis)、荞麦属(fagopyrum)、稻属(oryza)、莴苣属(lactuca)或玉蜀黍属(zea)。在一些实施方式中，通过如下方法从植物中分离aav颗粒，所述方法包括离心、过滤、色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或疏水相互作用色谱法。
8.在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用作药物。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒在制备药物中使用。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于感染哺乳动物宿主细胞(例如人宿主细胞)。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗疾病。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于需要治疗性蛋白质或肽的患者(例如人患者)的基因疗法。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗代谢的先天性障碍(error)，包括但不限于酶缺乏症、糖原贮积病(gsd)、gsd 0型、gsd i型、gsd ii型、庞贝氏病、danon病、gsd iii型、gsd iv型、gsd v型、gsd vi型、gsd vii型、gsd viii型、gsd ix型、先天性乳糖酶缺乏、蔗糖不耐受、果糖尿症、果糖不耐受、半乳糖激酶缺乏症、半乳糖血症、成人葡聚糖体病、糖尿病、高胰岛素血症性低血糖症、磷酸丙糖异构酶缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、果糖二磷酸酶缺乏症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、转醛缩酶缺乏症、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶缺乏症、高草酸尿症、戊糖尿症或醛缩酶a缺乏症。
9.在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗神经性或神经退行性疾病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、运动神经元病、肌营养不良、becker肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、粘多糖贮积症iiib或芳香族l-氨基酸脱羧酶缺乏症。
10.在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗视网膜退行性疾病，包括但不限于视网膜色素变性、usher综合征、stargardt病、无脉络膜症、全色盲或x连锁视网膜劈裂症。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗血液紊乱，包括但不限于β-地中海贫血、镰状细胞病或血友病。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗遗传性或先天性原因的耳聋。在一些实施方式中，经纯化的aav颗粒用于治疗wiskott-aldrich综合征、x连锁慢性肉芽肿病、隐性营养不良型大疱性表皮松解症、i型粘多糖贮积症、α1抗胰蛋白酶缺乏症或
纯合性家族性高胆固醇血症。
11.在一些实施方式中，用水培法制备植物。在一些实施方式中，以用于萌发的湿度在浸泡于肥料溶液中的grodan岩棉立方体中制备植物种子。在一些实施方式中，将萌发的种子或植物保持在光照循环下，例如16小时光照/8小时黑暗、24小时光照/0小时黑暗、12小时光照/12小时黑暗或18小时光照/6小时黑暗。在一些实施方式中，将萌发的种子或植物保持在适当的温度下，例如50华氏度、55华氏度、60华氏度、65华氏度、70华氏度、75华氏度、80华氏度、85华氏度、90华氏度、95华氏度或100华氏度或由上述温度中的任两个所定义的范围内的任何温度。在一些实施方式中，所述种子在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天内萌发。在一些实施方式中，生长中的植物一旦根部伸出，应在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天内转移到更大的容器中。
12.在一些实施方式中，对包含aav2基因的核酸质粒、构建体或载体进行组装。在一些实施方式中，这些包含aav2基因的核酸质粒、构建体或载体包括peaq-ht-ad5orf6-opt_aav2-aap-opt、peaq-ht_capopt或peaq-ht-repopt_avgfpopt。在一些实施方式中，这些质粒、构建体或载体被转化入根癌农杆菌中。在一些实施方式中，经转化的根癌农杆菌在适合规模的培养物中生长，例如10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、1l、2l、3l、4l、5l、10l、20l、30l、40l、50l、100l、1000l、5000l、10000l、50000l、100000l、1000000l或由上述体积中的任两个所定义的范围内的体积。在一些实施方式中，用经转化的根癌农杆菌的培养物对植物进行农杆菌渗入(agroinfiltrated)。在一些实施方式中，经农杆菌渗入的植物在所述植物的细胞内产生aav2颗粒。在一些实施方式中，所述植物的部分(例如叶、茎、花、根或果实)被移除用于加工以纯化aav2颗粒。
13.在一些实施方式中，使用离心、色谱法、过滤或其它方法从生物材料加工aav2颗粒。在一些实施方式中，从各株植物中纯化至少104个、105个、106个、107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个、10
12
个、10
13
个或10
14
个病毒颗粒或病毒基因组。在一些实施方式中，完整的病毒颗粒占经纯化的总病毒颗粒的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方式中，所述病毒颗粒具有50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的纯度。在一些实施方式中，这些经纯化的病毒颗粒用于转导、研究、基因疗法或治疗性目的。
14.本发明的优选方面涉及以下编号的替代方式：
15.1.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码aav2 rep蛋白的序列，其中，所述序列与seq id no：2-seq id no：11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
16.2.如权利要求1所述的核酸分子，其中，所述序列与seq id no：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
17.3.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码aav2 cap蛋白的序列，其中，所述序列与seq id no：15-seq id no：24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
18.4.如权利要求3所述的核酸分子，其中，所述序列与seq id no：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
19.5.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码aav2 aap蛋白的序列，其中，所述序列与seq id no：28-seq id no：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
20.6.如权利要求5所述的核酸分子，其中，所述序列与seq id no：28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
21.7.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码ad5 e4orf6蛋白的序列，其中，所述序列与seq id no：40-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
22.8.如权利要求7所述的核酸分子，其中，所述序列与seq id no：40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
23.9.一种重组核酸载体，所述重组核酸载体包含如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子。
24.10.由如权利要求10所述的载体或如权利要求1-8中任一项所述的核酸中的任一种所编码的蛋白质。
25.11.一种aav颗粒，所述aav颗粒包含至少一种如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子、如权利要求9所述的载体或如权利要求10所述的蛋白质。
26.12.一种植物细胞，所述植物细胞包含至少一种如权利要求1-8中任一项所述的核酸分子、如权利要求9所述的重组核酸载体、如权利要求10所述的蛋白质或如权利要求11所述的aav颗粒。
27.13.一种植物，所述植物包含如权利要求12所述的植物细胞。
28.14.如权利要求12所述的植物细胞或如权利要求13所述的植物，其中，所述植物细胞或植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属或玉蜀黍属。
29.15.如权利要求14所述的植物细胞或植物，其中，所述植物为烟草属物种。
30.16.如权利要求15所述的植物细胞或植物，其中，所述植物为本氏烟草或普通烟草。
31.17.来自如权利要求12-16所述的任一种植物细胞或植物的叶、茎、花或根。
32.18.一种用于在植物中产生aav蛋白的方法，所述方法包括：
33.使植物与包含至少一种重组核酸载体的根癌农杆菌接触，其中，所述至少一种重组核酸载体包含编码aav蛋白的核酸序列，并且其中，所述核酸序列经密码子优化用于在所述植物中表达，任选地使用如权利要求9所述的重组核酸载体；
34.将所述至少一种重组核酸载体转移至所述植物的细胞；
35.在所述植物的细胞中表达所述aav蛋白；并且任选地
36.从所述植物的细胞中分离所述aav蛋白。
37.19.如权利要求18所述的方法，其中，在相同的植物中产生多种aav蛋白。
38.20.如权利要求19所述的方法，其中，aav颗粒在所述植物中产生并且所述aav颗粒任选地从所述植物中分离。
39.21.如权利要求20所述的方法，其中，所述aav颗粒能够感染哺乳动物细胞，任选人
细胞，任选hek293t。
40.22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中，所述植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属、莴苣属或玉蜀黍属。
41.23.如权利要求22所述的方法，其中，所述植物为烟草属物种。
42.24.如权利要求23所述的方法，其中，所述植物为本氏烟草或普通烟草，并且所述核酸序列经密码子优化以在本氏烟草或普通烟草中表达。
43.25.如权利要求18-24中任一项所述的方法，其中，分离所述aav蛋白包括离心、过滤和/或色谱法。
44.26.如权利要求25所述的方法，其中，所述色谱法为亲和色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或疏水相互作用色谱法。
45.27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中，所述至少一种重组核酸载体包含与seq id no：2-seq id no：11、seq id no：15-seq id no：24、seq id no：28-seq id no：37或seq id no：40-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的至少一种序列。
46.28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中，所述植物产出至少107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个、10
12
个、10
13
个或10
14
个拷贝的所述aav蛋白。
47.29.如权利要求28所述的方法，其中，所述植物产生至少10
12
个、10
13
个或10
14
个拷贝的所述aav蛋白。
48.30.一种基因疗法的方法，所述方法包括向有需要的受试者的细胞给予通过如权利要求18-29中任一项所述的方法产生和分离的aav颗粒。
49.31.用作药物的如权利要求9所述的重组核酸载体、或如权利要求11所述的aav颗粒、或通过如权利要求20或21所述的方法产生的aav颗粒。
50.32.用于用以治疗人的疾病的基因疗法中的如权利要求9所述的重组核酸载体、或如权利要求11所述的aav颗粒、或通过如权利要求20或21所述的方法产生的aav颗粒，所述疾病例如代谢的先天性障碍、酶缺乏症、庞贝氏病、danon病、神经退行性紊乱、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、运动神经元病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、视网膜退行性疾病、视网膜色素变性、usher综合征、stargardt病、或遗传性原因的耳聋。
51.33.一种在植物中产生功能性aav颗粒的方法，所述方法包括：
52.用至少一种重组核酸载体转化所述植物，所述重组核酸载体包含编码所述aav颗粒的组分或参与所述aav颗粒组装的组分的核酸序列；
53.在所述aav颗粒于所述植物中表达和组装的条件下，使所述植物生长；以及
54.从所述植物中分离所述aav颗粒。
55.34.如权利要求33所述的方法，其中，转化所述植物的步骤通过农杆菌渗入来完成。
56.35.如权利要求33或34所述的方法，其中，编码所述aav颗粒的组分的核酸序列针对所述植物进行密码子优化。
57.36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中，所述植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属、莴苣属或玉蜀黍属。
58.37.如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中，所述植物为烟草属、莴苣属或大
麻属的物种。
59.38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中，所述植物为本氏烟草、普通烟草、莴苣或大麻。
60.39.如权利要求33-38中任一项所述的方法，其中，所述aav颗粒的组分或参与所述aav颗粒组装的组分包括rep蛋白、cap蛋白、aap蛋白、或ad5 e4orf6蛋白，或它们的任意组合。
61.40.如权利要求39所述的方法，其中，所述rep蛋白由包含增强下游框内多肽翻译的弱植物kozak序列和/或用以防止隐蔽orf的潜在表达的内部甲硫氨酸密码子突变的核酸序列编码。
62.41.如权利要求39或40所述的方法，其中，所述rep蛋白由与seq id no：1-seq id no：11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列编码。
63.42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中，所述rep蛋白包含与seq id no：12或seq id no：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的肽序列。
64.43.如权利要求39-42中任一项所述的方法，其中，所述cap蛋白由包含增强下游框内多肽的翻译的弱植物kozak序列的核酸序列编码。
65.44.如权利要求39-43中任一项所述的方法，其中，所述cap蛋白由与seq id no：14-seq id no：24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列编码。
66.45.如权利要求39-44中任一项所述的方法，其中，所述cap蛋白包含与seq id no：25或seq id no：26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的肽序列。
67.46.如权利要求39-45中任一项所述的方法，其中，所述aap蛋白由与seq id no：27-seq id no：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列编码。
68.47.如权利要求39-46中任一项所述的方法，其中，所述aap蛋白包含与seq id no：38具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的肽序列。
69.48.如权利要求39-47中任一项所述的方法，其中，所述ad5 e4orf6蛋白由与seq id no：39-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列编码。
70.49.如权利要求39-48中任一项所述的方法，其中，所述ad5 e4orf6蛋白包含与seq id no：50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的肽序列。
71.50.如权利要求33-49中任一项所述的方法，其中，分离所述aav颗粒包括离心、过滤和/或色谱法。
72.51.如权利要求50所述的方法，其中，所述色谱法为亲和色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或疏水相互作用色谱法。
id no：29的编码序列。在该比对中使用的用于马铃薯的序列对应于seq id no：30的编码序列。在该比对中使用的用于大麻的序列对应于seq id no：31的编码序列。在该比对中使用的用于荞麦的序列对应于seq id no：32的编码序列。在该比对中使用的用于稻的序列对应于seq id no：33的编码序列。在该比对中使用的用于玉蜀黍的序列对应于seq id no：34的编码序列。在该比对中使用的用于类番茄茄的序列对应于seq id no：35的编码序列。在该比对中使用的用于番茄的序列对应于seq id no：36的编码序列。在该比对中使用的用于莴苣的序列对应于seq id no：37的编码序列。
83.图4描述了针对本氏烟草、拟南芥、马铃薯、大麻、荞麦、稻、玉蜀黍、番茄、莴苣和类番茄茄进行密码子优化的ad5 e4orf6核酸序列的序列比对。在该比对中使用的用于本氏烟草的序列对应于seq id no：40的编码序列。在该比对中使用的用于拟南芥的序列对应于seq id no：41的编码序列。在该比对中使用的用于马铃薯的序列对应于seq id no：42的编码序列。在该比对中使用的用于大麻的序列对应于seq id no：43的编码序列。在该比对中使用的用于荞麦的序列对应于seq id no：44的编码序列。在该比对中使用的用于稻的序列对应于seq id no：45的编码序列。在该比对中使用的用于玉蜀黍的序列对应于seq id no：46的编码序列。在该比对中使用的用于类番茄茄的序列对应于seq id no：47的编码序列。在该比对中使用的用于番茄的序列对应于seq id no：48的编码序列。在该比对中使用的用于莴苣的序列对应于seq id no：49的编码序列。
84.图5描述了使用根癌农杆菌渗入在植物中产生aav颗粒的实验程序。
85.图6描述了peaq-ht-repopt_avgfpopt的质粒图谱。
86.图7描述了peaq-ht-ad5orf6-opt_aav2-aap-opt的质粒图谱。
87.图8描述了peaq-ht_capopt的质粒图谱。
88.图9描述了通过aav2特异性qpcr检测到的在经渗入的本氏烟草、普通烟草、莴苣和大麻中aav2基因组颗粒的相对产量。
89.图10a描述了本氏烟草、莴苣和大麻叶片裂解物的总蛋白染色sds-page凝胶，示出了对应于vp1、vp2和vp3蛋白的条带的存在。
90.图10b描述了本氏烟草叶片裂解物的蛋白质印迹，示出了通过抗aav2 vp单克隆抗体检测到的对应于vp1、vp2和vp3蛋白的条带的存在。vp1＝“*”，vp2＝“^”，vp3＝“#”。
91.图11描述了用植物产生的aav2-cmv-egfp颗粒以每hek293t细胞2.7
×
104个、2.7
×
103个或2.7
×
102个病毒基因组的moi转导之后hek293t中egfp的表达。
92.图12描述了本公开中所述的示例性序列。
具体实施方式
93.在以下详细描述中，对附图进行了参考，所述附图形成了本文的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则相似的符号通常标识相似的组分。在具体的描述、附图和权利要求中描述的说明性实施方式并不意味着是限制性的。在不背离本文呈现的主题的精神或范围的情况下，可使用其它实施方式并且可做出其它改变。将容易理解的是，如本文一般性描述的和图中说明的，本公开的方面可以以各种不同配置来布置、置换、组合、分离和设计，所有的配置都在本文明确的考虑之列。
94.除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普
通技术人员通常理解的含义相同的含义。出于本公开的目的，以下术语定义如下。
95.冠词“一个/一种(a和an)”在本文中使用以指代该冠词的一个/一种或多于一个/一种(例如，至少一个/一种)的语法对象。举例来说，“一个/一种要素”意指一个/一种要素或多于一个/一种要素。
[0096]“约”意指份数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考份数量、水平、值、数值、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0097]
在整个申请文件中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括/含有(comprise/comprises/comprising)”将被理解为暗示包含所述步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或者步骤或要素的组。“由
……
组成”意指包括并限于跟随短语“由
……
组成”的任何内容。因此，短语“由
……
组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，并且没有其它要素可存在。“基本上由
……
组成”意指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于在本公开中为所列要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其它要素是可选的，并且可存在或不存在，这取决于它们是否实质上影响所列要素的活性或作用。
[0098]
除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域技术人员限度内的分子生物学和重组dna技术的常规方法。
[0099]
如本文所使用的，术语“功能”和“功能性”是指生物学功能或酶促功能。
[0100]
如本文所使用的，术语“经分离的”是指实质上或本质上不含有在其天然状态下通常伴随它的组分的物质。例如，“经分离的蛋白质”包括已从其天然存在状态中的生物体或环境中纯化的蛋白质。
[0101]
如本文所使用的，术语“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(pcr)产生的片段，以及由连接、剪裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用的任一种产生的片段。核酸分子可由单体组成，所述单体为天然存在的核苷酸(例如dna和rna)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合。经修饰的核苷酸可以具有糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中的改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基基团、胺和叠氮基基团取代一个或多个羟基，或者糖可以被官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可以用空间上和电子上相似的结构(例如氮杂糖和碳环糖类似物)取代。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶，或其它众所周知的杂环置换物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接键的类似物进行连接。磷酸二酯连接键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)或氨基磷酸酯(phosphoramidate)。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接到聚酰胺骨架的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或双链的。“寡核苷酸”可以与核酸互换使用并且可以指双链或单链的dna或rna。一种或多种核酸可以包含在核酸载体或核酸构建体(例如质粒、病毒、腺相关病毒(aav)、噬菌体、粘粒、f黏粒、噬菌粒、细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)或人类人工染色体(hac))中，所述核酸载体或核酸构建体可用于在多种生物系统中扩增和/或表达该一种或多种核酸。通常，所述载体或构建体还将包含元件，包括但不限于启动子、增强子、终止子、
诱导物、核糖体结合位点、翻译起始位点、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号、复制起点、克隆位点、多克隆位点、限制性酶位点、表位、报告基因、筛选标记、抗生素筛选标记、靶向序列、肽纯化标签或辅助基因，或它们的任意组合。
[0102]
核酸或核酸分子可以包含编码不同肽、多肽或蛋白质的一个或多个序列。这些一个或多个序列可以在相同的核酸或核酸分子中相邻地接合，或者在其间具有额外核酸地接合，所述额外核酸例如接头、重复序列或限制性酶位点、或任意其它序列，所述任意其它序列长为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、300个、400个、500个、1000个、2000个、3000个、4000个或5000个碱基，或由上述长度中的任两个所定义的范围内的任意长度。如本文所使用的，针对核酸的术语“下游”是指处于在前一序列的3'-末端之后的序列，如果所述核酸是双链的，则处于包含编码序列的链(有义链)上的在前序列的3'-末端之后。如本文所使用的，针对核酸的术语“上游”是指处于后续序列的5'-末端之前的序列，如果所述核酸是双链的，则处于包含编码序列的链(有义链)上的后续序列的5'-末端之前。如本文所使用的，针对核酸的术语“成组的”是指邻近出现的两个以上的序列，所述序列直接地邻近出现，或在其间具有额外核酸地邻近出现，但通常在其间不具有编码功能性或催化性多肽、蛋白质或蛋白质结构域的序列，所述额外核酸例如接头、重复序列或限制性酶位点、或任意其它序列，所述任意其它序列长为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个、300个、400个、500个、1000个、2000个、3000个、4000个或5000个碱基，或由上述长度中的任两个所定义的范围内的任意长度。
[0103]
如本文所使用的，关于核酸的术语“经密码子优化”是指基于靶细胞细胞质中各个氨酰-trna的相对可用性和物种特异性密码子使用偏好，置换核酸的密码子以使特定物种的宿主中的翻译增强或最大化，而不改变多肽序列。密码子优化和进行此类优化的技术是本领域已知的。此外，合成的经密码子优化的序列可以从dna测序服务商购获得。本领域技术人员将理解，基因表达水平取决于许多因素，例如启动子序列和调控元件。正如对大多数细菌所注意到的，密码子的小子集被trna种类所识别，引起翻译选择，这可能是蛋白质表达的重要限制。在此方面，可以设计许多合成基因来提高它们的蛋白质表达水平。在一些实施方式中，针对某些生物体的基因密码子优化使得该基因的表达水平为非密码子优化或野生型基因序列的表达水平至少100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。
[0104]
本文所述的核酸包含核碱基。主要的、典型的、天然的或未经修饰的碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。其它核碱基包括但不限于嘌呤、嘧啶、经修饰的核碱基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶、氨基烯丙基碱基、经染料标记的碱基、荧光碱基或经生物素标记的碱基。
[0105]
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指由通过肽键连接的氨基酸组成的大分子。肽、多肽和蛋白质的众多功能是本领域已知的，并且包括但不限于酶、结构、转
运、防御、激素或信号转导。尽管化学合成也是可用的，但肽、多肽和蛋白质通常但不总是使用核酸模板由核糖体复合物生物学地产生。通过操纵核酸模板，可以进行肽、多肽和蛋白质的突变(例如多于一种肽、多肽或蛋白质的置换、缺失、截短、添加、复制或融合)。多于一种肽、多肽或蛋白质的这些融合可以在相同分子中相邻地接合，或者在其间用额外氨基酸接合，所述额外氨基酸例如接头、重复序列、表位或标签、或任意其它序列，所述任意其它序列长为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个、200个或300个碱基，或由上述长度中的任两个所定义的范围内的任意长度。
[0106]
在一些实施方式中，本文呈现的和在实施例中使用的核酸或肽序列针对植物进行优化，但也可在其它生物体(例如细菌、真菌、原生动物或动物)中起作用。在其它实施方式中，与本文呈现的和在实施例中使用的核酸或肽序列共享0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似性或在由上述百分比中的任两个所定义的范围内的任何百分比的相似性的核酸或肽序列也可以对生物系统中序列的功能没有影响或影响很小地使用。如本文所使用的，术语“相似性”是指核酸或肽序列分别与具有特定变化(例如序列内的置换、缺失、重复或插入)的模板核酸或肽序列具有核苷酸或氨基酸的相同总体顺序。在一些实施方式中，共享低至0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相似性的两个核酸序列可以通过包含在翻译期间编码相同氨基酸的不同密码子来编码相同的多肽。
[0107]
除非另有说明，否则本文所使用的术语“病毒体”、“病毒或病毒载体”和“病毒颗粒”可互换使用。
[0108]
如本文所使用的，术语“包装”是指包括单链病毒基因组产生、外壳(衣壳)蛋白组装、病毒基因组封装等的事件。当将适当的质粒载体(通常多个质粒)引入允许在适当条件下包装的细胞系中时，重组病毒颗粒(即病毒体、病毒载体)被构建并分泌到培养物中。
[0109]
细小病毒科(parvoviridae)的病毒是小型dna动物病毒，特征在于其感染特定宿主的能力等因素。具体而言，细小病毒科分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(parvovirinae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(densovirinae)。细小病毒亚科(其成员在本文中称为细小病毒)包括依赖病毒属(dependovirus)，该属在大多数情况下需要与辅助病毒(例如腺病毒、牛痘病毒或疱疹病毒)共同感染以在细胞培养物中进行生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人(例如血清型2、血清型3a、血清型3b、血清型5和血清型6)或灵长类动物(例如血清型1、血清型4和血清型rh10)的腺相关病毒(aav)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒和博卡病毒)。
[0110]
近年来，由于其有效感染非分裂细胞和分裂细胞二者、维持哺乳动物细胞中来自游离型非整合aav基因组的长期转基因表达以及表现出对人相对低的致病风险的能力，aav已成为用于基因疗法的优选病毒载体。鉴于这些优点，重组腺相关病毒(raav)目前正用于神经系统紊乱、眼科紊乱、听力紊乱、血友病b、恶性黑色素瘤、囊性纤维化以及其它疾病的基因疗法临床试验中，并且最近通过了fda批准和bla许可以用于治疗视网膜退行性疾病leber先天性黑矇(lca)和运动神经元疾病脊髓性肌萎缩1型(sma1)。
aav的总括cgmp生产成本(上游、下游、qc、灌/封(fill/finish))从$8000至$25000不等(cameau,e.等，cell gene therapy insights 2019；5(11),1663-1675)。即使使用经优化的一次性搅拌或固定床哺乳动物细胞生物反应器，这也将使药物产品(如srp9001)的大规模cgmp全球制备的生产成本惊人地昂贵。本领域认识到与使用已知哺乳动物细胞系生产aav相关的有关困难。此外，昆虫细胞bevs系统受制于显著的基因组不稳定性和遗传漂变，阻碍了稳定生产细胞系的有效发展。还有的可能性是，在哺乳动物细胞和昆虫细胞培养中产生的被指定用于临床的载体会被哺乳动物或昆虫细胞中存在的非期望的、可能是致病的物质污染。鉴于这些和其它问题，仍然需要有效、安全和经济地生产大量传染性raav颗粒的替代性和改进的方法。
[0115]
与基于细胞培养的生产系统相反，植物生物质的生成不需要建造昂贵的发酵设施，并且相应地，无需建造重复的设施即可实现扩大规模生产。因此，植物生物质生成和上游加工能力可以通过已建立的农业实践以资本高效的方式运营和规模化。渗入/生产和纯化后，基于本氏烟草中经优化的重组蛋白的生产的经实验确定的高达1g/kg的植物生物质产量，一株4-6周龄的小植物估计等效于一升悬浮适应的哺乳动物细胞。相比之下，植物制造的生物制剂花费显著低于当前基于细胞培养的系统，因为哺乳动物细胞培养需要相当大的启动投资和昂贵的生长培养基(lai h,chen q plant cell rep.2012年3月；31(3):573-84)。植物也超过了其它表达系统的可扩展性，因为表达重组蛋白的生物质能够以农业规模生产，而无需建造重复的生物反应器和相关设施(chen q.biological engineering transactions.2008；1:291
–
321)。与细菌细胞相反，植物可以产生需要对蛋白质进行适当翻译后修饰的大的功能性药物蛋白质，所述修饰包括类似于哺乳动物或昆虫细胞的多个异亚基的组装和糖基化(lai h等，proc natl acad sci u s a.2010年2月9日；107(6):2419-24.)。
[0116]
本文描述了用于在植物中生产临床级重组复制缺陷型腺相关病毒载体的快速、可扩展且具有成本效益的方法。本文还公开了编码aav蛋白的核酸序列和经密码子优化用于在植物中有效表达或发挥功能的aav基因组。
[0117]
aav是无包膜、复制缺陷型病毒，直径约20nm，具有约4.8千个碱基长的单链dna基因组。已鉴别出超过100种aav血清型，其中至少12种血清型在一定程度上被表征。这些aav血清型表现出明显的差异，例如用于进入的特定宿主细胞受体或主要受体，以及对某些宿主细胞类型(例如肌肉细胞、神经元、星形胶质细胞、肝细胞)的偏好。例如，aav1、aav4、aav5和aav6结合至n-或o-连接的唾液酸化蛋白聚糖，aav9结合至半乳糖，以及aav2和aav3结合至硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。aav2历来是研究和利用得最好的，但根据不同血清型的独特特性使用它们是可能的。aav基因组包含三个基因：rep、cap和aap，但这些基因中的内部开放阅读框和启动子产生了多种不同的蛋白质或蛋白质片段。rep编码rep78、rep68、rep52和rep40，它们都参与基因组复制和病毒颗粒的包装。cap编码vp1、vp2和vp3，它们形成二十面体病毒衣壳。aap在cap序列内的不同阅读框中出现，编码组装-激活蛋白(aap)，其至少在aav2中是恰当的衣壳形成所必需的，但在其它aav血清型中是可有可无的。被包装到aav颗粒中的核酸物质或基因组对应于发现侧接有反向末端重复(itr)的序列。在野生型病毒中，itr侧接于rep、cap和aap基因序列。对于重组aav，不同的转基因包括但不限于：编码酶标志物的基因(例如lacz)、编码荧光蛋白(例如gfp、egfp)的基因、编码光遗传学蛋白(例如
chr2、arctt、c1v1)的基因、编码细胞代谢、钙和电活动的遗传传感器(例如gcamp、rcamp、遗传编码的电压传感器)的基因、编码药物筛选标记的基因、编码基因和rna编辑蛋白(例如，锌指核酸酶、talen、crispr-cas蛋白、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)cas9、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)cas9、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)cas9、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)cas9、新凶手弗朗西斯菌(francisella novicidia)cas12a或cas12b，普雷沃菌属(prevotella sp.)p5-125 cas13a、cas13b、cas13c或cas13d，porphyromonas gulae cas13a、cas13b、cas13c或cas13d，鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer)cas13a、cas13b、cas13c或cas13d)的基因、调控或诱导转基因表达的基因(例如，dox诱导型基因开关、cumate诱导型基因开关、phyb光调控基因开关)或治疗疾病的基因(例如，用于囊性纤维化的cftr，用于血友病b的因子ix，用于leber先天性黑矇的rpe65，用于神经退行性疾病的神经营养因子)。通过从侧接有itr的区域排除rep蛋白，转基因作为游离体存在，并且可以由宿主瞬时表达，而非整合到宿主基因组中。还可以制作将两种或多种血清型组合的杂合aav颗粒来改变对宿主细胞受体的转导效率、细胞类型向性或亲和性。
[0118]
作为复制缺陷型病毒，aav需要辅助病毒以有效复制。与腺病毒共同感染可以实现这点，但在纯化期间引起腺病毒污染。为避免该情况，腺病毒基因组的e1、e2a、e4和va区域的表达(来自含有aav基因的核酸载体，或先前经工程化的宿主细胞)提供了有效aav生产所需的组分的额外集合。在一些实施方式中，当使用内源性aav启动子时，e1、e2a和va区域仅为有效的aav生产所需。在一些实施方式中，aav基因可以用其它启动子驱动，例如组成型启动子、诱导型启动子、其它病毒启动子、哺乳动物启动子、细菌启动子、真菌启动子或植物启动子。在一些实施方式中，仅需要e4区域用于aav的复制。在一些实施方式中，在植物转化期间伴随aav表达载体提供腺病毒5型e4orf6基因(ad5e4orf6)以增加aav的产量。
[0119]
在一些实施方式中，在无菌条件下和在受调控或受控制程序下产生aav颗粒。用于维持和确保无菌的方法可遵循良好生产规范(good manufacturing practice，gmp)、良好组织规范(good tissue practice，gtp)、良好实验室规范(glp)和良好分销规范(good distribution practice，gdp)标准。用于维持和确保无菌的方法包括但不限于高效微粒空气(hepa)过滤、湿热或干热、辐射(例如x射线、γ射线或uv光)、杀菌剂或熏蒸剂(例如环氧乙烷、二氧化氮、臭氧、戊二醛、甲醛、过氧乙酸、二氧化氯或过氧化氢)、无菌容器的无菌装填、在塑料膜或包裹材料中包装、或真空密封。
[0120]
用方法对aav进行纯化以提供功能性病毒颗粒的最佳产量，同时排除可能伤害个体的潜在污染物并避免无功能空衣壳的纯化。为了该目标，可以使用本领域已知的技术来对aav进行纯化，包括但不限于提取、冻融、均质化、透化、离心、密度梯度离心、cscl梯度离心、碘克沙醇梯度离心、超速离心、分馏、沉淀、sds-page、非变性page、尺寸排阻色谱法、液相色谱法、气相色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、亲和色谱法、硫酸肝素亲和色谱法、唾液酸亲和色谱法、免疫亲和色谱法、金属结合色谱法、镍柱色谱法、表位标签纯化、或冻干，或它们的任意组合。
[0121]
与任何其它生物体的组一样，某些植物因特性(例如大小、生长速率、培养容易度、可用的病原体或载体、抗病性、对外部条件的适应性、光照要求、遗传操纵的容易度、产生的植物化学物质的类型或基因组序列的可用性)而在研究或生产用途中受到青睐。由于这些
特性或任何其它期望特性而有用的植物包括但不限于烟草属：本氏烟草、普通烟草，拟南芥属：拟南芥，茄属：马铃薯、番茄、类番茄茄，大麻属：大麻，荞麦属：荞麦，稻属：稻，玉蜀黍属：玉蜀黍，大麦属(hordeum)：大麦(hordeum vulgare)，卷柏属(selaginella)：江南卷柏(selaginella moellendorffii)，短柄草属(brachypodium)：二穗短柄草(brachypodium distachyon)，百脉根属(lotus)：百脉根(lotus japonicus)，浮萍属(lemna)：膨胀浮萍(lemna gibba)，苜蓿属(medicago)：蒺藜苜蓿(medicago truncatula)，沟酸浆属(mimulus)：多斑沟酸浆(mimulus guttatus)，小立碗藓属(physcomitrella)：小立碗藓(physcomitrella patens)，杨属(populus)：毛果杨(populus trichocarpa)，莴苣属：莴苣，或能够通过根癌农杆菌进行转化的任何植物物种。在一些实施方式中，所述植物属于烟草属。在一些优选的实施方式中，所述植物是本氏烟草。
[0122]
根癌农杆菌是对植物具有致病性的细菌，在植物中引起瘿、冠瘿或肿瘤。根癌农杆菌通过肿瘤诱导质粒(ti质粒)来实现这点，所述质粒包含转移到宿主植物的t-dna区域和编码用于进行所述转移的iv型分泌机制的基因的致病岛或毒力区域。t-dna区域包含编码合成导致瘿或肿瘤生长的植物激素(例如生长素和细胞分裂素)的蛋白质的基因。通过去除这些基因(以消除疾病的形成)并插入期望的基因用于表达，根癌农杆菌是用于对植物进行遗传工程化的有效工具。植物或根癌农杆菌的成功转化可通过新霉素磷酸转移酶的表达由例如对新霉素、卡那霉素或g418(geniticin)的抗性来进行筛选。更多关于使用根癌农杆菌转化植物的信息可见于美国专利5,792,935，在此通过引用的方式以其整体明确地并入。
[0123]
如本文所使用的，“植物启动子”是指起始转录的编码序列上游的非翻译核酸序列。植物可以具有响应于某些环境条件的启动子，包括但不限于光响应启动子、胁迫响应启动子、植物激素响应启动子、蔗糖响应启动子、低氧响应启动子或胭脂碱合酶启动子。为了在植物中产生和随后纯化aav和其它病毒或蛋白质，通常期望强组成型启动子。在一些实施方式中，使用的一些强组成型启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒35s启动子、豇豆花叶病毒启动子、opine启动子、泛素启动子、稻肌动蛋白1启动子或玉米醇脱氢酶1启动子。在一些实施方式中，peaq-ht载体用于使用根癌农杆菌(农杆菌渗入)瞬时或稳定地转化植物。该peaq载体使用t-dna内的豇豆花叶病毒启动子序列(具有u162c突变以增强活性)，以在植物中获得高的蛋白表达率而没有外来病毒产生。然而，在其它实施方式中，可以使用不同的植物表达载体，例如pbinplus、ppzp3425、ppzp5025、ppzptrbo、pjltrbo或pby030-2r。美国专利8,674,084中提供了有关peaq载体的更多信息，在此通过引用的方式以其整体明确地并入。
[0124]
如本文所使用的，术语“小植物(plantlet)”是指幼体植物。相对于完全长成的植物，小植物更小，因此更易于处理，并且经历快速的生长和细胞活动。在一些实施方式中，aav的小规模纯化涉及至少1株、2株、3株、4株、5株、6株、7株、8株、9株、10株、15株、20株、25株、30株、35株、40株、45株、50株、60株、70株、80株、90株或100株小植物的使用。在其它实施方式中，aav的更大规模纯化可以扩展至使用至少100株、200株、300株、400株、500株、600株、700株、800株、900株、1000株、2000株、5000株、10000株、20000株、30000株、40000株或50000株植物。
[0125]
如本文所使用的，任何给定物质、化合物或材料的术语“纯度”是指相对于预期丰度的所述物质、化合物或材料的实际丰度。例如，物质、化合物或材料可为至少80％、85％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯净，包括其间的所有小数。纯度可能会受到不想要的杂质的影响，所述杂质包括但不限于核酸、dna、rna、核苷酸、蛋白质、多肽、肽、氨基酸、脂质、细胞膜、细胞碎片、小分子、降解产物、溶剂、运载体、溶媒或污染物，或它们的任意组合。在一些实施方式中，aav产物实质上不含宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、质粒dna、空病毒载体、具有不完全蛋白质组成和寡聚结构的aav颗粒、或污染性病毒(例如非aav、脂质包膜病毒)、热休克蛋白70(hsp70)、乳酸脱氢酶(ldh)、蛋白酶体、污染性非aav病毒、宿主细胞培养组分、过程相关组分、支原体、热原、细菌内毒素和外源因子(adventitious agent)。纯度可以使用以下技术来测量，包括但不限于电泳、sds-page、毛细管电泳、pcr、rtpcr、qpcr、色谱法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫吸附测定(elisa)、光谱分析、uv-可见光谱、红外光谱、质谱、核磁共振、重量法、或滴定，或它们的任意组合。
[0126]
与本领域已知的技术(例如在哺乳动物或昆虫细胞中生产)相比，使用诸如农杆菌渗入的技术在植物或植物材料中生产aav颗粒产生更高的aa v纯度。在一些实施方式中，源自植物的aav颗粒不含动物或哺乳动物细胞组分、动物或哺乳动物特异性病原体，包括病毒、细菌、原生动物和真菌、血清、牛血清、抗生素、或激素或它们的任意组合。
[0127]
如本文所使用的，任何给定物质、化合物或材料的术语“产量”是指相对于预期总量的物质、化合物或材料的实际总量。例如，物质、化合物或材料的产量可为预期总量的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，包括其间的所有小数。在生产的任何步骤期间，产量可受以下的影响：反应或过程的效率、不想要的副反应、降解，输入物质、化合物或材料的质量，或期望的物质、化合物或材料的损失。
[0128]
与本领域已知的技术(例如在哺乳动物或昆虫细胞中生产)相比，使用诸如农杆菌渗入的技术在植物或植物材料中生产aav颗粒产生aav的更高产量。在一些实施方式中，一株4-6周龄的小植物产出至少107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个、10
12
个、10
13
个或10
14
个aav颗粒。
[0129]
本发明使用肯定的语言一般性地在本文中公开，以描述众多实施方式。本发明还包括其中排除全部或部分主题(例如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序)的实施方式。
[0130]
aav颗粒和组分
[0131]
在一些实施方式中，本文公开了包含编码aav2 rep蛋白的序列的核酸分子。在一些实施方式中，rep蛋白包括rep78、rep68、rep52或rep40。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：2-seq id no：11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0132]
在一些实施方式中，本文还公开了包含编码aav2 cap蛋白的序列的核酸分子。在一些实施方式中，cap蛋白包括vp1、vp2或vp3。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：15-seq id no：24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：15具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0133]
在一些实施方式中，本文还公开了包含编码aav2 aap蛋白的序列的核酸分子。在
一些实施方式中，所述序列与seq id no：28-seq id no：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：28具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0134]
在一些实施方式中，本文还公开了包含编码ad5 e4orf6蛋白的序列的核酸分子。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：40-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述序列与seq id no：40具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0135]
在一些实施方式中，本文还公开了重组核酸载体，所述重组核酸载体包含本文公开的核酸分子中的任一种或多种。在一些实施方式中，本文还公开了由本文公开的核酸分子或核酸载体中的任一种所编码的蛋白质。在一些实施方式中，本文还公开了aav颗粒，所述aav颗粒包含本文公开的核酸分子、核酸载体或蛋白质中的任一种或多种。
[0136]
在一些实施方式中，本文还公开了植物细胞，所述植物细胞包含本文公开的核酸分子、核酸载体、蛋白质或aav颗粒中的任一种或多种。在一些实施方式中，本文还公开了包含本文公开的植物细胞中的任一种的植物。在一些实施方式中，所述植物细胞或植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属或玉蜀黍属。在一些实施方式中，所述植物是烟草属物种。在一些实施方式中，所述植物是本氏烟草或普通烟草。
[0137]
在一些实施方式中，本文还公开了来自本文公开的植物细胞或植物中的任一种的叶、茎、花或根。
[0138]
制备方法和用途
[0139]
本文公开了用于在植物中产生aav蛋白的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使植物与包含至少一种重组核酸载体的根癌农杆菌接触，将所述至少一种重组核酸载体转移至所述植物的细胞，在所述植物的细胞中表达aav蛋白，以及任选地从所述植物的细胞中分离aav蛋白。在一些实施方式中，所述至少一种重组核酸载体包含编码aav蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，所述核酸序列经密码子优化用于在植物中表达。在一些实施方式中，所述核酸序列是本文公开的核酸载体中的任一种的部分。在一些实施方式中，多种aav蛋白在相同植物中产生。在一些实施方式中，aav颗粒在植物中产生并且aav颗粒任选地从所述植物中分离。在一些实施方式中，aav颗粒能够感染哺乳动物细胞，任选人细胞，任选hek293t。在一些实施方式中，所述植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属、莴苣属或玉蜀黍属。在一些实施方式中，所述植物是烟草属物种。在一些实施方式中，所述植物是本氏烟草或普通烟草，并且所述核酸序列经密码子优化用于在本氏烟草或普通烟草中表达。在一些实施方式中，所述植物是莴苣属物种。在一些实施方式中，所述植物是莴苣，并且所述核酸序列经密码子优化用于在莴苣中表达。在一些实施方式中，所述植物是大麻属物种。在一些实施方式中，所述植物是大麻，并且所述核酸序列经密码子优化用于在大麻中表达。在一些实施方式中，分离aav蛋白包括离心、过滤和/或色谱法。在一些实施方式中，色谱法是亲和色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或疏水相互作用色谱法。在一些实施方式中，所述至少一种重组核酸载体包含至少一种序列，所述序列与seq id no：2-seq id no：11、seq id no：15-seq id no：24、seq id no：28-seq id no：37
或seq id no：40-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方式中，所述植物产出至少104个、105个、106个、107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个、10
12
个、10
13
个或10
14
个拷贝的aav蛋白。在一些实施方式中，所述植物产出至少10
12
个、10
13
个或10
14
个拷贝的aav蛋白。
[0140]
本文还公开了在植物中产生功能性aav颗粒的方法。在一些实施方式中，所述方法包括用至少一种重组核酸载体转化植物，所述重组核酸载体包含编码aav颗粒的组分或参与aav颗粒组装的组分的核酸序列；使植物在aav颗粒在植物中表达和组装的条件下生长；以及从植物中分离aav颗粒。在一些实施方式中，转化植物的步骤通过农杆菌渗入来完成。在一些实施方式中，编码aav颗粒组分的核酸序列对于所述植物进行密码子优化。在一些实施方式中，所述植物属于烟草属、拟南芥属、茄属、大麻属、荞麦属、稻属、莴苣属或玉蜀黍属。在一些实施方式中，所述植物是烟草属、莴苣属或大麻属的物种。在一些实施方式中，所述植物是本氏烟草、普通烟草、莴苣或大麻。在一些实施方式中，aav颗粒的组分或参与aav颗粒组装的组分包括rep蛋白、cap蛋白、aap蛋白或ad5 e4orf6蛋白或它们的任意组合。
[0141]
本文公开的任何方法中，在一些实施方式中，rep蛋白由包含弱植物kozak序列的核酸序列编码，该弱植物kozak序列增强下游框内多肽的翻译和/或内部甲硫氨酸密码子中的突变以防止隐蔽orf的潜在表达。在一些实施方式中，rep蛋白由与seq id no：1-seq id no：11具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，rep蛋白包含与seq id no：12或seq id no：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽序列。
[0142]
本文公开的任何方法中，在一些实施方式中，cap蛋白由包含弱植物kozak序列的核酸序列编码，该弱植物kozak序列增强下游框内多肽的翻译。在一些实施方式中，cap蛋白由与seq id no：14-seq id no：24具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，cap蛋白包含与seq id no：25或seq id no：26具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽序列。
[0143]
本文公开的任何方法中，在一些实施方式中，aap蛋白由与seq id no：27-seq id no：37具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，aap蛋白包含与seq id no：38具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽序列。在一些实施方式中，ad5 e4orf6蛋白由与seq id no：39-seq id no：49具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码。在一些实施方式中，ad5 e4orf6蛋白包含与seq id no：50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的肽序列。
[0144]
本文公开的任何方法中，分离aav颗粒包括离心、过滤和/或色谱法。在一些实施方式中，色谱是亲和色谱法、离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或疏水相互作用色谱法。在一些实施方式中，从植物中分离出至少104个、105个、106个、107个、108个、109个、10
10
个、10
11
个、10
12
个、10
13
个或10
14
个aav颗粒。在一些实施方式中，从植物中分离出至少10
12
个、10
13
个或10
14
个aav颗粒。在一些实施方式中，aav颗粒能够感染哺乳动物细胞，
任选人细胞，任选hek293t。
[0145]
本文公开的任何方法中，所述方法进一步包括向哺乳动物给予aav颗粒。在一些实施方式中，哺乳动物是人。
[0146]
本文还公开了基因治疗的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向有需要的受试者的细胞给予通过本文公开的方法中的任一种所产生和分离的aav颗粒。
[0147]
本文还公开了用作药物的本文公开的重组核酸载体或aav颗粒。
[0148]
本文还公开了用于用以治疗人的基因疗法中的本文公开的重组核酸载体或aav颗粒。在一些实施方式中，人的疾病是代谢的先天性障碍、酶缺乏症、庞贝氏病、danon病、神经退行性疾病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、运动神经元病、肌营养不良、杜兴氏肌营养不良、视网膜退行性疾病、视网膜色素变性、usher综合征、stargardt病、或遗传性原因的耳聋。
[0149]
本文还公开了用于疾病治疗中的通过本文公开的方法中的任一种所产生的aav颗粒。
[0150]
本文还公开了用于制备药物的通过本文公开的方法中的任一种所产生的aav颗粒。
[0151]
实施例
[0152]
以上讨论的实施方式的一些方面在以下实施例中进行更详细地公开，所述实施例不以任何方式旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将理解的是，许多其它实施方式也落入本发明的范围内，如本文上文和权利要求书中所描述的。
[0153]
实施例1：aav序列
[0154]
aav2 rep、cap和aap和ad5 e4orf6的野生型核酸序列经密码子优化用于在数种植物中表达，所述植物包括但不限于本氏烟草、普通烟草、拟南芥、马铃薯、大麻、荞麦、稻、玉蜀黍、类番茄茄、番茄或莴苣。这些核酸序列在表1中示出。相应的经翻译的蛋白质序列在表2中示出。
[0155]
表1：病毒组分的核酸序列
[0156][0157]
表2：病毒组分的蛋白质序列
[0158][0159]
如本文所示的rep(seq id no：2-seq id no：11)和cap(seq id no：15-seq id no：24)的所有经植物密码子优化的cdna序列的核酸序列经工程化，与野生型(seq id no：1和seq id no：14)的序列相比具有核苷酸差异。经修饰的rep序列以序列gggtttatgactggt(seq id no：54)开始，这形成增强下游框内多肽(即rep52)翻译的弱植物kozak序列，并且经修饰的cap序列以序列gggtttatgactggccgccggttat(seq id no：55)开始，这形成增强下游框内多肽(即vp2、vp3)翻译的弱植物kozak序列。野生型rep翻译为seq id no：12，且野生型cap翻译为seq id no：25。经植物密码子优化的rep翻译为seq id no：13，且经植物密码子优化的cap翻译为seq id no：25。经植物密码子优化的蛋白aap(seq id no：38)和e4orf6(seq id no：50)与野生型相比没有变化。
[0160]
已对rep的经植物密码子优化的序列进行了修饰，以增强四种框内蛋白rep78、rep68、rep52和rep40的表达或表达比率。密码子2(ccg，脯氨酸)被置换(为act，苏氨酸)以产生弱kozak序列，从而增加rep52和rep40的表达率，所述rep52和rep40通过遗漏mrna核糖体扫描以内部起始密码子起始。此外，内部的甲硫氨酸残基(m43、m91、m103和m172)突变为亮氨酸，以消除rep78和rep52的atg起始密码子之间的框内起始密码子，从而防止隐蔽orf的潜在表达。rep52和rep40起始于密码子225。设想的是，这些突变的任一种或多种是任选的。
[0161]
类似地，已对cap的经植物密码子优化的序列进行了修饰，以增强三种框内蛋白vp1、vp2和vp3的表达或表达比率。野生型序列的cap的前6个氨基酸(对应于vp1的前6个氨基酸)是maadgy。对于经植物密码子优化的序列，这些氨基酸被更改为mtaagy以创建弱kozak序列，从而增加vp2和vp3的表达率，所述vp2和vp3通过遗漏mrna核糖体扫描以内部起始密码子起始。vp2在密码子138处以替代的起始密码子acg起始，而vp3在密码子203处以atg起始。设想的是，这些突变的任一种或多种是任选的。
[0162]
虽然用以改善植物中aav产生的对rep和cap的这些核酸和氨基酸改变是以本氏烟草为例的，但它们没有预期问题或限制地也应用于本文列出的其它植物或任何其它遗传上易处理的植物，如对于本氏烟草、普通烟草、拟南芥、马铃薯、大麻、荞麦、稻、玉蜀黍、类番茄茄、番茄和莴苣的经密码子优化和转录上经优化的cdna和蛋白质序列中所体现的。
[0163]
提供了与aav2 rep(图1)、aav2 cap(图2)、aav2 aap(图3)和ad5 e4orf6(图4)的本氏烟草、拟南芥、马铃薯、大麻、荞麦、稻、玉蜀黍、类番茄茄、番茄和莴苣经密码子优化的
cdna序列的核酸序列比对。
[0164]
将必要的经密码子优化的aav2和ad5序列插入peaq-ht植物渗入载体中。将经密码子优化的rep核酸序列和经密码子优化的侧接有itr的转基因(seq id no：51)(其包含由强组成型巨细胞病毒(cmv)哺乳动物启动子驱动的egfp)插入质粒peaq-ht-repopt_avgfpopt中(图6)。将经密码子优化的aap和e4orf6核酸序列插入质粒peaq-ht-ad5orf6-opt_aav2-aap-opt中(图7)。将经密码子优化的cap核酸序列插入质粒peaq-ht_capopt中(图8)。在植物细胞中这三种质粒的同时表达使得产生了完全组装的aav2-cmv-egfp病毒颗粒。
[0165]
实施例2：本氏烟草的繁殖
[0166]
萌发方案
[0167]
1.grodan岩棉立方体(2
”×2”×
1.5”)通过将其浸泡在ph 5.8-6.2的80ppm肥料溶液中5分钟来制备。肥料的一个实例是0.2g/l-2g/l的veg bloom ro/soft(hydroponic research)，补充有以0.25ml/l添加的superthrive维生素溶液。
[0168]
2.将本氏烟草种子放置在制备好的岩棉立方体各自的顶部上。
[0169]
3.将经播种的立方体放入生长托盘中，并在托盘上方放置湿度罩。通风口稍微打开以允许空气交换。
[0170]
4.将托盘和罩置于温室中。如果在阳光下进行萌发，则在罩上使用遮光布。如果在生长灯下进行萌发，则不需要遮光。将光照周期设置为16小时光照和8小时黑暗周期(16l/8d)。在温室条件下，添加了补充光以确保存在足够的光照时长以防止烟草过早开花。
[0171]
5.萌发期间温度保持在75-80华氏度之间。温度绝不应低于65华氏度。当经受低温时幼苗的根系发育会严重受损。
[0172]
6.岩棉的表面始终保持湿润。这是通过喷雾瓶的少量喷雾来实现的。每隔一天，将每个岩棉起始立方体拿起并通过触摸测试水分。如果立方体是干燥的，则用来自喷雾瓶的溶液向立方体喷雾，直到立方体摸上去是湿的。注意不要过度浇水。过度浇水将阻碍幼苗的根系发育。
[0173]
7.当幼苗保持在最佳条件下时，在7-14天内观察到萌发。如果两颗种子都萌发，则选择并移除一颗，使得每个立方体只有一株植物。
[0174]
8.一旦观察到生长，就移除湿度罩。
[0175]
9.立方体保持湿润并用喷雾瓶补给，直到观察到根部从立方体底部伸出。
[0176]
生长和修剪指南
[0177]
当多个根开始从2
”×2”×
1.5”的grodan立方体的底部伸出时，将它们转移到grodan delta 4立方体(3
”×3”×
2.5”)。这些立方体以与萌发方案中所概述的相同的方式来制备。植物在与萌发期间相同的条件下生长。没有使用湿度罩。此步骤通常发生在幼苗开始从岩棉中发芽后7-10天。
[0178]
随着植物开始从萌发阶段过渡到生长阶段，将顶端的生长芽去除。此过程通常也被称为打顶。这将允许大量的营养叶生长。在打顶过程之后，立即进行渗入方案。
[0179]
打顶后观察到大量侧枝的生长(腋芽)、顶芽以及甚至可能是花萼的生长(花芽)。去除这些生长物极其重要，以迫使植物集中生长渗入叶，从而提供感兴趣的叶中的更多的生物质。
[0180]
该过程每天进行，持续至少2周，或者通过测试确定的用以使得在叶内表达病毒衣
壳所需要的无论多长时间。
[0181]
实施例3：用含有aav2-cmv-egfp辅助质粒的根癌农杆菌渗入本氏烟草
[0182]
如制造商建议中所详述的，通过电穿孔将用于产生aav2-cmv-egfp的质粒(peaq-ht-ad5orf6-opt_aav2-aap-opt、peaq-ht_capopt或peaq-ht-repopt_avgfpopt)转化到根癌农杆菌菌株agl1、gv3101或lba4404(intact genomics inc.)中。简而言之，将感受态细胞在冰上解冻，并将待转化的dna(1μl)加入到冰上预冷的管中。当细胞解冻时，将它们添加(25μl)到在冰上冷却的dna，并通过敲击轻轻地混合。将细胞/dna混合物(26μl)在不引入气泡的情况下移液到冷却的1mm电穿孔杯中，并进行电穿孔(指数模式，1800v，25μfd，200欧姆)。立即添加复苏培养基(976μl)，并将复苏培养基中的经电穿孔的细胞转移到eppendorf管，并在30℃下以200rpm摇动孵育3小时，然后铺板到选择性培养基上并在30℃下培养2天。使用sainsbury和lomonossoff的改进方案(plant physiol.2008；148(3):1212-8)将转化有单个辅助质粒的根癌农杆菌菌株制备用于渗入。简而言之，将重组细菌的单菌落接种到含有卡那霉素(100mg/l)和利福平(50mg/l)的液体lb lennox或miller培养基中。将培养物在28℃下摇动培养过夜。通过离心(14,000
×
g持续5min)使细菌沉淀，并在经优化的渗入缓冲液(100mm mes ph 5.6、10mm mgcl2、300μm乙酰丁香酮、5μmα-硫辛酸、0.002％pluronic f-68)中重悬至od
600
＝1.0。然后将培养物在室温下轻轻摇动培养2-4小时。对于小规模实验，使用钝头塑料注射器并施加温和压力将细菌递送至3-6周的小植物的叶片背侧中。对于全植物渗入，将3-6周龄的小植物完全浸没在含有上文生成的转化有辅助质粒的农杆菌菌株的真空干燥器单元内的1l-3l渗入缓冲液中。将干燥器单元密封，并通过施加100mbar的真空1min然后释放真空来渗入小植物。将此重复两次。在这两种情况下，将包含单个辅助质粒的重组细菌菌株在临近渗入前以1:1:1的比例(peaq-ht-ad5orf6-opt_aav2-aap-opt:peaq-ht_capopt:peaq-ht-repopt_avgfpopt)混合。渗入后2天使整株植物经受热休克(37℃持续30min)，以增加瞬时辅助蛋白表达。
[0183]
实施例4：从本氏烟草叶组织中纯化aav2-cmv-egfp
[0184]
使用经灭菌的园艺剪，将经农杆菌渗入的本氏烟草叶片尽可能靠近植物的基部地去除。一经去除，将叶片放入二氧化氯熏蒸室中消毒10分钟，然后在无菌去离子蒸馏水中洗涤3次。按照制造商的说明，通过使用hamilton搅拌器用提取缓冲液(25mm磷酸钠、100mm nacl、50mm抗坏血酸钠、2mm pmsf、ph 5.75)进行均质化来从经消毒的叶片中提取总叶蛋白。通过在4℃下以14,000
×
g离心10min来使植物粗提物澄清。
[0185]
在4℃下孵育1小时后，将匀浆在4℃下以6,000
×
g离心30分钟，以去除叶碎片和丰富的植物光合酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)。然后将上清液在4℃下孵育24小时，并在4℃下以6,000
×
g离心30分钟，以进一步去除孵育期间沉淀的rubisco。该过程重复总计3次以完全去除残留的rubisco。然后用0.22μm过滤器(millipore)过滤上清液。然后使用100kda聚醚砜切向(pes tff)膜(pall corporation)的超滤/渗滤(uf/df)来浓缩澄清的上清液，以去除任何残留的植物来源的小分子，同时保留重组aav2颗粒。然后通过序贯的亲和和离子交换色谱法进一步纯化含有粗raav2颗粒的预过滤澄清上清液。简而言之，将含有raav载体的澄清细胞裂解物上样到avb sepharose hp柱(ge life sciences)上。用洗涤缓冲液(20mm tris hcl，0.5m nacl，ph 8.0)洗涤具有结合的raav颗粒的柱，以去除如通过a
260
和a
280
处的吸光度测量的所有未结合的蛋白质和污染物。然后用低ph缓冲液洗脱结合
vp1/2/3衣壳蛋白。
[0194]
在本氏烟草、莴苣(2重复)和大麻(2重复)中，通过转化到农杆菌中的经植物密码子优化的aav2生产质粒的真空介导渗入来产生aav2-cmv-egfp载体。渗入后五天收获植物叶片，并使用对丰富的植物蛋白的低ph沉淀随后进行如本文所述的离心、0.45μm过滤和浓缩来产生裂解物。使用bca测定对叶裂解物中的总蛋白进行定量，并将不同量的总蛋白(5μg和15μg)上样到4％-12％bis-tris sds-page凝胶上，并在190mv下运行1小时。使用oriole荧光蛋白染色来检测蛋白质，并在biorad凝胶成像仪上使蛋白质可视化。在本氏烟草和莴苣的叶裂解物中检测到对应于vp1、vp2和vp3蛋白的稳健条带(图10a)。
[0195]
纯化后，将来自本氏烟叶裂解物的不同量的总蛋白(5μg、10μg、25μg、50μg)上样到4％-12％bis-tris sds-page凝胶上，并在190mv下运行1小时。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并使用抗aav2 vp单克隆一抗和抗小鼠hrp二抗进行蛋白质印迹以检测aav2 vp1、vp2和vp3衣壳蛋白(图10b)。
[0196]
实施例9：用从叶组织中纯化的aav2-cmv-egfp感染组织培养细胞
[0197]
将hek 293t细胞(atcc#crl-11268)以每孔5
×
104个细胞的密度铺板到12孔培养板的每孔1ml的生长培养基(dmem高葡萄糖，1xglutamax(corning)，10％fbs，1％青霉素-链霉素)中。铺板后6-8小时，用植物产生的raav2-cmv-egfp以每细胞500个至5000个病毒基因组(vg)范围的感染复数(moi)感染各个孔。将被感染的细胞在37℃、5％co2下孵育36小时，然后使用具有适用于egfp的激发和发射滤光片的倒置荧光显微镜来评估每孔的感染性。
[0198]
实施例10：用植物产生的aav2-cmv-egfp处理的hek293t细胞中的egfp表达
[0199]
在普通烟草植物中，通过转化到农杆菌中的经植物密码子优化的aav2生产质粒的瞬时真空介导渗入来产生aav2-cmv-egfp载体。渗入后五天，收获、提取植物叶片，并使用对植物蛋白的低ph沉淀然后进行如本文所述的离心、过滤和浓缩来纯化aav2-cmv-egfp颗粒。将处于特定的感染复数(每hek293t细胞2.7
×
104个、2.7
×
103个或2.7
×
102个病毒基因组)的经纯化和滴定的aav2-cmv-egfp载体直接添加到于4个腔室玻片培养瓶中生长的hek293t细胞。在感染后4天对细胞关于天然egfp表达进行成像。通过荧光显微术观察到hek293t细胞中阳性的、moi依赖性的egfp表达(图11)。
[0200]
实施例11：使用经纯化的aav2颗粒用于基因疗法
[0201]
在前述实施例中产生的重组aav2病毒颗粒是完整的且具有感染性。这些颗粒可用于基因疗法的目的或其它治疗性目的。颗粒可用于离体和体内治疗或应用。颗粒可被肠内给予、胃肠外给予、口服给予、舌下给予、颊部给予、鼻内给予、眼内给予、耳内给予、硬膜外给予、表皮给予、动脉内给予、静脉内给予、门静脉内给予、关节内给予、肌内给予、皮内给予、腹膜内给予、皮下给予或直接向器官、组织、癌症或肿瘤给予。还可以向来自患者或个体的经分离的细胞给予颗粒，所述细胞例如t细胞、自然杀伤细胞、b细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、干细胞、骨髓细胞或造血干细胞。从植物中纯化的颗粒相比通过其它方法(例如从哺乳动物细胞培养物或昆虫细胞培养物)纯化的病毒颗粒提供了改善的安全特性、产量和功效。
[0202]
在先前描述的实施方式的至少一些中，在实施方式中使用的一个或多个要素可以在另一实施方式中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它的省略、添加和修改。所有此类修改和改变旨在落入如所附权利要求所限定的主题的范围内。
[0203]
关于本文中实质上的任意复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以视上下文和/或应用的情况而从复数转换成单数和/或从单数转换成复数。为了清楚起见，可以在本文中明确地阐述各种单数/复数置换。
[0204]
本领域技术人员将理解，一般而言，本文使用的术语、尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的正文)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包含”应解释为“包含但不限于”，术语“具有”应解释为“具有至少”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果期望特定数量的介绍性的权利要求叙述，在权利要求中将明确地叙述此期望，并且在没有此叙述的情况下，不存在此期望。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可包含介绍性短语“至少一个/一种”和“一个或多个/一种或多种”的使用以引入权利要求的叙述。然而，即使当相同权利要求包括介绍性短语“至少一个”或“一个或多个”以及例如“一个/一种”的不定冠词，此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一个/一种”介绍的权利要求叙述将包含此类介绍性权利要求叙述的任何特定权利要求限制于仅包含一个此类叙述的实施方式(例如，“一个/一种”应解释为意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”)；用于介绍权利要求叙述的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确地引述了特定数量的介绍性权利要求叙述，本领域技术人员将认识到，此种引述应该被解释为至少意指所引述的数字(例如，仅有“两个/两种叙述”而没有其它修饰语的叙述意指至少两个/两种叙述，或两个/两种以上的叙述)。此外，在使用类似于“a、b和c等中的至少一个/种”的惯例的情况下，一般此类结构旨在处于本领域技术人员将理解惯例的意义(例如，“具有a、b和c中的至少一个/种的系统”将包括但不限于具有单独的a、具有单独的b、具有单独的c、a和b一起具有、a和c一起具有、b和c一起具有，和/或a、b和c一起具有的系统等)。在使用类似于“a、b和c等中的至少一个/种”的惯例的情况下，一般此类结构旨在处于本领域技术人员将理解的惯例的意义(例如，“具有a、b或c中的至少一个/种的系统”将包括但不限于具有单独的a、具有单独的b、具有单独的c、a和b一起具有、a和c一起具有、b和c一起具有，和/或a、b和c一起具有的系统等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，实际上呈现的两个以上的供选择的术语的任意转折词和/或短语都应被理解为考虑包括所述术语中的一个、所述术语中的任一个、或两个所述术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0205]
此外，在以马库什组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开因此也以马库什组的任何单个成员或成员亚组来进行描述。
[0206]
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的(例如就提供书面描述而言)，本文公开的所有范围还涵盖该范围的任意和所有可能的子范围及子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被认为充分描述并且使得相同的范围分解成至少相等的两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为非限制性实例，本文讨论的各个范围都可以被容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所引述的数字，并涉及如上所讨论的可随后分解为子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括各个单个的成员。因此，例如，具有1-3个物件的组是指具有1个、2个或3个物件的组。类似地，具有1-5个物件的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物件的组等。
[0207]
虽然本文已经公开了多个方面和实施方式，但其它方面和实施方式对于本领域技
术人员来说将是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方式是出于说明的目的而非旨在限制，真实范围和精神由所附权利要求来指示。
[0208]
本文引用的所有参考文献(包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和参考文献)均通过引用的方式以其整体并入本文，并因此成为本技术文件的一部分。对于以引用的方式并入的出版物和专利或专利申请与本技术文件中包含的公开内容相矛盾的范围，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。