抗微生物组合物的制作方法

1.本发明涉及抗微生物组合物、用于微生物组合物制备的方法和微生物组合物的医疗用途。
2.更具体地，本发明涉及可以用于促进伤口愈合的充氧的纳米纤维素组合物，并且因此发现其在治疗伤口中的用途。特别地，该组合物可以用于治疗慢性伤口中存在的生物膜感染。


背景技术：

3.伤口是对皮肤的损伤，伴随着对皮肤组织的血液供应的损害或破坏。这损害了组织再生所需的氧气和营养物质的输送。局部伤口治疗包括伤口敷料，该伤口敷料可以应用于伤口以对微生物的进入提供屏障并保护伤口免受外部环境影响。一些伤口敷料还支持或促进伤口愈合机制。
4.特别地，氧气在伤口愈合中起着至关重要的作用，包括细菌感染的减少、上皮再形成的增加、成纤维细胞的增殖、胶原合成和血管生成。不良血液循环导致的伤口充氧不足会损害正常的伤口愈合，并且可能导致慢性伤口的形成。慢性伤口可能含有需氧和/或厌氧微生物的菌落作为生物膜的一部分。在60％至100％慢性开放性伤口中，将存在生物膜。细菌生物膜是常见的，并且当细菌与身体表面相互作用以形成聚合物膜(也被称为“表多糖(exopolysaccharide)”或“胞外多糖(extracellular polysaccharide)”聚合物)时形成，该聚合物膜覆盖身体表面并且为进一步的细菌定居和增殖提供活菌落。滞留在生物膜中的细菌比保持在浮游状态(即作为单细胞悬浮)的细菌更难去除或杀死，并且可以对许多抗生素具有抗性。
5.先前的研究已经表明，氧气具有抗菌作用。还已经表明氧气可能在减少生物膜形成中起作用。用于慢性伤口治疗的各种基于氧气的疗法方法是已知的。这些包括高压氧气疗法(hbot)和局部氧气疗法(tot)。hbot被认为是用于慢性伤口愈合的主要氧气疗法。它涉及将患者置于压力室中，并且基于暴露和呼吸纯氧气来治疗，纯氧气以高于环境压力的压力被输送。然而，这种治疗需要专门的设备和技术娴熟的的人员，这导致医疗保健系统的高成本。tot是通过包裹患者肢体的套管实现的，向该套管供应氧气并施加略高于大气压的压力。然而，对于局部氧气的吸收深度以及因此对其功效存在争议。
6.其他治疗伤口的方法包括使用充氧的敷料(oxygenated dressing)。这些对于氧气疗法是廉价选项，然而，目前市场上的产品数量有限。充氧的敷料主要以氧气气泡的形式并入氧气，或者含有在使用时产生氧气的组分。此类产品的实例包括oxyband
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、oxygenesys
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和oxyzyme
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敷料。
7.oxyband
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敷料(美国明尼苏达州的oxyband technologies)使用定向可渗透的气体释放储器为愈合伤口提供高浓度纯氧的局部输送。氧气被储存在封闭的上层和下部透氧膜之间的储器中，该储器允许敷料用氧气使伤口流体过饱和(lairet等人,《烧伤护理与研究杂志(j.burn care res.)》35(3):214-8,2014；lairet等人,《军事卫生服务研究研讨会
摘要(abstract at the military health services research symposium)》，2012；以及hopf等人,《海底和高压医学学会年度科学会议摘要(abstract of the undersea&hyperbaric medical society annual scientific meeting)》，2008)。oxygenesys
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敷料包含聚丙烯酸酯基质，该基质形成封装氧气的闭孔泡沫结构。基质的泡沫孔的壁含有溶解氧。当敷料被渗出物、盐水或水润湿时，敷料内的气态氧开始溶解到液体中，但是氧的释放速率较低，并且仅达到15mg/l(参见美国专利第7,160,553号)。oxyzyme
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是酶活化的水凝胶敷料系统，它包含两个相互层叠的聚磺酸盐片状水凝胶。在敷料中还含有氧化酶、葡萄糖和碘化物。当将其从包装中取出并与伤口接触时，顶层中的氧化酶在与空气中的氧气接触时以及通过在敷料的两层之间进行的接触而被激活。酶与氧气的反应在敷料中产生过氧化氢，当它到达面向伤口的表面时，通过与敷料的碘组分的相互作用被转化为溶解氧(ivins等人,《英国伤口(wounds uk)》，第3卷，第1期，2007；和lafferty等人,《英国伤口》，第7卷，第1期，2011)。
8.充氧的敷料代表了在高压氧舱中向伤口环境输送局部氧气的改进，并且在病例研究中已经显示了令人鼓舞的结果(参见，例如lairet等人，2014；lairet等人，2012；hopf等人，2008；ivins等人，2007；和lafferty等人，2011(所有如上所述)；roe等人，《外科研究杂志(journal of surgical research)》159:e29-e36,2010；zellner等人，《国际医学研究杂志(journal of international medical research)》第43卷(1),93-103,2014；和kellar等人，《美容皮肤病学杂志(journal of cosmetic dermatology)》12:86-95,2013)。然而，这些产品的氧气浓度/可用性和氧气稳定性的文献资料是有限的，并且这些产品没有被广泛使用。
9.最近的研究已经表明，与将组织直接暴露于氧气相比，溶解氧更有效地扩散和穿透组织(参见例如roe等人,2010(如上)，st
ü
ker，《生理学杂志(j.physiol.)》538(3):985-994,2002；atrux-tallau等人，《皮肤药理学和生理学(skin pharmacol.physiol.)》22:210-217,2009；reading等人，《国际化妆品科学杂志(int.j.cosmetic sci.)》35:600-603，2013；和charton等人，《药物设计开发和疗法(drug design,devel.and ther.)》8:1161-1167,2014)。现有的疗法都不能将高水平的溶解氧直接输送到伤口组织。在大多数情况下，它们以气体的形式输送氧气，而氧气必须在溶解(例如在伤口渗出物或其他细胞液中)后才能发挥作用。这限制了治疗的功效。尽管oxygenesys
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敷料在覆盖泡沫基质的壁的水分中含有一些溶解氧，但氧气的释放速率最高仅达到15mg/l。因此，能够以溶解形式直接向组织提供高水平氧气的其他治疗将有益于在伤口治疗中使用。
10.纳米结构化的纤维素(“纳米纤维素”)是熟知的材料，该材料可以由各种纤维素来源诸如木浆生产。纤维素纳米原纤维(“cnf”)是一种纳米纤维素。这些包含具有高纵横比与纳米级宽度(即直径)和微米级长度的纳米级纤维原纤维。原纤维可以通过各种机械方法诸如高速冲击均化、研磨或微流化从含纤维素的材料诸如木基纤维中分离出来。
11.cnf材料已经被建议用于生物医学领域的各种用途。这包括用作用于组织再生的支架、用作伤口敷料、用作用于抗微生物组分的载体和用作用于3d打印的生物油墨。在此类材料的生产中，已经提出化学预处理方法诸如2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基(tempo)介导的氧化来调整其性能。tempo-cnf在生理ph值下具有带负电荷的羧基。在tempo介导的氧化期间也产生一小部分醛。当在水中以低浓度提供时，tempo-cnf形成具有高粘度的凝胶。这
种凝胶包含排列在水凝胶网络中的纳米原纤维，该水凝胶网络具有良好的保水能力和类似于软组织质地的机械性能。这与它们的抗微生物活性和形成半透明结构的能力一起，已经导致它们在伤口敷料材料的开发中建议的用途(参见powell等人，《碳水化合物聚合物(carbohydrate polymers)》137(10):191-197,2016；和jack等人，《碳水化合物聚合物》157:1955-1962,2017)。
12.此前，已经证明凝胶形式的tempo-cnf抑制伤口病原体铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的生长(powell等人，2016；和jack等人，2017-均如上)。tempo-cnf凝胶的抗微生物抑制被发现是浓度依赖性的，即浓度越高，对铜绿假单胞菌的生长的抑制越高。这部分地归因于细菌的流动性的限制(jack等人，2017-如上)。这已经在最近的研究中得到证实，其中来自同一纸浆纤维的tempo-cnf抑制了食物病原体蜡状芽孢杆菌(b.cereus)、维罗毒素大肠杆菌(verotoxigenic e.coli)、单核细胞增生李斯特菌(l.monocytogenes)和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)的细菌游动潜力(silva等人，《材料科学杂志(j.mater.sci.)》54(18),12159-12170,2019)。然而，迄今为止，尚未认识到cnf材料的抗微生物活性可能受其表面性质的影响。
13.对于可以用于治疗伤口，尤其是与生物膜感染相关的慢性伤口的替代材料的需求仍然存在。特别地，需要提供划算治疗的材料，这些材料易于使用，并且可以用于有效地治疗伤口，而对被治疗的受试者(例如患者)造成的不便最小。


技术实现要素：

14.发明人现在已经发现cnf材料的抗微生物活性取决于它们的表面性质并且可以通过增加它们的表面电荷来增强。当作为水溶液中的低浓度分散体提供时，他们还发现这类材料可以被有效地充氧以进一步增强它们的抗微生物活性。因此，本发明人提出了包含具有高表面电荷的纤维素纳米原纤维的充氧的纳米纤维素基组合物以及此类组合物在治疗伤口、特别是慢性伤口中的用途。
15.本文所公开的组合物包含具有高表面电荷的纤维素纳米原纤维并且被氧化以使得它们具有高水平的溶解氧。它们可以以“即用(ready-to-use)”形式提供，或者它们可以在使用时制备。例如，组合物可以作为充氧的“液体”(其包括增稠的液体或“粘性”液体)提供，或者它们可以以包含带电荷的纤维素纳米原纤维的充氧的凝胶(即“水凝胶”)的形式提供。这类组合物可以直接用于伤口部位，或者它们可以被并入到合适的伤口覆盖物，例如绷带、纱布、贴片或吸收垫等中。充氧的凝胶也可以被3d打印以用作伤口敷料，或者这类凝胶可以在使用时由纳米原纤化的纤维素气凝胶制备。
16.由于它们的抗微生物活性，该组合物特别适用于治疗感染的伤口，并且可以通过直接应用到受影响的组织或通过并入到旨在应用于所需的目标部位的合适的伤口覆盖物中而被容易地递送到伤口部位。例如，组合物可以被提供在伤口覆盖物例如绷带、纱布、贴片或吸收垫中，或作为伤口覆盖物例如绷带、纱布、贴片或吸收垫的组分提供，以用于应用于目标部位。
17.在一个方面中，本发明提供了一种抗微生物组合物，所述抗微生物组合物包含分散在水溶液中的带电荷的纤维素纳米原纤维，其中所述溶液具有至少20mg/l的溶解氧含量。
18.在另一方面中，本发明提供了如本文所述的用作抗微生物剂的组合物，例如用于抑制至少一种伤口病原体的生长。
19.在另一方面中，本发明提供了一种用于制备如本文所述的组合物的方法，所述方法包含以下步骤：(i)提供带电荷的纤维素纳米原纤维在水溶液中的分散体；以及(ii)对所述分散体进行充氧。
20.在另一方面中，本发明提供了一种用于治疗伤口的方法，所述方法包含将有效量的如本文所述的抗微生物组合物应用于所述伤口的步骤。任选地，所述方法可以进一步包含在应用所述抗微生物组合物之后应用伤口覆盖物(在本文中被称为“二次敷料”)的步骤。
21.在另一方面中，本发明提供了如本文所述的抗微生物组合物在制备用于治疗伤口的方法中的药物中的用途。
22.在另一方面中，本发明提供了用于治疗伤口的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)灭菌的、密封的容器或包装，所述容器或包装容纳有如本文所述的抗微生物组合物的；和(b)伤口覆盖物，例如伤口敷料、绷带、纱布、贴片或吸收垫。该试剂盒可以另外包含用于在治疗伤口中使用该试剂盒的组分的打印的说明书。
23.在另一方面中，本发明提供了一种用于治疗伤口的试剂盒，所示试剂盒包含：(a)灭菌的、密封的容器或包装，所述容器或包装容纳有包含带电荷的纤维素纳米原纤维的气凝胶；和(b)具有至少20mg/l的溶解氧含量的充氧的水性液体(例如充氧的水或充氧的盐水)。所述试剂盒可以另外包含用于混合组分从而形成充氧的水凝胶及其在治疗伤口中的用途的打印的说明书。
24.在另一方面中，本发明提供了一种伤口覆盖物，例如绷带、纱布、贴片或吸收垫，其中并入有如本文所述的抗微生物组合物。
25.在另一方面中，本发明提供了一种包含带电荷的纤维素纳米原纤维的水凝胶形式的伤口敷料，其中所述水凝胶具有至少20mg/l的溶解氧含量。伤口敷料可以是3d打印的水凝胶。
具体实施方式
26.定义：
27.术语“纳米原纤维纤维素”和“纤维素纳米原纤维”在本文中可互换使用，并且是指分离的纤维素原纤维或衍生自纤维素材料的原纤维束。纤维素原纤维通过高的纵横比(即长度：直径)来表征。它们的长度可能超过1μm，但它们的直径在亚微米范围内，即小于1μm。通常，它们的直径将为纳米级。当分散在水性溶剂(例如水)中时，纤维素原纤维或原纤维束具有在低浓度下形成粘弹性凝胶(即水凝胶)的能力。如将理解的，用于凝胶形成的实际浓度将取决于其他因素，例如纳米原纤纤维素的精确性质，例如其原纤化程度。
28.术语“氧化的纤维素纳米原纤维”和“氧化的cnf”在本文中可互换使用，并且是指表面氧化的纤维素纳米原纤维，其中存在于天然纤维素材料中的至少一部分伯羟基基团已经被氧化成醛和/或羧基基团。“氧化的纤维素纳米原纤维”包括但不限于tempo介导的氧化的纤维素纳米原纤维(在本文中也被称为“tempo-cnf”)。
29.如本文中所使用的，术语“凝胶”是指介于固体和液体之间的物质形式。它是自保持但可变形的。凝胶通常在环境温度下，即在低于约25℃，优选地低于约20℃的温度下抗流
动。在流变学术语中，“凝胶”可以根据其储能模量(或“弹性模量”)g'(其表示材料的弹性性质(能量储存))和其损耗模量(或“粘性模量”)g"(其表示材料的粘性性质(能量损失))定义。它们的比值tanδ(等于g"/g')，也称为“损耗角正切”，用于衡量应力和应变彼此异相的程度。“凝胶”具有大于其储能模量(g')的损耗模量(g")和小于1的损耗角正切(tanδ)。
30.当与凝胶相关使用时，术语“粘弹性”是指凝胶的特征在于流变性质，其部分地类似于粘性流体的流变行为，并且也部分地类似于弹性固体的流变行为。
31.当与凝胶相关使用时，术语“水凝胶”是指凝胶是亲水的并且含有水。
32.如本文所使用的，术语“气凝胶”是指衍生自凝胶的多孔材料，其中凝胶的液体组分被气体(通常是空气)替代。“气凝胶”是具有极低密度的固体。
33.除非另有定义，本文使用的术语“液体”是指自由流动并保持恒定体积的物质。它包括流动的稠化液体和粘性液体。“液体”通过将具有大于其储能模量(g')的损耗模量(g")和大于1的损耗角正切(tanδ)。
34.当与物质相关使用时，术语“粘度”是物质在经受应力时抵抗流动的程度。粘度可以指的是使用布鲁克菲尔德粘度计测量的布鲁克菲尔德粘度。例如，可以使用在以下参数下操作的布鲁克菲尔德dv2trv粘度计测量粘度：评估的物质的体积：200ml；温度：23℃
±
1℃；心轴：v-71；速度(剪切速率)：10rpm。
35.如本文所使用的，术语“伤口覆盖物”是指旨在应用于身体组织或身体表面并且旨在保持在适当位置以帮助伤口愈合的任何材料。它涵盖诸如伤口敷料、绷带、纱布、贴片、膏药、吸收垫等的材料。在一些实施例中，本发明涉及这样的伤口覆盖物，其并入如本文所述的充氧的纳米纤维素组合物(例如，以液体、增稠的液体或凝胶形式)。在其他实施例中，这类伤口覆盖物可以在应用如本文所述的抗微生物组合物之后被应用到伤口部位。
36.术语“伤口”包括皮肤中的任何缺陷或破坏，其可能由物理、化学或热损伤引起或由潜在的医学或生理学状况导致。伤口可以以多种方式引发，例如它可以由外伤、割伤、溃疡、烧伤、手术切口等诱发。伤口可以被分为急性或慢性。
37.术语“细菌生物膜”是指包含在由细菌产生并附着于体表的细胞外聚合物物质(eps)基质中的细菌的群落。
38.当与物质相关使用时，术语“抗微生物的”是指该物质可以杀死、抑制或控制至少一种微生物的生长，例如细菌有机体，例如但不限于以下中的任何一种：铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、表皮链球菌(streptococcus epidermis)和大肠杆菌。
39.在一个方面中，本发明提供了包含分散在水溶液中的带电荷的纤维素纳米原纤维的抗微生物组合物，其中所述溶液具有至少20mg/l的溶解氧含量。
40.取决于纤维素纳米原纤维的浓度和它们的原纤化程度，这类组合物可以以液体(例如粘性液体)的形式提供，或者它们可以作为水凝胶提供。作为水凝胶，这些包含被捕获或固定在由纤维素的原纤维提供的三维网络中的水。在本文公开的组合物中，水充当氧的载体。
41.本文公开的组合物是抗微生物的，并且当应用于伤口时，可以帮助愈合、再生或恢复正常代谢状态。它们可以方便地应用于目标组织，无论其大小和位置如何，并且能够在与身体组织接触的点直接释放溶解氧。所述组合物可以原样使用并且因此被直接应用于身体
组织，或者这些组合物可以与其他伤口覆盖物结合使用。例如，它们可以被并入到旨在应用于伤口的合适的“伤口覆盖物”中或形成该“伤口覆盖物”的一部分。在一些情况下，抗微生物组合物可以被提供在伤口敷料、绷带、纱布、贴片、膏药、吸收垫或任何其他适合应用于目标部位的伤口覆盖物中或作为伤口敷料、绷带、纱布、贴片、膏药、吸收垫或任何其他适合应用于目标部位的伤口覆盖物的组分提供。
42.抗微生物组合物可以单独或与其他伤口覆盖物一起方便地应用于所需的目标部位。它们能够与目标组织密切接触，并且可以以受控的方式递送活性氧，以有效地杀灭、抑制或控制微生物的生长。它们的抗微生物活性通过带电荷的纤维素纳米原纤维被进一步增强，在凝胶的情况下，纤维素纳米原纤维形成水凝胶结构的三维网络。具体地，发明人已经发现，在纤维素纳米原纤维具有高表面含量的羧酸和/或醛基团的情况下，抗微生物活性得到增强，例如表面羧酸基团含量为至少约1000μmol/g纤维素，优选地至少约1400μmol/g纤维素，和/或表面醛基团含量为至少约100μmol/g纤维素，优选地至少约200μmol/g纤维素。由于它们的水含量，本发明的组合物还有效地用于润湿目标组织。
43.本文所述的组合物包含分散在含有高水平的溶解氧的水溶液中的纤维素纳米原纤维。如将理解的，水溶液将是生理上可耐受的。水溶液含有水，但不一定是纯水，并且可以含有其他生理上可耐受的组分。例如，水溶液可以是盐水，例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
44.存在于本发明的组合物中的纤维素纳米原纤维是表面带电荷的。它们可以携带正表面电荷或负表面电荷，但优选地它们携带负电荷，即它们是阴离子的。在一个实施例中，纤维素纳米原纤维是“氧化的”，即这些纤维素纳米原纤维已经通过将存在于天然纤维素材料中的至少一部分伯羟基基团氧化成羧基基团和/或醛基团而被化学改性。
45.通常在纤维状纤维素原料崩解成纳米原纤维之前，即在“原纤化”之前，对其进行化学改性。例如，当作为在水中的分散体提供时，即当它作为“纸浆”提供时，可以对纤维状纤维素原料进行化学改性。然后可以使氧化的纤维素纸浆经受如本文所述的原纤化。
46.化学改性涉及通过一个或多个化学反应来改变纤维素的化学结构。用于本发明的纤维素材料可以被氧化以修饰纤维素分子的官能团。具体而言，氧化对于将纤维素的一部分伯羟基基团转化为醛和/或羧基基团是有效的。氧化还包括其中一部分羟基基团被转化为羧甲基基团的羧甲基化，以及其中一些或全部羟基基团被磷酸化的磷酸化。
47.化学改性的程度将取决于用于预处理的化学品的选择、其浓度和反应条件。化学改性的程度可以根据需要而变化。如本文所述，更高水平的氧化可能有利于增强抗微生物活性。
48.纤维素的羟基基团可以被催化氧化，例如使用杂环硝酰基化合物。可以使用能够催化纤维素中c6碳的羟基基团的选择性氧化的任何杂环硝酰基化合物。在一个实施例中，杂环硝酰基化合物可以是2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基自由基(通常被称为“tempo”)或其任何衍生物(参见isogai等人，《纳米尺度(nanoscale)》3:71，2011)。在一个实施例中，用于本发明的纤维素是“tempo-氧化的纤维素”。
49.合适的氧化剂包括但不限于次卤酸盐(例如次氯酸钠)、亚氯酸钠和高碘酸盐。也可以使用这类药剂的组合。次卤酸盐(例如次氯酸钠)适用于生产具有一定比例的羧基基团和醛的氧化的纤维素材料。在其中需要将基本上所有的羟基基团转化为羧基基团的情况下，可以使用亚氯酸钠。例如，它可以在tempo介导的氧化后用于将剩余的醛基团转化为羧
基基团。通过在c2和c3之间的选择性裂解，高碘酸盐氧化提供了沿着聚合物链具有一定比例的2,3-二醛单元的改性的纤维素材料(参见liimatainen等人，《生物大分子(biomacromolecules)》5(5):1983-1989,2004)。为了提供所需的电荷增加，高碘酸盐可以与其他氧化剂(例如亚氯酸钠)结合使用，或与羧甲基化或tempo介导的氧化结合使用以在c6位置中引入羧基基团(参见chinga-carrasco等人，《生物材料应用杂志(journal of biomaterials applications)》29(3):423-432,2014)。在tempo介导的氧化中使用次卤酸盐通常优选用于制备用于本发明的纳米纤维素材料。用于羧甲基化和磷酸化的方法在本领域中是熟知的并且描述于例如等人，langmuir 24:784-795,2008,chinga-carrasco等人，《生物材料应用杂志》29(3)：423-432,2014，和ghanadpour等人，《生物大分子》16:3399-3410,2015(其内容通过引用并入本文)中。
50.作为氧化的结果，纤维素β-d-吡喃葡萄糖单元的伯羟基基团(即c6羟基基团)被选择性地氧化成羧酸基团。一些伯羟基基团可能仅被部分地氧化为醛基团。纤维素材料中羧酸基团的含量可以通过本领域已知的方法来确定，例如使用如saito等人在《生物大分子》5(5):1983-1989,2004描述的电导滴定法。醛基团的含量可以类似地使用本领域熟知的方法来确定，例如通过诸如jausovec等人在《碳水化合物聚合物》116:74-85,2015中描述的分光光度法。纤维素中的羧酸和醛水平可以用μmol/g纤维素材料来定义。
51.可以实现纤维素材料的不同氧化程度，例如使用不同的化学预处理剂和/或通过改变这类药剂的浓度。如本文所证明的，发明人已经惊奇地发现纳米纤维素材料中电荷的增加(即氧化程度的增加)可以影响其抗微生物性质。
52.在一些实施例中，氧化的纤维素的羧酸含量可以在400μmol/g纤维素至1750μmol/g纤维素，优选地700μmol/g纤维素至1700μmol/g纤维，例如800μmol/g纤维素至1600μmol/g纤维，900μmol/g纤维素至1600μmol/g纤维，或1000μmol/g纤维素至1600μmol/g纤维素的范围内。在某些实施例中，羧酸含量可以是至少约1000μmol/g纤维素，优选地至少约1400μmol/g纤维素，例如它可以在1400μmol/g纤维素至1700μmol/g纤维素，例如1500μmol/g纤维素至1600μmol/g纤维素的范围内。在某些实施例中，氧化的纤维素材料的羧酸含量可以大于900μmol/g纤维素，优选地大于1000μmol/g纤维素，例如大于1400μmol/g纤维素。
53.在一些实施例中，氧化的纤维素的醛含量可以在10μmol/g纤维素至1700μmol/g纤维素，优选地100μmol/g纤维素至400μmol/g纤维素，例如200μmol/g纤维素至400μmol/g纤维素的范围内。在某些实施例中，醛含量可以小于300μmol/g纤维素，例如小于250μmol/g纤维素。在其他实施例中，醛含量可以是至少300μmol/g纤维素。
54.在某些实施例中，氧化的纤维素可以具有至少约1400μmol/g纤维素(例如1400μmol/g纤维素至1700μmol/g纤维素或1500μmol/g纤维素至1600μmol/g纤维)的羧酸含量，以及小于300μmol/g纤维(例如小于250μmol/g纤维素)的醛含量。
55.化学改性后纤维素分子中羧酸基团的存在(以及因此在生理ph下的阴离子电荷)也可能是有益的，因为它降低了纤维素纤维之间的氢键程度，因此有助于崩解过程(即原纤化)以生产纳米原纤维纤维素。它还提供了一种即使在低浓度下也具有高粘度的纳米原纤纤维素材料。
56.在一个实施例中，原始纤维素材料可以在氧化之前经受预处理。例如，它可以在碱性材料如氢氧化钠的存在下进行高压灭菌。这类处理用于去除内毒素(即脂多糖，lps)并且
可以如nordli等人在《碳水化合物聚合物》150:65-73,2016(其全部内容通过引用并入本文)中所述进行。lps的含量通常将低于约100个内毒素单位/g纤维素，这对于伤口敷料应用被认为是超纯的。碱处理也用于降低纤维素的木质素含量。这通常将小于纤维素材料的1重量％。
57.纳米原纤纤维素可以由任何来源的原始纤维素材料制备，尽管通常它将由植物来源的纤维素材料制备。它可以衍生自任何含有纤维素的植物材料，例如衍生自木材或植物。其他纤维素原材料包括衍生自细菌发酵工艺的那些。纤维素也可以从藻类或被囊类动物(tunicates)中获得。
58.在一个实施例中，植物来源的纤维素材料是木材。木材可以从任何软木树或硬木树中获得。适合的软木树包括云杉、松树、冷杉、落叶松和铁杉。适合的硬木树包括桦树、白杨、杨树、桤木、橡树、山毛榉、金合欢和桉树。也可以使用来自软木树和硬木树的木材的混合物。
59.在一个实施例中，含纤维素的材料从木材衍生的纤维状材料中获得。通常，它将衍生自木浆，即衍生自木材衍生的纤维状材料在水中的组合。木浆是通过从木材中化学或机械分离纤维素纤维而形成的。含纤维素的材料可以从软木纸浆中获得，例如从松木衍生的纸浆中获得。在一个实施例中，软木可以是辐射松(pinus radiata)，也被称为蒙特利松(monterey pine)或辐射松(radiata pine)，它是快速生长的中等密度软木。在另一个实施例中，它可以是樟子松(pinus sylvestris)。在另一个实施例中，软木可以是云杉，例如云杉属物种(picea species)。在另一个实施例中，纤维素材料可以从硬木纸浆中获得。
60.原始纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和少量的木质素组成。纤维素材料可以通过牛皮纸和/或亚硫酸盐工艺获得。在一些实施例中，可以对天然纤维素材料进行预处理以便(完全或部分地)去除诸如木质素的基质材料以提供纯化的纤维素材料。漂白的木浆是这类纯化的材料的实例。漂白可以使用常规漂白方法(例如无元素氯(ecf)工艺或完全无氯(tcf)漂白工艺)进行。
61.纤维素的原纤化以产生纤维素纳米原纤维可以使用已知的方法进行，例如如本文所述的化学改性的纤维素纤维(例如纸浆纤维)的水性分散体的均质化。即使在非常低的浓度下，所得到的纤维素纳米原纤维的分散体也是稀释的粘弹性水凝胶。
62.在纳米原纤维纤维素的制备中，纤维素纤维被崩解以产生具有亚微米直径的原纤维。例如，这些可以具有在纳米范围内的直径。
63.崩解方法包括在水的存在下纤维素材料的机械崩解。机械崩解可以涉及纤维状纤维素材料的研磨、压碎或剪切或这些的任何组合。它可以使用已知的设备例如均化器、流化器(例如微流化器)、研磨机等进行。在一个实施例中，可以使用其中纤维状材料在压力下经受均质化的均化器进行崩解。在压力下迫使纤维状材料通过狭窄的开口导致速度的增加，从而导致剪切力的增加，这导致单独的原纤维或原纤维束与纤维素材料分离。在适当的情况下，可以进行几个阶段的机械崩解以便达到所需的原纤化程度。例如，当使用均化器时，可能需要多次通过均化器。可以用于实现原纤化的均化器的实例是rannie15型12.56x均化器。
64.在原纤化之后，所得的纤维素纳米原纤维或纳米原纤维束的特征在于高的纵横比(即长度：直径)。它们的长度可能超过1μm，但它们的直径在亚微米范围内，即小于1μm。纳米
原纤维或纳米原纤维束的精确尺寸和尺寸分布将取决于原始纤维素材料的性质和崩解(即原纤化)方法，并且可以在一定程度上有所不同。纤维素的化学改性也可能影响原纤维的尺寸和原纤维的尺寸分布。例如，tempo介导的氧化可以产生具有减小的长度和/或减小的直径的原纤维或原纤维束。精确的尺寸不被认为是本发明的关键。
65.通常，纳米原纤维或纳米原纤维束的直径将为纳米级，例如小于20nm。例如，它们的平均直径可以在3nm至20nm，优选地5nm至20nm，例如5nm至10nm的范围内。tempo-cnf可以具有减小的直径，例如这些tempo-cnf可以具有1nm至10nm范围内的平均直径。
66.通常，纳米原纤维或纳米原纤维束的平均长度将在5μm至10μm的范围内。例如，它可以在1μm到5μm，例如0.5μm到1μm，或0.2μm到0.5μm的范围内。
67.原纤维的尺寸和尺寸分布可以使用已知的技术确定，例如通过显微镜确定。长度和直径可以通过分析来自扫描电子显微镜(sem)、透射电子显微镜(tem)或原子力显微镜(afm)的图像来确定。原子力显微镜特别适合于测量原纤维的直径，并且可以例如使用在环境温度下操作的veeco多模v进行，其中afm尖端具有约0.4nm-1
的弹簧常数。tem可以用于测量长度。
68.纳米原纤维纤维素材料可以根据其分散于其中的水溶液的粘度来表征。可以使用常规的方法和设备来测量粘度。粘度可以指的是使用布鲁克菲尔德粘度计测量的布鲁克菲尔德粘度。许多布鲁克菲尔德粘度计是市售的，并且可以用于测量粘度。例如，可以使用布鲁克菲尔德粘度计dv2trv。当使用该设备时，可以使用以下参数：评估的物质的体积：200ml；温度：23℃
±
1℃；叶片心轴：v-71；速度(剪切速率)：10rpm。
69.本文所述的组合物的粘度可以被适当地调节，例如通过改变纳米原纤维纤维素材料的浓度、其原纤化程度等。在一个实施例中，组合物的粘度可以被确定为布鲁克菲尔德粘度。通常，组合物的布鲁克菲尔德粘度可以在20mpa.s至20,000mpa.s的范围内(当在10rpm下和在23℃的温度下测量时)。
70.在一个实施例中，纤维素纳米原纤维在水溶液中的0.2重量％分散体可以提供具有在20mpa至600mpa.s、优选地100mpa至200mpa.s、例如200mpa至400mpa或400mpa至600mpa.s的范围内(当在10rpm，23℃下测量时)的布鲁克菲尔德粘度的组合物。当作为在水溶液中的0.4重量％分散体提供时，纤维素纳米原纤维可以提供具有在1500mpa至9000mpa.s、优选地1500mpa至6000mpa、例如3000mpa至6000mpa.s的范围内(当在10rpm，23℃下测量时)的布鲁克菲尔德粘度的组合物。在约0.5重量％的浓度下，纤维素纳米原纤维在水性组合物中的分散体可以提供在10,000mpa至20,000mpa.s、优选地10,000mpa至15,000mpa或15,000mpa至20,000mpa.s的范围内(当在10rpm，23℃下测量时)的布鲁克菲尔德粘度。
71.作为用于生产纤维素纳米原纤维的方法的结果，所得的纤维素材料还可以包含一定比例的非纳米原纤维纸浆，即残留的纤维素纤维。然而，如果存在，它通常将作为小部分存在。可以存在于本文所述的组合物中的非纳米原纤维纸浆的量可以在1重量％至20重量％，例如1重量％至5重量％的范围内(基于纤维素的总干重)。如本文所指的总纤维素是指材料中总纤维素的干重。在一个实施例中，该材料将基本上不含非纳米原纤维纸浆。例如，非纳米原纤维纸浆的量可以是0重量％。
72.基于组合物的总重量，本文所述的组合物中纤维素纳米原纤维的含量可以在0.1
重量％至1.0重量％，优选地0.2重量％至0.8重量％，例如0.3重量％至0.5重量％的范围内。在一些实施例中，它可以在0.5重量％至1.0重量％的范围内。
73.根据本发明的材料包含如本文所述的化学改性的纳米原纤维纤维素。然而，它们也可以含有一定比例的未改性的纳米原纤维纤维素。
74.如将理解的，取决于用于生产纳米纤维素原纤维的纤维素原材料，本文所述的材料还可以包含其他非纤维素组分。例如，这些可以包含其他木材组分，例如木质素或半纤维素。此类组分的性质和量将取决于用于制备纳米纤维素原纤维的纤维素来源和方法。当存在时，这些将以相对低的量存在，例如基于组合物的总重量小于约1重量％的木质素和小于约20重量％的半纤维素。
75.本文公开的组合物含有溶解的分子氧，并且能够在应用于伤口后将其释放到目标组织。由于这旨在起到活性物质的作用并且向组织输送一定水平的氧气，因此应相应地选择其浓度。精确的氧气水平将取决于多种因素，包括组合物的精确性质(例如，可能存在的任何其他组分及其在氧气存在下的稳定性)、任何治疗的预期用途和持续时间、组合物将被施用的患者等。本领域技术人员可以根据需要容易地确定合适的水平。
76.本文所述的组合物包含至少约20mg/l溶解氧。在一些实施例中，它们可以包含20mg/l至100mg/l氧、20mg/l至70mg/l、20mg/l至60mg/l、25mg/l至50mg/l或30mg/l至40mg/l。包含升高水平的氧(例如至少25mg/l或至少30mg/l)的组合物是特别优选的。在一组实施例中，溶解氧水平可以在20mg/l至55mg/l，例如25mg/l至50mg/l、25mg/l至40mg/l或30mg/l至35mg/l的范围内。氧含量可以使用orion rdo氧计(orion a323，美国马萨诸塞州的赛默飞世尔科技(thermo scientific))确定。除非另有说明，否则本文提及的所有氧含量均在环境温度(例如在18℃至23℃范围内)下测量。应当理解，本文提及的所有氧含量都是在大气压下测量的。
77.伤口愈合过程涉及多个重叠阶段，其中各种细胞和基质组分共同作用以重建受损组织的完整性并替代丢失的组织。这些通常被认为涉及：止血、炎症、迁移、增殖和成熟阶段。急性缺氧刺激血管生成，而升高的组织氧水平刺激上皮形成和成纤维细胞。在伤口愈合的不同阶段期间可以使用不同浓度的氧气。
78.存在于根据本发明的组合物中的氧被溶解在生理上可耐受的水性介质例如生理盐溶液(例如盐水)或水中。通常这将是水。
79.许多不同的方法可以用于制备根据本发明的抗微生物组合物。考虑到诸如组分的性质和最终产品的形式(例如它是液体还是凝胶)等因素，可以改变精确的制备方法。充氧(oxygenation)的步骤可以在制备最终的含纤维素的组合物之前针对组合物的一种或多种液体组分进行，或者可以针对最终组合物进行。如将描述的，可以使用已知的充氧方法对增稠的液体或凝胶(其中这些是可流动的)进行充氧。本文描述的用于制备抗微生物组合物的任何方法形成本发明的另外的方面。
80.在某些实施例中，可以通过将含有溶解氧的水溶液与含有带电荷的纤维素纳米原纤维的制剂组合来制备抗微生物组合物。例如，高度充氧的溶液(例如水或盐水)可以与含有纤维素纳米原纤维的水性分散体(例如含有纳米原纤维化的材料的水凝胶)结合。可替代地，可以将充氧的溶液与含有带电荷的纤维素纳米原纤维的气凝胶接触，从而使气凝胶再水合并形成水凝胶。
81.在另外的方面中，本发明因此提供了一种用于制备如本文所述的抗微生物组合物的方法，所述方法包含将具有至少20mg/l的溶解氧含量的水溶液与含有带电荷的纤维素纳米原纤维的制剂组合的步骤。
82.在其他实施例中，根据本发明的抗微生物组合物可以通过将其中分散有带电荷的纤维素纳米原纤维的水溶液进行充氧来制备。在这种情况下，含有纤维素材料的用于充氧的水溶液可以以液体或可流动凝胶的形式提供。
83.含有高水平的溶解氧的水溶液及其制备方法在本领域中通常是已知的。此类溶液及其制备方法的实例描述于wo 02/26367、wo 2010/077962和wo 2016/071691(其全部内容通过引用并入本文)中。这些溶液可以用于制备本文所述的抗微生物组合物。oxy bio系统(挪威奥斯陆的oxy solutions)可以用于生产本文所述的任何充氧的溶液。
84.在一个实施例中，含有高水平的溶解氧并且可以用于制备本发明的组合物的水溶液可以通过包括含以下步骤的方法来生产：
85.·
将加压液体(例如水)引入到管道网络中以形成流动流；
86.·
将气态氧注入到流动流中以产生液体和氧气泡的混合物，
87.·
提供包括文丘里管的线性流动加速器；和
88.·
使液体和气态氧气泡的流动混合物穿过线性流动加速器以加速流动混合物并且随后将流动混合物减速至亚音速以使气态氧气泡破碎。
89.使用上述方法的充氧使得可以产生具有高且稳定的溶解氧含量的充氧的液体(例如水)。当液体为水时，氧气的溶解度从约7mg/l增加到20mg/l、30mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l或更多，并且氧气含量在冷却的环境中在数月内基本上是稳定的。
90.该方法可以进一步包含如在wo 2016/071691中所述将液体引入到保持体积(例如，保持罐)中的步骤。液体可以在液体和氧气混合物形成之前被引入到保持体积中，或者它可以在文丘里管下游被引入到保持体积中。保持体积可以被加压，但这不是必须的。如果需要，可以搅动保持罐中的液体以保持液体的均匀性。在优选的实施例中，保持体积与出口流体连通并且在出口的下游，并且优选地还与设备的液体入口流体连通并且在设备的液体入口的上游，例如通过适当的导管。
91.在一些实施例中，用于充氧的液体可以进一步包含一种或多种泡沫减少剂(例如，二甲基硅油)，或者该方法可以包含额外的泡沫减少步骤。泡沫减少步骤可以包含任何合适的和期望的方法，并且它可以在充氧方法中的任何合适的点提供。在一个实施例中，泡沫减少步骤可以包含将液体引入到如本文所述的保持体积(例如，保持罐)中。
92.适合用于进行这类充氧方法的设备可以包含：
93.液体入口，用于将液体(例如水)供应到设备中；
94.氧气入口，用于将氧气供应到设备内的液体中以产生液体和氧气的混合物，所述氧气入口与所述液体入口流体连通并且在液体入口的下游；
95.文丘里管，所述文丘里管与所述液体入口和所述氧气入口流体连通并且在所述液体入口和所述氧气入口的下游，其中所述文丘里管被布置成将氧气溶解到穿过所述文丘里管的液体中；和
96.用于充氧的液体的出口，其与所述文丘里管流体连通并且在所述文丘里管的下游。
97.该设备包含液体和氧气的入口和出口，在它们之间具有文丘里管。液体和氧气通过相应的入口被供应到设备中，氧气入口位于液体入口的下游，使得氧气被注入到液体流中。该液体和氧气的混合物然后例如通过与液体入口和氧气入口流体连通并且在液体入口和氧气入口的下游的导管被传送到文丘里管，所述导管被布置成将液体和氧气供应到文丘里管。由于文丘里管在流动路径中产生的限制，这导致液体和氧气的混合物加速通过文丘里管，然后在另一侧减速，在混合物中产生冲击波，其迫使氧气溶解在液体中，从而使液体充氧。
98.在一个实施例中，该设备包含与氧气入口(以及液体入口)流体连通并在氧气入口(以及液体入口)的下游的扩散室，所述扩散室和所述氧气入口被布置成使得氧气通过氧气入口被供应到扩散室中。扩散室提供液体流过并且氧气被注入到其中的容积，其中扩散室被布置成促进氧气的气泡破碎成更小的气泡，例如通过促进扩散室中的液体和氧气的湍流流动。优选地，例如由玻璃、金属或塑料制成的栅格或网状物被布置在扩散室中，例如氧气和液体必须通过该栅格或网状物进入扩散室。这有助于将液体中的氧气分解成小气泡，使得它们更容易溶解到扩散室和设备下游的液体中，例如在文丘里管中。
99.该设备可以包含与氧气入口和液体入口(以及在其中提供它的实施例中的扩散室)流体连通并且在其下游的混合室，所述混合室被布置成引起流体中的湍流从中流过。混合室产生液体和流过混合室的氧气的湍流，其作用是将液体中的氧气分解成小气泡，使得它们更容易溶解在混合室和设备下游的液体中，例如在文丘里管中。可以以任何合适和期望的方式提供混合室，即以引起必要的湍流。例如，混合室可以包含一个或多个障碍物(例如流动路径中的屏障)和/或曲折路径。
100.如果需要，在通过该设备并被充氧之后，一些充氧的液体可以被再循环，例如该装置可以包含布置成将一部分充氧的流体从出口再循环到液体入口的导管。因此，在一个实施例中，导管具有与出口流体连通且在出口下游的一个端部，以及与液体入口流体连通且在液体入口上游的另一个端部。由于至少一些液体多次通过该设备，使一些充氧的液体再循环可以有助于增加液体中的溶解氧的浓度。然而，在一个实施例中，该设备被布置成以单程生产模式操作，即不使充氧的液体再循环。
101.可以以任何合适和期望的方式将氧气供应到设备中。它可以以液体和/或气体形式被供应到设备中。在一个实施例中，该设备包含与氧气入口流体连通的加压氧气供应器，例如包含氧气的加压气瓶。
102.液体通过设备的流速可以是任何合适的和期望的值或值的范围，例如取决于液体的粘度。在一个实施例中，该设备被布置成从该设备的出口输送0.01ml/min和100l/min之间(例如0.1ml/min和50l/min之间，例如1ml/min和20l/min之间，例如5ml/min和5l/min之间)的充氧的液体的流速。
103.流过该装置的液体的压力可以是任何合适的和期望的值或值的范围。在一个实施例中，该设备被布置成在0.1巴和5巴之间、例如0.5巴和4巴之间、例如约3巴的流体压力下操作。
104.本文所述的任何设备和方法可以与任何合适和期望的液体一起使用。在本上下文中，术语“液体”因此不仅包括常规意义上的液体，而且还包括可流动的材料，例如增稠的液体或粘性液体，或可流动凝胶。通常，用于充氧的液体将是水或生理盐溶液。
105.本文所述的方法和设备能够产生溶解氧的浓度大于20mg/l，例如大于30mg/l，例如大于40mg/l，例如大于50mg/l，例如大于60mg/l，例如约70mg/l的充氧的溶液。可以达到高达约100mg/l，例如高达约90mg/l或高达80mg/l的充氧水平。
106.如将理解的，能够达到的溶解氧的浓度取决于流过该装置的液体的温度，其中可达到的浓度通常随着温度的降低而增加。本领域技术人员可以容易地选择用于本文所述的任何充氧过程的合适的温度。
107.在另一组实施例中，本文所述的抗微生物组合物可以通过化学改性的纤维素纳米原纤维的水性分散体的充氧来制备。例如，这些可以使用在wo 02/26367、wo 2010/077962和wo 2016/071691中描述的任何设备和方法来充氧。特别地，它们可以使用在wo2016/071691中描述的方法和设备来充氧。如本文所述，oxy bio系统(挪威奥斯陆oxy solutions)可以用于对带电荷的纤维素纳米原纤维的水性分散体进行充氧。
108.化学改性的纤维素纳米原纤维的水性分散体的粘度将至少部分地取决于纳米纤维素的浓度。在较低的浓度(例如高达约0.4重量％)时，这些将是液体或增稠的液体，而在较高的浓度(例如，高于约0.4重量％)时，这些将被视为“凝胶”。在wo 02/26367、wo 2010/077962和wo 2016/071691中描述的任何设备和方法可以用于对液体或可流动凝胶进行充氧。上述用于制备充氧的溶液的方法和设备因此也可以用于对带电荷的纤维素纳米原纤维的水性分散体进行充氧。
109.因此，在一组实施例中，本文所述的抗微生物组合物可以通过将带电荷的纤维素纳米原纤维在水溶液中的分散体进行充氧来制备。例如，这些可以通过包含以下步骤的方法来生产：
110.·
将包含如本文所述的带电荷的纤维素纳米原纤维的水性分散体的液体引入到管道网络中以形成流动流；
111.·
将气态氧注入到所述流动流中以产生所述液体和氧气泡的混合物；以及
112.·
使所述液体和气态氧气泡的流动混合物穿过文丘里管，所述文丘里管被布置成将所述气体溶解到穿过所述文丘里管的所述液体中。
113.在该方法中，术语“液体”涵盖常规意义上的液体和任何可流动的水性材料，例如增稠的液体或粘性液体，或可流动凝胶。
114.在这种方法中，引入到管道网络中以形成流动流的液体可以被加压，但它不是必须的。可以容易地选择合适的流速。在一些实施例中，液体流速可以在从1l/min至25l/min的范围内。在某些实施例中，合适的氧气流速可以在0.1l/min至2.0l/min的范围内。在其中液体在引入到管道网络中的点处被加压的情况下，可以将其加压至1巴至5巴的压力。
115.本文所述的设备能够产生溶解氧的浓度大于20mg/l，例如大于30mg/l，例如大于40mg/l，例如大于50mg/l，例如大于60mg/l，例如约70mg/l的充氧的组合物。可以达到高达约100mg/l，例如高达约90mg/l或高达80mg/l的充氧水平。
116.如果需要，本文所述的任何充氧的组合物的粘度可以通过对其进行额外的后处理步骤来增加。例如，可能期望增加粘度以将液体组合物转化为更粘稠的液体或水凝胶。
117.在一个实施例中，如本文所述的液体纳米纤维素组合物(“第一纳米纤维素组合物”)的粘度可以通过与具有更高浓度的分散的cnf的第二纳米纤维素组合物混合来增加。第二纳米纤维素组合物可以被充氧或可以不被充氧。例如，它可以是非充氧的。如将理解
的，所得的组合物将具有至少20mg/l的溶解氧含量。可以在受控的温度条件下以所需的量混合组分。在低温(例如在2℃至25℃，优选地约4℃至5℃的范围内)和优选地在受控压力条件下混合通常是可取的，以使氧气的损失最小化。在制备期间组合物的搅拌也应受到控制，例如被最小化，以避免氧气的损失。该制备方法在实施例10中进行说明，其中将含有0.2重量％的充氧的cnf组合物与浓度为0.4重量％的非充氧的cnf组合物混合，从而增加其粘度。如在该实例中看到的，这可以在对溶解氧含量的影响最小的情况下完成。
118.可替代地，具有较高粘度的充氧的纳米纤维素组合物可以通过将化学改性的纤维素纳米原纤维(例如水凝胶)的高度粘性的水性分散体与具有所需含量的溶解氧的水溶液(例如水或盐水溶液)混合来制备。这些组分的混合可有效溶解粘性分散体(例如水凝胶)并形成均匀溶液。为了使氧气的损失最小化，应以最小的剪切力进行混合。可以使用本文所述的任何设备和充氧方法来制备具有所需氧含量的水溶液。
119.在另一个实施例中，如本文所述的液体纳米纤维素组合物的粘度可以通过带电荷的纳米原纤维的交联来增加。例如，可以使用能够通过-coo-基团使纳米原纤维交联的二价阳离子来实现交联。合适的二价阳离子包括但不限于ca
2
、cu
2
、sr
2
和ba
2
。例如，cacl2可以用于通过ca
2
阳离子使纳米原纤维交联。交联剂的合适的浓度可以根据需要容易地确定，但可以例如在约50mm至约100mm的范围内。
120.水凝胶形式的抗微生物组合物可以替代地通过使用含有所需水平的溶解氧的充氧的液体使含有带电荷的纤维素纳米原纤维的气凝胶再水合来制备。气凝胶可以通过已知的方法来制备。例如，这些可以通过例如在-20℃下冷冻水凝胶并使用telstar lyoquest-83设备冻干持续高达24小时的时间段来生产。可以调节冷冻温度以便改变气凝胶的孔径。例如，这可以被降低到约-80℃。可以通过冷冻和冻干3d打印的水凝胶来制备合适的气凝胶。
121.在一个实施例中，本发明因此提供了一种用于制备如本文所述的抗微生物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)制备包含带电荷的纤维素纳米原纤维的气凝胶；和(ii)用具有至少20mg/l的溶解氧含量的充氧的液体(例如充氧的水或充氧的盐水)使所述气凝胶饱和，从而形成水凝胶。
122.本文所述的组合物的抗微生物性质使它们适合于医疗用途，例如用于治疗伤口。在另外的方面中，本发明因此提供了一种如本文所述的组合物，用作抗微生物剂，例如用于抑制至少一种伤口病原体的生长。
123.在另外的方面中，本发明提供如本文所述的抗微生物组合物在制备用于治疗伤口的方法中的药物中的用途。
124.在另一方面中，本发明提供了一种用于治疗伤口的方法，所述方法包含将有效量的如本文所述的抗微生物组合物应用于所述伤口的步骤。任选地，所述方法可以进一步包含在应用所述抗微生物组合物之后应用伤口覆盖物(在本文中被称为“二次敷料”)的步骤。
125.在伤口的治疗中，将其他活性剂递送至伤口部位可能是有益的。在一个实施例中，在组合物中还可以存在至少一种其他活性物质，例如其他活性物质的组合。这些包括已知适合用于治疗伤口的物质。
126.可以存在于本文所述的任何组合物中的其他活性剂包括抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗生素、生长因子、细胞因子、趋化因子(例如巨噬细胞化学趋化蛋白(mcp-1或
ccl2)、核酸(包括dna、rna、sirna、微小rna)、维生素(例如维生素a、维生素c、维生素e、维生素b)、矿物质(例如锌、铜、镁、铁、银、金)、麻醉剂(例如苯佐卡因、利多卡因、普拉莫辛、地布卡因、丙胺卡因、苯酚、氢化可的松)、抗炎剂(例如皮质类固醇、碘化物溶液)、保湿剂(例如透明质酸、尿素、乳酸、乳酸盐和乙醇酸)、细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白、透明质烷和弹性蛋白)、酶(例如，来自鱼子的孵化液中的酶，或鱼子提取物中的酶，例如鲑鱼卵提取物)、来自植物的干细胞、来自蛋和蛋壳的提取物(例如，来自鲑鱼和鸡蛋)、植物提取物(botanical extract)、脂肪酸(例如ω-6和ω-3脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸)和皮肤渗透增强剂。
127.生长因子对正常的伤口愈合产生强大且关键的影响。伤口修复受生长因子(血小板衍生生长因子[pdgf]、角质形成细胞生长因子和转化生长因子-β)控制。pdgf对于伤口愈合的大多数阶段都很重要。pdgf-bb(becaplermin)的重组人类变体已经被成功地应用于糖尿病和压力性溃疡。可以在组合物中提供的生长因子包括表皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、角质形成细胞生长因子(kgf或fgf 7)、血管内皮生长因子(vegf)、转化生长因子(tgf-b1)、胰岛素样生长因子(igf-1)、人生长激素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。
[0128]
细胞因子，例如白细胞介素(il)家族和肿瘤坏死因子-α家族通过各种途径促进愈合，例如刺激基底膜的组分的产生、防止脱水、增加炎症和肉芽组织的形成。il-6由嗜中性粒细胞和单核细胞产生，并且已经被证明在启动愈合应答中很重要。它对角质形成细胞具有促有丝分裂和增殖作用，并且对嗜中性粒细胞具有化学吸引力。可能存在的细胞因子的实例包括白细胞介素(il)家族和肿瘤坏死因子-α家族。
[0129]
维生素c(l-抗坏血酸)、维生素a(视黄醇)和维生素e(生育酚)显示出有效的抗氧化和抗炎作用。维生素c缺乏导致受损的愈合，并且与减少的胶原蛋白合成和成纤维细胞增殖、减少的血管生成、增加的毛细血管脆性、受损的免疫应答和对伤口感染的增加的易感性有关。类似地，维生素a缺乏导致受损的伤口愈合。维生素a的生物学性质包括抗氧化活性、增加的成纤维细胞增殖、调节细胞分化和增殖、增加的胶原蛋白和透明质酸盐合成以及减少的mmp介导的细胞外基质降解。
[0130]
几种矿物质已被证明对最佳伤口修复很重要。镁用作参与蛋白质和胶原蛋白合成的许多酶的辅助因子，而铜是细胞色素氧化酶、胞质抗氧化超氧化物歧化酶和胶原蛋白的最佳交联所必需的辅助因子。锌是rna和dna聚合酶的辅助因子，并且锌缺乏导致伤口愈合显著受损对于脯氨酸和赖氨酸的羟基化需要铁，并且因此，严重的铁缺乏可以导致胶原蛋白生成受损。
[0131]
胶原蛋白在从诱导凝血到最终疤痕的形成和最终出现的自然伤口愈合过程中起着至关重要的作用。它刺激成纤维细胞的形成，并且在与受损的组织接触时加速内皮细胞的迁移。壳聚糖在增殖阶段和伤口愈合期间加速肉芽形成。
[0132]
可以存在于组合物中的抗细菌剂的实例包括但不限于以下：醇、氯、过氧化物、醛、三氯生、三氯卡班、苯扎氯铵、利奈唑胺、喹奴普丁-达福普汀(quinupristin-dalfopristin)、达托霉素、奥利万星和达巴万星、喹诺酮类和莫西沙星。
[0133]
取决于活性物质的选择，本领域技术人员可以容易地确定可以存在于根据本发明的组合物中的任何其他活性物质的量。通常，这可以以1重量％至10重量％，例如1重量％至5重量％的范围(基于组合物的总重量)存在。
[0134]
在一个实施例中，本文所述的组合物可以基本上不含(例如不含)其他活性物质。例如，它们不需要包括任何额外的抗细菌剂。
[0135]
本文所述的组合物是水性的，但不必是纯水性的。该组合物可以包含高达99.8重量％的水。通常，这些将包含至少50重量％的水，更优选地至少60重量％的水，还更优选地至少70重量％的水，例如至少80重量％的水。例如，本文所述的组合物可以包含95重量％至99.8重量％的水。相对高的水含量确保高的氧水平，因此可能导致溶解氧快速吸收到皮肤中。
[0136]
根据本发明的组合物可以包含其他任选的组分，例如维持缓冲的ph的组分，或将摩尔渗透压浓度(osmolality)维持在适合用于预期的应用的范围内的组分，或维持组合物的稳定性的组分。因此可能存在的其他组分包括缓冲液、ph调节剂、摩尔渗透压浓度调节剂、防腐剂(例如抗微生物剂)、抗氧化剂、香料、着色剂等。
[0137]
缓冲液的存在用于将ph调节至生理水平，例如在3至9，优选地4至7的范围内，例如约5.5。缓冲液的适当选择也可以有助于控制组合物的离子强度。可以使用的缓冲液的实例包括柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐和乙酸盐。等渗水性缓冲液(例如磷酸盐)是特别优选的。合适的缓冲液的实例包括tris、pbs、hepes。
[0138]
与ph接近中性的伤口相比，具有碱性ph的伤口具有较低的愈合速率。一些研究还已经表明，伤口中的酸性环境支持自然愈合过程并控制微生物感染。慢性伤口通常具有升高的碱性环境，并且例如可以具有在7.15至8.9的范围内的ph。在治疗伤口，尤其是慢性伤口中，酸性ph因此可能是有利的。在一个实施例中，组合物因此可以被缓冲以具有在2至7范围内的ph。例如，这些可以被缓冲到在3至6.5，优选地5至6，更优选地5至5.5，例如约5.1至约5.5的范围内的ph。可能存在的ph调节剂包括氢氧化钠、盐酸、乙酸、硼酸、抗坏血酸、透明质酸和柠檬酸。
[0139]
也可以存在盐以便调节组合物的摩尔渗透压浓度，从而提高它们的体内耐受性。可以使用本领域已知的用于调节渗透压的任何合适的盐。渗透压可以根据伤口的性质进行调整。例如，具有过量渗出物的那些伤口可以受益于高渗组合物，而对于其他伤口，低渗组合物或等渗组合物可能更合适。合适的盐的一个实例是氯化钠。这可以以在约0.05重量％至约2重量％，例如约0.2重量％至约1重量％范围内(基于组合物的总重量)的量被添加以形成等渗组合物。可以根据需要添加更高的量或更低的量以获得低渗组合物或高渗组合物。在组合物是水凝胶的情况下，氯化钠的存在可以进一步用于强化凝胶，并增加其生物粘附力。
[0140]
在组合物为水凝胶形式的情况下，任何附加组分的选择应考虑到它可能对凝胶的强度产生的任何负面影响。因此，可能会降低凝胶的强度的试剂应谨慎使用或根本不使用。
[0141]
可以存在于组合物中的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯化钠、对羟基苯甲酸酯、维生素e、edta二钠、甘油和乙醇。
[0142]
一种或多种抗氧化剂的存在可以用于延长本文所述的组合物的保质期，例如在这些组合物可以包含对氧化敏感的任何其他组分的情况下。可以存在的合适的抗氧化剂的实例包括抗坏血酸和抗坏血酸盐(例如抗坏血酸钠、抗坏血酸钾和抗坏血酸钙)；抗坏血酸的脂肪酸酯，例如抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸硬脂酸酯；生育酚，例如α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚；没食子酸丙酯、没食子酸辛酯、没食子酸十二酯或没食子酸乙酯；愈创木树脂；
异抗坏血酸(erythorbic acid)、异抗坏血酸钠(sodium erythorbate)、异抗坏血酸(erythorbin acid)或异抗坏血酸钠(sodium erthorbin)；叔丁基醌(tbhq)；丁基化羟基苯甲醚(bha)；丁基化羟基甲苯(bht)；异构体和乙氧喹(ethoxyquin)。优选用于本发明的是那些水溶性的抗氧化剂，诸如例如抗坏血酸和抗坏血酸盐。
[0143]
本发明的组合物中抗氧化剂的最佳量将取决于许多因素，包括组合物的氧含量、组合物中任何氧敏感性化合物的存在和量等。合适的水平可以很容易地由本领域技术人员确定。然而，抗氧化剂的水平通常将为至少0.001重量％，特别是至少0.01重量％或至少0.03重量％。抗氧化剂的水平通常将小于5重量％，特别是小于2重量％或1重量％，例如在0.02重量％与0.5重量％之间或在0.05重量％与0.2重量％之间。
[0144]
还可以存在皮肤渗透增强剂并且这些可以在增强组合物的活性方面具有有益的效果。可以使用在药物文献中已知和描述的任何皮肤渗透增强剂。这些可以包括但不限于以下中的任何一种：脂肪酸(例如油酸)、二烷基亚砜(例如二甲亚砜，dmso)、阿佐恩(azones)(例如月桂氮酮)、吡咯烷酮和衍生物(例如2-吡咯烷酮，2p)、醇和链烷醇(例如乙醇、癸醇、异丙醇)、二醇(例如丙二醇)和表面活性剂(例如十二烷基硫酸盐)。其他皮肤渗透增强剂的实例包括月桂酸丙二醇酯、单月桂酸丙二醇酯、单辛酸丙二醇酯、肉豆蔻酸异丙酯、十二烷基硫酸钠、氯化十二烷基吡啶鎓、油酸、丙二醇、二甘醇单乙醚、烟酸酯、氢化大豆磷脂、精油、醇类(如乙醇、异丙醇、正辛醇和癸醇)、萜烯、n-甲基-2-吡咯烷、聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)、吐温80和其他表面活性剂，以及二甲基-β-环糊精。如果存在，任何表面渗透增强剂可以以在0.1重量％至10重量％的范围内，例如约5重量％的量提供。
[0145]
在一个实施例中，根据本发明的组合物基本上由水、溶解氧、带电荷的纤维素纳米原纤维和任选地一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂组成。如本文所使用的，术语“基本上由
…
组成”是指组合物不包含在使用时实质上影响其性质的任何其他组分，例如通常可以用于伤口治疗的其他药学上可接受的药剂。
[0146]
在根据本发明的组合物包含本文所述的任何其他组分的情况下，这些组分可以被并入到含充氧的纤维素的组合物中或被并入到组合物的任何组分(例如待在它们的制备中使用的充氧的液体)中。这些可以在受控的温度条件下，例如在低温(例如在2℃至25℃，优选地4℃至5℃的范围内)和优选地在受控的压力条件下，通过简单混合所需量的组分来添加以使氧气的损失最小化。制备期间组合物的搅拌或搅动应受到控制，例如最小化，以避免氧气的损失。在优选的实施例中，可以在充氧之前将其他组分添加到组合物中以避免在充氧后需要混合或搅拌组合物。
[0147]
为了在体内使用，本文所述的组合物应该被灭菌。这可以通过本领域已知的方法来实现。应选择用于灭菌的条件，使得产品保持其所需的抗微生物性质，同时使产品在储存期间的活微生物的水平最小化。在一些情况下，组合物的单独的组分可以在混合之前被灭菌。纤维素纳米原纤维的灭菌可以例如通过电子束辐射或γ辐射来实现。可替代地，最终组合物可以在充氧后被灭菌。在这种情况下，灭菌可以类似地通过γ辐射或电子束辐射或通过其他方式例如使用具有小孔径(例如约0.22μm)的过滤器的微滤来实现。过滤组合物的能力将取决于其最终粘度，但当充分冷却使得其处于液态时，微滤通常将是可行的。
[0148]
本文所述的组合物可以被并入到伤口覆盖物中，例如这些组合物可以被提供在常规敷料、绷带或任何其他合适的伤口覆盖物中或作为常规敷料、绷带或任何其他合适的伤
口覆盖物的组分提供。在另一方面中，本发明因此提供了一种伤口覆盖物，其中并入了如本文所述的抗微生物组合物。在使用中，伤口覆盖物可以被应用到目标组织(例如皮肤的表面)，使得其中包含的抗微生物组合物与下面的身体组织接触。
[0149]
在一个实施例中，可以将组合物并入到绷带、纱布、贴片或吸收垫或其一部分中，并包装以备使用。例如，可以将液体组合物浸泡到合适的伤口覆盖物(例如吸收垫)中并包装以备使用。绷带、纱布、贴片或吸收垫可以在真空或压力下包装。可替代地，包含组合物的伤口覆盖物可以在使用点通过在应用到身体组织之前立即将组合物应用到合适的伤口覆盖物(例如通过将伤口覆盖物浸泡或浸入到任何液体组合物中)来制备。因此，在另一方面中，本发明提供了一种用于治疗伤口的试剂盒，所述试剂盒包括含：(a)含有如本文所述的抗微生物组合物的无菌的密封的容器或包装；(b)伤口覆盖物，例如伤口敷料、绷带、纱布、贴片或吸收垫。该试剂盒可以另外包含用于在治疗伤口中使用该试剂盒的组分的打印的说明书。
[0150]
在一个实施例中，本文所述的组合物可以以可以用作伤口敷料的水凝胶的形式提供。在另一方面中，本发明因此提供了一种水凝胶形式的伤口敷料，其包含带电荷的纤维素纳米原纤维，其中所述水凝胶具有至少20mg/l的溶解氧含量。
[0151]
当用作伤口敷料时，水凝胶可以以适合应用于伤口部位的任何所需的形状或尺寸提供。例如，它可以作为水凝胶材料的柔性结构或“构建体”(例如片材)提供。这类构建体可以通过如本文所述的充氧的纤维素材料的三维(3d)打印来生产。用于3d打印水凝胶材料的方法在本领域中是熟知的，并且可以使用任何常规的3d打印设备(例如regemat3d打印单元)来执行。3d打印的结构可以是单层的或多层的，这取决于它们的预期用途，例如待治疗的伤口的性质和范围。一旦“打印”，水凝胶构建体可以经受交联以增加它们的粘度并增强它们的机械性能，例如以提供自保持但柔性的3d结构。可以使用本文所述的任何交联剂来实现交联，例如通过将3d打印的水凝胶构建体浸入到所选的交联剂的溶液中。浸入到cacl2的溶液中持续数小时(例如高达24小时)可能是合适的。
[0152]
在使用中，水凝胶敷料可以被直接应用于伤口部位。如果需要，可以在使用时将其切割成合适的尺寸。
[0153]
本文所述的组合物可以被包装在合适的密封的容器或包装中，所述容器或包装被灭菌，例如通过蒸汽灭菌(即高压灭菌)或γ辐射被灭菌。高压灭菌可以在105℃至150℃，优选地120℃至135℃的范围内的温度下进行持续足以杀死微生物的时间段。灭菌时间取决于待灭菌的物品的类型，例如金属、塑料等，但可以预期在1分钟到60分钟(例如4分钟到45分钟)的范围内。典型的蒸汽灭菌温度可以是121℃或132℃。
[0154]
可以根据水凝胶的性质及其预期用途(例如待治疗的伤口的类型、治疗的持续时间以及是否设想多次使用)来选择合适类型的容器。合适的包装包括小瓶、装载的注射器、管、袋、瓶子等。在每种情况下，这些都应有效地被密封，以避免在储存时氧气的耗尽。例如，可以为小瓶提供合适的扭转以破坏瓶盖。
[0155]
包装可以旨在用于单次使用或多次使用。在这些旨在用于多次使用的情况下，重要的是包装的剩余内容物可以在打开之后以及在每剂组合物的递送之后密封，以便保持产品的无菌性并使氧气的损失最小化。具有单向泵的容器可能是合适的。可替代地，组合物可以以单独的剂量提供，例如在小袋(sachet)、小管或瓶子中，其含有足以单次施用于皮肤的
量。单次使用的安瓿是优选的。
[0156]
在储存时保持组合物中高且稳定的氧含量是必不可少的。应相应地选择合适的储存容器、盖子和用于制备它们的材料。这些应该对气体，尤其是氧气的渗透具有低的敏感性。优选地，这些应该是对于气体不可透过的。合适的容器包括玻璃罐、小瓶和管，以及一次性塑料容器，例如由聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)或其共聚物制成的容器。任选地，任何塑料容器(例如，由pet或其共聚物制成的那些)可以包含额外的组分以增强它们的气体阻隔性能。此类材料例如描述于us 2007/0082156和wo 2010/068606(其内容通过引用并入本文)中。
[0157]
理想地，任何储存容器都应具有最低的氧气渗透性，以便使产品的保质期最大化。通常，合适的保质期是在环境条件下最短约6个月，优选地6至12个月。保质期可以通过在较低的温度下(例如在2℃至4℃范围内的温度下在冷藏下)储存来延长。在预期的保质期内的储存期间，优选的是，产品的氧含量应该减少不超过25％。
[0158]
本文所述的组合物可以应用于其中需要递送氧气的任何伤口部位。递送的方法将取决于产品的形式，即它是用作液体(例如增稠的液态或粘性液体)还是凝胶，或者它是否作为如本文所述的伤口覆盖物中的组分提供。对于任何治疗用途，为了保持产品的无菌性，通常设想这些应通过无菌方式应用。例如，可以使用施加器(例如从注射器)将这些应用到目标区域。
[0159]
伤口通常涉及皮肤的完整性的中断。当皮肤被损坏或去除时，例如通过手术去除、烧伤、撕裂或磨损，其保护功能丧失。根据本发明可以治疗所有类型的皮肤伤口，包括急性伤口和慢性伤口。
[0160]
急性伤口通常是在预期的时间范围内(例如长达10天)内完全愈合且具有最小疤痕的组织损伤。急性伤口的主要原因包括由外部因素引起的机械损伤，例如由皮肤和硬表面之间的摩擦接触引起的擦伤和撕裂。机械损伤还包括由刀具造成的穿透性伤口和由手术切口(例如在切除肿瘤中)造成的手术伤口。急性伤口还包括烧伤和化学损伤，例如可能由辐射、电、腐蚀性化学品和热源(冷和热)引起的损伤。烧伤伤口可以根据其严重程度分类，例如一度、二度或三度烧伤。
[0161]
慢性伤口由愈合缓慢的组织损伤引起，例如在约12周后仍未愈合且经常复发的损伤。由于反复的组织损伤或潜在的生理状况(如糖尿病、肥胖、恶性肿瘤、持续感染、初级治疗不佳和其他与患者相关的因)，此类伤口通常无法愈合。慢性伤口包括皮肤溃疡，例如褥疮性溃疡(例如褥疮或压疮)、腿部溃疡(无论起源是静脉性、动脉性、缺血性或创伤性)和糖尿病性溃疡。静脉性腿部溃疡是由腿部中的静脉中的瓣膜的功能障碍导致的静脉功能不全引起的，并且可能导致肺栓塞，肺栓塞是一种危及生命的状况。它们的治疗成本很高，通常需要住院治疗。动脉性腿部溃疡是由腿部中的动脉的功能不良或闭塞引起的，并且可能由诸如动脉硬化的状况引起。糖尿病溃疡是由于糖尿病导致的微循环受损引起的。在糖尿病溃疡的情况下，未能愈合通常可以导致肢体的丧失。
[0162]
伤口也可以根据皮肤层的数量和受影响的皮肤的区域进行分类。在浅表伤口中，损伤仅影响表皮皮肤表面。涉及表皮和较深真皮层(包括血管、汗腺和毛囊)的损伤可以被称为部分厚度伤口。除了表皮和真皮层之外，当下面的皮下脂肪或更深的组织受损时，出现全厚度伤口。
[0163]
当用于治疗伤口时，本发明的组合物通过改善的充氧增加伤口愈合的速率，同时在伤口部位保持水分并防止感染。伤口和烧伤特别容易受到其中组织被破坏或严重损坏的感染，例如二度或三度烧伤。在这类情况下，本文所述的组合物的应用还可以预防细菌感染以及治疗性地起作用以治愈受损的组织。
[0164]
本文所述的组合物特别适用于治疗被感染的伤口，例如慢性伤口。由于氧气对这些病原生物体的毒性，它们可以用于治疗皮肤的需氧和厌氧细菌和真菌感染。真菌感染可能与肠球菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、链球菌、化脓菌(pyogenis)有关。侵袭性真菌感染的实例包括与毛霉菌、曲霉菌有关的那些。
[0165]
在感染的伤口和皮肤烧伤的区域中也可以发现需氧菌和厌氧菌。可以使用本发明的组合物治疗的厌氧细菌感染包括拟杆菌属物种和梭菌属物种。可以使用该组合物治疗的需氧细菌感染包括假单胞菌属物种(例如铜绿假单胞菌)、肠球菌属物种、肠杆菌科物种、芽孢杆菌属物种、链球菌物种和葡萄球菌物种(例如金黄色葡萄球菌)。该组合物特别适用于治疗含有假单胞菌属和/或葡萄球菌属物种，例如铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌的伤口。
[0166]
在一个实施例中，本文所述的组合物可以用于防止细菌生物膜的形成和/或治疗身体表面上的细菌生物膜。治疗通常将包括从身体表面破坏、去除或分离至少部分生物膜。
[0167]
待治疗的受试者可以是任何哺乳动物。尽管受试者通常将是人，但本文所述的方法同样适于治疗非人哺乳动物。因此在本发明的范围内设想了该组合物的兽医用途。
[0168]
组合物可以以多种不同的方式应用，这取决于诸如待治疗的区域、状况的性质、待治疗的受试者等因素。这些可以应用到身体的任何区域，包括面部，胸部、手臂、腿或手。通常，它们将应用于皮肤。施用于皮肤的方法可以取决于组合物的粘度，但可以包括通过摩擦、浸泡、浸入、连续灌注、注射等施用。
[0169]
取决于它们的粘度，组合物可以通过手指施用。然而，为了保持无菌性，通常设想这些将通过无菌方式应用，例如使用施加器。取决于制剂的性质，尤其是其粘度，可以使用已知用于施加皮肤产品的施加器。例如，这可以用抹刀来施加。
[0170]
组合物可以被直接应用于目标组织，即伤口，并且因此用于形成“初级敷料”。通常，这将需要二次敷料以保护组合物并且确保其在治疗期间保持在适当的位置。二次敷料应该是柔韧的并且能够适应伤口部位。通常，这种敷料将采用常规伤口敷料材料的片材的形式，其可以根据待治疗的组织区域被切割成适当的尺寸和形状。
[0171]
任何二次敷料理想地应该对水和/或氧具有有限的渗透性，例如这应该基本上对水和/或氧气是不渗透的。封闭敷料的使用不仅确保存在于下面的组合物中的溶解氧被递送到皮肤，而且还用于为伤口维持湿润的愈合环境。“基本上不透氧”是指水凝胶中少于25％的氧含量可以通过敷料损失。
[0172]
在处理伤口的修复和愈合时，可能需要控制来自伤口的渗出物。这可能涉及来自伤口的渗出物的排出或使用合适的吸收性敷料的吸收。在受损组织的部位处保持最佳水分水平也很重要，特别是在其中存在渗出物的大量产生的情况下。使用敷料有助于实现这一点。在一个实施例中，二次敷料因此可以是高度吸收性的，特别是在处理具有高水平渗出物的任何伤口的情况下。合适的敷料的实例是本领域已知的并且可以根据伤口的类型、其尺寸和位置容易地选择。已知的敷料包括合成敷料和生物敷料，例如合成膜、海藻酸盐、水胶
体、水凝胶和胶原蛋白敷料。基本上不能透过氧气的那些包括聚酯和聚烯烃。如果需要，也可以用压缩绷带来覆盖伤口。这可能是有益的，例如，在治疗静脉溃疡时。
[0173]
在使用中，将组合物直接应用于伤口部位或尽可能靠近伤口部位。优选地，这应该与伤口床直接接触。然后将合适的二次敷料施加在组合物上，并且如果需要，使用胶带、纱布或任何其他合适的手段将其固定在适当的位置，以将其固定到完整的皮肤上。二次敷料可以是临时的，使得如果需要，可以将其移除并且用新的敷料替换。在一个实施例中，二次敷料可以部分地涂覆有能够将其固定到皮肤上的粘合剂。例如，敷料可以在其周边周围具有粘合剂。合适的粘合剂材料在本领域中是已知的并且包括例如聚异丁烯、聚硅氧烷和聚丙烯酸酯。在敷料被供应有粘合剂部分的情况下，这通常还将具有释放衬垫，例如硅化的聚酯膜，其在使用前被去除。
[0174]
治疗的持续时间将取决于伤口的性质和应用于皮肤的组合物的氧含量。通常，敷料可以在伤口上使用持续几天，例如长达3天。使用敷料持续数天进一步降低了治疗的成本并且减少了更换敷料所涉及的创伤(例如，其中敷料可能需要每天或一天几次更换)。可以控制来自敷料的氧气的递送。受控释放涉及在7小时至2天的预定时间段内释放氧气。在此时间段期间氧气的递送优选地基本上是连续的，这意味着递送基本上是不间断的。
[0175]
在一些情况下，进一步施加该组合物可能是期望的，并且这可以根据需要经常重复。为了更换敷料，可以通过用生理学上可接受的溶液诸如无菌水或盐水溶液轻轻冲洗而容易地从伤口去除氧耗尽的组合物。充氧的水或充氧的盐水也可以用于此目的。在更换敷料之间冲洗伤口也用于清洁伤口以去除死组织或坏死组织。
[0176]
伤口愈合具有几个不同的阶段，这些阶段可能并不都是特定水凝胶或敷料的目标。因此，组合物和任何二次敷料的性质不仅可以针对不同类型的伤口(例如急性、慢性、干燥、渗出等)而且还可以针对伤口愈合中的不同阶段进行调整。这尤其包括针对治疗的不同阶段改变不同组合物的氧含量。在伤口愈合的早期阶段期间，低po2(低氧)是生长因子、细胞因子、基因激活和血管生成的重要刺激物，而在伤口愈合的随后阶段期间，正常(常氧)或增加(高氧)的po2水平是更有利的。例如，成纤维细胞和内皮细胞增殖在30mm hg至80mm hg的po2下最好地发生，并且胶原合成、新血管形成和上皮化都需要在20mm hg与60mm hg之间的po2。
[0177]
由于其易于使用，本文所述的伤口治疗可以用作家庭护理，从而降低治疗成本并避免患者的住院的需要。这些还允许患者在治疗期间完全活动，而不需要住院、氧气罐或额外的设备。这提高了患者的生活质量。
[0178]
本文所述的组合物旨在用于哺乳动物，优选地人类受试者的皮肤上的真皮应用。因此，这些不仅与皮肤相容，而且还与粘膜、指甲和头发相容。通常，这些在应用于皮肤时也将是无刺激性和良好耐受性的。
[0179]
现在将参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明，其中：
[0180]
图1示出了随着氧化增加产生的cnf中cnf膜粗糙度的激光轮廓测定法定量(laser profilometry quantification)。每个横向波长的平均值与平均值的标准偏差一起给出(n＝10)。
[0181]
图2示出了样品cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0的afm分析。cnf_2.5样品中相对较厚的纳米原纤维由箭头指示。在每个图像的中间获取高度图，用虚线表示。校准和比例尺以纳
米为单位给出。高度和宽度在来自轮廓图的单个纳米原纤维(黑色)上测量。
[0182]
图3示出了针对随着氧化增加产生的cnf在不同速度下测量的布鲁克菲尔德粘度。
[0183]
图4示出了在暴露24小时后cnf凝胶对铜绿假单胞菌的抗微生物作用，其与设置为100％的阴性对照bhi100相关。条代表平均值，并且误差条代表sem。在所有组中n＝5。
[0184]
图5示出了3d打印的构建体的透光率的量化(平均值与标准偏差一起给出，n＝4)。3d打印的构建体的目标尺寸为20mm
×
40mm
×
2mm。
[0185]
图6示出了冻干的构建体的sem评估。四列为每个系列提供四个重复的sem图像。箭头表示打印方向。右列产生显示表面结构的主要方向的极坐标图。
[0186]
图7示出了cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0的0.2重量％cnf和充氧的cnf的布鲁克菲尔德粘度(表1)。数据被表示为平均值
±
sem(n＝10)。
[0187]
图8示出了使用(a)纤维测试仪(fibertester)(残留纤维和细粉)和(b)纳米颗粒分析仪(纳米-尺寸的纤维)对cnf分散体的评估。
[0188]
图9示出了cnf的充氧和溶解氧(do)的定量。将具有不同氧化水平的0.2重量％cnf(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0，表1)充氧并在室温(22℃)下储存在密封的玻璃瓶中。在生产当天和5周后测量do浓度。充氧的cnf的重复测量和cnf的单一测量。数据被表示为平均值
±
sem。
[0189]
图10示出了cnf和充氧的cnf对铜绿假单胞菌的抗微生物作用。在4小时或24小时后，具有不同氧化水平的0.2重量％cnf(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0，表1)对铜绿假单胞菌的细菌存活率。数据被表示为平均值
±
sem。除cnf_6.0 4小时和cnf 24小时(n＝4)外，在所有组中n＝5。bhi100被用作阴性对照。
[0190]
图11示出了cnf和充氧的cnf对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗微生物作用。在暴露24小时后，具有不同氧化水平的0.2重量％cnf(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0，表1)对(a)铜绿假单胞菌和(b)金黄色葡萄球菌的细菌存活率(log10 cfu)。数据被表示为log10。除图b中的cnf_3.8(n＝4)外，在所有组中n＝5。bhi100和prontosan分别被用作阴性对照和阳性对照。
[0191]
图12示出了细菌生物膜的sem评估：(a)铜绿假单胞菌和cnf_6.0；(b)铜绿假单胞菌和cnf_6.0
–
充氧的；(c)金黄色葡萄球菌和cnf_6.0；和(d)金黄色葡萄球菌和cnf_6.0
–
充氧的。
[0192]
图13示出了通过cacl2使充氧的cnf交联的效果。上图：含和不含cacl2(50mm或100mm)的0.2重量％充氧的cnf中的溶解氧(do)，n＝3。下图：含和不含cacl2(50mm或100mm)的0.4重量％充氧的cnf中的溶解氧(do)，n＝3，“oxy 0.4％100mm cacl
2”(n＝1)除外。
[0193]
图14示出了0.2重量％和0.4重量％的cnf的布鲁克菲尔德粘度(在10rpm下测量)。
[0194]
图15示出了通过带有18g套管的50ml针尖端注入的cnf的溶解氧(do)含量。上图：0.2重量％cnf。下图：0.4重量％cnf。n＝3。
[0195]
图16示出了在暴露24小时后cnf凝胶对铜绿假单胞菌的抗微生物作用，其与设置为100％的阴性对照bhi100相关。条代表平均值，并且误差条代表平均值的标准误差。在所有组中n＝15。与对照相比，所有样品均显著不同(*，p《0.05)。
[0196]
图17示出了含有cnf(0.6重量％)的琼脂凝胶中铜绿假单胞菌的游动水平。条形代表平均值，并且误差条代表平均值的标准误差。在所有组中n＝3(*,p《0.05)。
[0197]
图18示出了cnf_3.8和充氧的cnf_3.8的抗微生物作用，其在体内评估。数据被表示为cfu的数量。在所有组中n＝5。(*)表示显著差异(p《0.05)。
[0198]
实例
[0199]
实例1-纤维素纳米原纤维(cnf)的制备和表征
[0200]
cnf的制备：
[0201]
如nordli等人(《碳水化合物聚合物》150,65-73,2016)所述，使用naoh对辐射松牛皮纸浆纤维进行洗涤和高压灭菌。这样做是为了减少内毒素的量(nordli等人，《acs应用生物材料(acs applied bio materials)》2(3),1107-1118,2019)。具有不同表面化学的cnf是通过tempo介导的氧化产生的，采用三个氧化水平，即2.5、3.8和6.0mmol次氯酸盐(naclo)/g纤维素，并且分别被定义为cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0(saito等人，《生物大分子》5(5),1983-1989,2004)。在将氧化的纤维素纤维通过均化器(rannie15型12.56x均化器，在1000巴压力下操作)三次后收集cnf。
[0202]
cnf的表征：
[0203]
根据saito等人(《生物大分子》5(5),1983-1989,2004)，通过电导滴定法来定量羧酸基团的含量。醛基团的含量是基于jausovec等人(《碳水化合物聚合物》116,74-85,2015)先前描述的分光光度法确定的。
[0204]
使用regemat3d打印单元(1.0版，regemat3d，西班牙格拉纳达(granada,spain))将cnf凝胶(浓度0.6重量％)打印在显微镜载玻片上。使用0.58mm的喷嘴和3mm/s的流量打印2层10
×
20mm的实心区域。允许凝胶在室温(23℃)和40％相对湿度下干燥。在打印的结构上沉积一层金，并以1μm/像素的分辨率获取10个激光轮廓测定法图像(1
×
1mm)。对激光轮廓测定法图像进行带通滤波，并且在各种横向波长下量化表面粗糙度(均方根)(chinga-carrasco等人，《微米(micron)》56,80-84,2014)。
[0205]
对三个cnf样品进行原子力显微术(afm)。样品在室温下使用veeco多模v进行分析。afm尖端具有约0.4n m-1
的弹簧常数(bruker afm探针)。评估的局部区域为2
×
2μm，其中分辨率为1.95nm/像素。
[0206]
用布鲁克菲尔德粘度计(布鲁克菲尔德dv2trv)来评估cnf的粘度。使用心轴v-73在23℃
±
1℃的温度下和在以下速度下进行评估：0.6rpm、1rpm、2rpm、6rpm和10rpm。
[0207]
结果和讨论：
[0208]
cnf凝胶的羧基含量和醛含量以及cnf膜的表面粗糙度在表1中示出：
[0209]
表1
[0210][0211]
naclo的量的增加导致羧基基团的量的增加。增加羧基基团的量增加纳米原纤维
之间的排斥力，并且这有助于产生个体化的纳米原纤维。通过激光轮廓测定法数据证实了这一点。纤维氧化得越多，纳米原纤维的产率越高，并且cnf膜的表面越光滑。cnf_2.5的相对高的粗糙度轮廓是由于主要存在残余的微米级纤维。随着氧化的增加，粗糙度降低(参见图1)。这是由于获得的个体化的纳米原纤维的主要部分(参见图2)。
[0212]
afm分析显示三个样品包含纳米原纤维(直径小于20nm)(图2)。afm分析对于提供3个样品之间的比较很有价值，并且表明样品cnf_2.5包含相对较厚的纳米原纤维(图2，箭头)。这一观察结果也表明样品结构不均匀，这证实了粗糙度分析(参见表1)。
[0213]
样品cnf_6.0的大部分个体化的纳米原纤维导致相应凝胶的粘度增加(参见图3)。这三个样品显示出粘度随着速度的增加而降低，这可以从剪切稀化效应中解释。此外，粘度数据表明，与样品cnf_2.5和cnf_3.8相比，样品cnf_6.0在给定的速度下具有更高的粘度。
[0214]
实例2-cnf的细胞毒性和皮肤刺激潜力
[0215]
按照用于评估医疗装置的标准化方案来测试在实例1中产生的三个cnf样品的细胞活力和皮肤刺激潜力。从每个系列制备六种气凝胶(20g/m2)。使用telstar lyoquest-83设备将凝胶在-20℃下冷冻并在24小时期间冻干。
[0216]
体外表皮皮肤刺激测试：
[0217]
样品cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0的皮肤刺激潜力通过根据用于医疗装置的体外皮肤刺激的刺激测试，使用体外epiderm
tm
皮肤刺激测试试剂盒(epi-200-sit；斯洛伐克布拉迪斯拉发的mattek体外生命科学实验室(mattek in vitro life science laboratories))和方案“用于医疗装置提取物的体外皮肤刺激测试(in vitro skin irritation test for medical device extracts)”v.9.0最终版来确定。该测试包括将测试项目的提取物局部暴露于重建的人表皮(rhe)模型，然后使用黄色水溶性mtt 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(其在活细胞中被代谢还原为蓝紫色不溶性甲赞)进行细胞存活率测定。在将甲臜溶解在乙醇中后，活细胞的数量与通过光度测量确定的颜色强度相关。
[0218]
rhe组织在6孔板中在测定培养基(37
±
1℃，5
±
1％co2)中预孵育过夜，之后加入100μl的测试项目提取物或对照样品。阳性对照是在盐水和芝麻油中的1％十二烷基硫酸钠溶液(sds，mattek体外生命科学实验室，布拉迪斯拉发)，并且阴性对照是不含ca
2
和mg
2
的dulbecco的pbs(犹他州南洛根的ge医疗保健生命科学混合克隆实验室(ge healthcare lifescience hyclone laboratories))。测试项目在37
±
1℃下提取72
±
2小时。在暴露18小时后，用不含ca
2
和mg
2
的dulbecco的pbs(犹他州南洛根的ge医疗保健生命科学混合克隆实验室)彻底冲洗组织，并在含有1mg/ml mtt(mattek体外生命科学实验室)的24孔板中孵育持续3小时(37
±
1℃，在5
±
1％co2中)。除去mtt溶液，将组织浸入2-丙醇(2ml/组织；mattek)中，并且摇动板持续两小时。之后使用分光光度计在570nm处测量提取的甲臜的吸光度。如果剩余的相对细胞活力低于50％，则预测测试项目的皮肤刺激潜力。
[0219]
细胞毒性：
[0220]
根据iso 10993-5:2009附录c和rise标准操作程序sop km 11741，通过细胞毒性测试来确定样品cnf 2.5、cnf 3.8和cnf 6.0的细胞毒性潜力。该测试包括将测试项目的提取物暴露于l929小鼠的亚汇合单层，然后使用黄色水溶性mtt 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(其在活细胞中被代谢还原为蓝紫色不溶性甲赞)进行细胞存活
率测定。在将甲臜溶解在乙醇中后，活细胞的数量与通过光度测量确定的颜色强度相关。
[0221]
测试项目在37
±
1℃下在伊格尔氏最低必需培养基1x中提取24
±
2小时，该培养含有用nahco3(gibco life technologies)缓冲的伊格尔氏平衡盐溶液，补充有非必需氨基酸(gibco life technologies)、丙酮酸钠(ge healthcare hyclone)、5％(v/v)胎牛血清(gibco life technologies)、4mm稳定的谷氨酰胺(gibco life technologies)、100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素(ge healthcare hyclone)，使用0.1g/ml的比率。将l929小鼠成纤维细胞(atcc nctc克隆929：ccl-1)接种在96孔板中，并在37
±
1℃和5％co2下孵育24
±
2小时以形成亚汇合单层。来自测试项目、阳性对照(胶乳橡胶(latex rubber)、gammex 91-325、accutech ansell)和阴性对照(thermanox plastic coverslips,产品货号174934,thermo scientific nunc)的100μl提取物以及空白(作为100％细胞存活率的测量的提取媒介物)添加到6个重复孔中。将板在5％co2中在37℃下孵育24小时。除去提取物，并且向每个孔中加入50μl的mtt溶液，并且将细胞在37℃下在5％co2中孵育2小时。去除mtt溶液，并且向每个孔中加入100μl的2-丙醇。快速摇动板直到从细胞中提取甲臜并形成均匀的溶液。在570nm(参考波长650nm)处测量吸光度并计算细胞的活力。如果细胞活力低于70％，则该测试项目被认为具有细胞毒性。
[0222]
结果和讨论：
[0223]
结果在表2中呈现：
[0224]
表2
[0225][0226]
结果证实，cnf样品不具有细胞毒性潜力(成纤维细胞活力大于70％，参见表2)。根据“体外epidermtm皮肤刺激测试(epi-200-sit)”中给出的标准和方案“用于医疗装置的体外皮肤刺激测试”，材料被分类为无刺激性，即rhe的活力高于被认为具有皮肤刺激潜力的限值(de jong等人,《体外毒理学(toxicology in vitro)》50,439-449,2018)。这些发现证实了安全且生物相容的伤口敷料材料的开发。
[0227]
实例3-cnf的抗微生物性质
[0228]
体外评估实例1中产生的cnf凝胶(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0)对铜绿假单胞菌的抗微生物作用。
[0229]
方法：
[0230]
使用600nm处的光密度(od)将铜绿假单胞菌(atcc 15692)的过夜培养物设置为1
×
107个菌落形成单位(cfu)/ml的最终细菌浓度。将10μl的制备的细菌悬浮液(1
×
107cfu/ml)与500μl的cnf凝胶混合，并在37℃下孵育24小时。将230μl的混合物悬浮在2ml的磷酸盐缓冲液(在0.0375m磷酸盐中的0.05％triton x-100)中，并以十倍步长稀释五倍。将来自每次稀释的50μl铺展在马血琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。对血琼脂板上的cfu的数量进行计数，并计算含有凝胶和细菌混合物的原始管中的cfu的数量。这被定义为24小时处理后的细菌存活率。对于每个凝胶，进行5次重复，并且作为阴性对照，使用在h2o(bhi100)中稀释100倍的500μl脑心灌注培养基来代替cnf凝胶。
[0231]
结果和讨论：
[0232]
图4中的结果证实了剂量依赖性的抗微生物作用，即将cnf的浓度从0.2重量％增加到0.6重量％降低了铜绿假单胞菌的存活率。此外，发现抗微生物性质还取决于cnf的表面电荷。结果表明，将表面电荷从1036μmol/g增加到1593μmol/g，降低了细菌存活率。细菌存活率的降低可能归因于cnf的表面化学。增加羧基基团的含量导致纳米原纤化的增加，即在均质化期间获得更大的cnf产率。预计羧基含量增加凝胶分散体中单独的纳米原纤维之间的排斥力，从而可能导致纳米原纤维在液体介质中的电荷依赖性分布。电荷密度越高，纳米原纤维分布越均匀并且粘度越高(参见表1和图3)，并且纳米原纤维覆盖在细菌的表面上的面积可能越大。醛含量也可能有助于使革兰氏阴性菌的细胞壁中的蛋白质交联，因此不能承担基本功能。尽管不希望受理论的束缚，但我们假设这些特性可能有助于限制细菌的存活和生长。
[0233]
实例4
–
cnf的3d打印
[0234]
对实例1中生产的三种cnf等级(浓度0.6重量％)进行了3d打印测试。
[0235]
方法：
[0236]
使用regema3d打印单元进行3d打印。对于每个系列(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0)，使用0.58打印喷嘴来打印四个构建体(尺寸为20mm
×
40mm
×
2mm)。打印的轨迹之间的间距为2mm
×
2mm。高度(2mm)由4个打印的层组成。打印期间的流速为3mm/s。作为打印保真度的附加测试，评估了三种cnf等级的打印性能。打印了三个副本(20
×
40mm)。这些结构仅由1层组成，以便更好地评估打印性能。打印的轨迹之间的距离为2mm。流速为3mm/s。在使用epson perfection v750 pro扫描仪在传输模式下打印后立即获取3d打印的结构的图像。应用的分辨率为每英寸2400点。使用imagej程序(版本1.52h)对通过光学图像的光的传输进行量化，并且被报告为相对于背景传输通过构建体的光的分数。
[0237]
将3d打印的结构在-20℃下冷冻，并且使用telstar lyoquest-83设备在24小时内冻干。使用hitachi su3500扫描电子显微镜对冻干的样品进行扫描电子显微镜(sem)评估。用agar auto sputter coater(英国的agar scientific，essex cm24 8gf)进行金涂覆。图像是在二次电子成像(sei)模式下分别使用5kv和6mm加速电压和工作距离获取的。
[0238]
打印栅格，其中直径＝20mm，高度＝1mm，并且由两层组成。打印喷嘴为0.58mm。打印期间的流速为3mm/s。在用来自bruker(之前hysitron)的ti950 triboindenter进行机械
评估之前，将栅格浸入cacl2(100mmol)中持续至少24小时。纳米压痕参数为：锥形尖端；位移控制在2000nm的峰值压痕深度；加载0.125秒，保持0.4秒，卸载0.125秒(对于一个压痕，总测试时间为0.65秒)。对于每个样品，在随机区域进行了至少20次可重复的压痕。
[0239]
结果和讨论：
[0240]
实现了浓度为0.6重量％的cnf的适当的3d打印过程，即沉积的轨迹没有塌陷并且可以打印3d构建体。
[0241]
获得了3d构建体(目标尺寸40mm
×
20mm
×
2mm)的光学图像，并且量化了光透射率。与cnf_6.0相比，样品cnf_2.5和cnf_3.8的打印的轨迹显示出较弱的清晰度。cnf_6.0样品展示了具有明确定义的轨迹的3d构建体，这表明良好的打印保真度。通过构建体的光透射率在图5中示出。当用作伤口敷料时，透明度有助于监督伤口发展。
[0242]
对于1层结构，发现cnf_6.0样品(具有相对高的粘度，因此具有较大比例的纳米原纤维)具有特别好的可打印性，即在打印的结构上没有观察到重大缺陷。
[0243]
sem分析的结果在图6中呈现。结果显示微米级的孔径，范围从约10μm至200μm。与纳米横截面尺寸相比，cnf的特殊特性是个体化的纳米原纤维的高纵横比，长度为微米级。在这些特性和挤出期间的剪切力的促进下，纳米原纤维在打印方向上排列。单独的纳米原纤维的排列似乎也影响冻干后结构的自组装。使用基于sobel算子的计算机化梯度分析(gadalamaria等人,《聚合物复合材料(polymer composite)》14(2):126-131,1993)和yoshigi等人,《血细胞计数部分a(cytom part a)》55a(2):109-118,2003)，我们能够量化气凝胶纹理的方向这由方位面的极坐标图表示，它指示主要的取向方向(chinga等人，《牛津显微镜杂志(journal of microscopy-oxford)》227(3):254-265,2007)。极坐标图越细长，在给定方向上的取向就越明显。与垂直打印的结构的垂直取向的极坐标图相比，在水平方向打印的结构的极坐标图明显是水平取向的。样品cnf_2.5和cnf_3.8具有由微米尺寸的表面孔定义的清晰取向图案。然而，样品cnf_6.0表现出更加各向同性的纹理。cnf_6.0的表面纹理由自组装的纳米原纤维的薄片/壁组成。控制打印的图案的取向对于支架和组织工程来说特别有趣，以控制细胞在给定方向上的生长和增殖。
[0244]
表3示出了cnf水凝胶(0.6重量％浓度)的刚度和硬度(纳米机械性能)：
[0245]
表3
[0246][0247]
结果产生弹性模量的水平，即三组凝胶的约2mpa-3 mpa和硬度(约0.2mpa-0.5mpa)。cnf_3.8和cnf_6.0具有高于cnf_2.5的硬度值。
[0248]
刚度，即材料在施加力时对变形(在弹性区域中)的抵抗力，对于细胞的机械转导应答很重要。例如，细胞通过重新组织细胞骨架来响应生物材料的刚度，从而影响细胞的扩散、增殖和迁移。因此，生物材料的刚度影响细胞和组织的生物学行为，从伤口愈合的角度来看，这可能很重要。
[0249]
结论：
[0250]
cnf是3d可打印的，并且提供形成伤口敷料的能力，所述伤口敷料可以适应x、y和z方向上的特定要求(形状和组成)。cnf凝胶可以与ca
2
交联，并且易于管理以应用于伤口情况。伤口敷料另外是透明的，这预期促进伤口愈合管理。
[0251]
实例5-充氧的cnf的制备和表征
[0252]
充氧的cnf的制备：
[0253]
具有三种不同氧化水平的在实例1中产生的cnf(在水中浓度为0.6重量％)被命名为cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0(表1)。用纯净水(milli-q水净化器，法国莫尔海姆的密理博(millipore))将cnf稀释至0.2重量％。三种等级的cnf在高-压蒸汽中在高压灭菌器(日本东京的tomy，autoclave sx-700e)中灭菌20分钟(121℃)。将凝胶保持在4℃。
[0254]
三种等级的cnf由oxy bio系统(挪威奥斯陆的oxy solutions)充氧。在wo2016/071691(挪威奥斯陆的oxy solutions as)中描述了充氧装置和生产过程的详细描述。oxy bio系统包含带有文丘里管的管道系统，其中将氧气(98％，挪威奥斯陆的praxair，目录号500183)和cnf混合。在生产期间，相应的cnf通过充氧装置被连续循环持续最少10分钟。为了确认在生产中是否达到了所需的氧浓度(》30mg/l)，用orion rdo氧气计(orion a323，赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州)测量溶解氧(do)浓度。生产设置为3.45巴(液体压力)和200ml/min o2(氧气流量)。在整个生产期间，cnf保持低温。在生产后，将充氧的cnf填充到玻璃小瓶(美国宾夕法尼亚州d vwr，目录号216-3006)中并用铝制中心撕裂密封件((美国宾夕法尼亚州的vwr，目录号218-2117)和溴丁基塞(美国宾夕法尼亚州的vwr，目录号wheaw224100-405)密封。
[0255]
充氧的cnf的表征：
[0256]
用布鲁克菲尔德粘度计(布鲁克菲尔德dv2trv)来评估充氧的cnf的粘度。运行参数为：评估的体积：200ml。温度：23℃
±
1℃。心轴：v-71。
[0257]
使用纤维测试仪(l&w fiber tester plus，代码912)对残留纤维进行量化。该设备量化大于7μm的残留纤维和细粉的量。制备并量化40ml体积的每种cnf分散体(0.2重量％)。该分析基于对超过7800张图像的采集。对于每个系列进行两次重复。将cnf分散体稀释至0.1重量％并用粒度分析仪(n5亚微米粒度分析仪(n5 submicron particle size analyzer)，beckman coulter)进行分析，该粒度分析仪可以确定在3nm-3μm的范围内的粒度。
[0258]
结果和讨论：
[0259]
充氧的cnf的布鲁克菲尔德粘度值在图7中示出。存在通过粘度数据揭示的两个特定趋势：(i)粘度随着氧化的增加而降低；和(ii)充氧过程降低了相应样品的粘度。在0.2重量％浓度下随着氧化的增加粘度降低可能是由于残留的纤维和精细材料。残留的纤维是相对长的物体，在低浓度的分散体下，该物体可能有助于增加粘度。
[0260]
在图8b中，使用纳米粒子分析仪对分散体的分析表明，平均物体尺寸随着氧化的增加而减小。此外，用激光轮廓测定法进行的定量显示，残留纤维(微米-尺寸)的比例相应减小。这通过量化作为氧化的函数的残余纤维和细粉的减少得到证实(图8a)。因此，在稀释的分散体(0.2重量％)中，较高比例的相对长的物体可能是影响样品cnf_2.5的粘度增加的因素。
[0261]
通过充氧导致的粘度降低可能归因于由于在充氧过程期间通过oxy bio系统循环
引起的cnf的机械应力。增加的溶解氧的浓度也可能有助于粘度的降低，即氧可以充当纳米原纤维之间的间隔物。
[0262]
实例6-充氧的cnf的保质期测试
[0263]
将充氧的cnf和非-充氧的cnf在室温(22℃)下储存在密封的玻璃小瓶中持续5周。如前所述(moen等人，《健康科学报道(health sci.rep.)》e57,2018)，在生产当天(第0周)和5周后通过winkler滴定法来测量溶解氧(do)浓度。
[0264]
如图9所示，在三个cnf等级之间没有观察到do水平的显著差异(对于cnf_2.5为31.2mg/l，对于cnf_3.8为29.6mg/l，并且对于cnf_6.0为31.6mg/l)。该结果表明，具有不同表面化学和形态的cnf可以通过oxy bio系统被充氧至大致相同的高水平do。在储存5周后，在0.2重量％cnf中的do的水平分别被降低至26.9％、31.1％和38.0％。然而，do水平是对照水平的两倍。
[0265]
实例7-充氧的cnf的抗微生物测试
[0266]
对充氧的cnf、非-充氧的cnf和作为阳性对照的prontosan伤口凝胶(braun medical ag，瑞士森帕奇(瑞士的sempach，目录号400515)的盲样品进行了抗微生物效果评估。
[0267]
方法：
[0268]
使用600nm处的光密度(od)，将铜绿假单胞菌(atcc 15692)或金黄色葡萄球菌(atcc 29213)的过夜培养物设定为1
×
107个菌落形成单位(cfu)/ml的最终细菌浓度。将10μl制备的细菌悬浮液(1
×
107cfu/ml)与500μl的凝胶混合，并在37℃下孵育4/24小时。将230μl悬浮在2ml磷酸盐缓冲液(在0.0375m磷酸盐中的0.05％triton x-100)中并以十倍步长稀释五倍。将来自每次稀释的50μl铺展在马血琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。对血琼脂板上的cfu的数量进行计数，并计算含有凝胶和细菌混合物的原始管中的cfu的数量。这被定义为处理4和24小时后的细菌存活率。对于每种凝胶，进行5次重复，并且作为阴性对照，使用在h2o中稀释100倍的500μl脑心灌注培养基(bhi100)来代替凝胶。
[0269]
在第一项试验中，评估了需氧细菌铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))的细菌存活率。在4小时和24小时后进行细菌存活率的量化，以便验证4小时后潜在的快速抗微生物作用。这种快速作用在4小时后显示(图10)。与非-充氧的cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0相比，充氧的cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0在4小时后分别具有显著较低的铜绿假单胞菌的存活率(p《0.05，独立-双尾t-{2检验)。在24小时后确认结果。增加cnf的电荷导致更大的抗微生物作用，并且这种作用通过充氧被增强。
[0270]
在第二项试验中，研究了需氧细菌铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))和金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌(s.aureus))在24小时后的细菌存活率(图9a-b)。这些试验在充氧的cnf产生后1-3周开始。然而，图9证实了，在评估时，cnf凝胶中溶解氧的潜在减少预计会很小。cnf(0.2重量％)随着氧化水平的增加(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0，表1)，在两个试验中与bhi100(阴性对照)相比，具有显著的抗微生物作用(p《0.05，独立双尾t-试验)(图11a-b)。
[0271]
这些结果证实羧化的cnf凝胶具有抗微生物作用。分别与非充氧的cnf_2.5和cnf_6.0相比，充氧的cnf_2.5和cnf_6.0具有显著较低的铜绿假单胞菌的存活率(p《0.05，独立双尾t-检验)(图7a)。cnf_3.8和充氧的cnf_3.8之间的差异不显著。测量了充氧的cnf_6.0
的铜绿假单胞菌的最低细菌存活率(图11a)。这些结果表明，氧化水平(cnf_6.0)越高，抗微生物作用越好。在存在高水平的溶解氧的情况下，cnf的作用被进一步增强。用细菌菌株金黄色葡萄球菌观察到类似的结果(图11b)。凝胶cnf_6.0和充氧的cnf_6.0的性能与prontosan凝胶相似，prontosan凝胶是在本研究中用作对照的强效抗微生物剂。应当注意，凝胶被稀释至0.2重量％的浓度以用于通过oxy bio系统进行充氧。以前已经证明，增加羧化的cnf的浓度增加抗微生物作用(jack等人，《碳水化合物聚合物》157,1955-1962,2017)。可以预期，具有更高浓度的纳米原纤维的高度充氧的凝胶将是一种有效的抗微生物剂。
[0272]
实例8-生物膜的sem表征
[0273]
为了更清楚地了解cnf和充氧的cnf的作用机制，在猪皮和琼脂上生长金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生物膜并用cnf凝胶处理。将样品固定，冷冻-干燥并用sem评估。
[0274]
方法：
[0275]
在猪皮和琼脂上生长铜绿假单胞菌(atcc 15692)或金黄色葡萄球菌(atcc 29213)的生物膜。在孵育后，用2.5％戊二醛将样品固定过夜，在搅动下用缓冲液洗涤两次持续30min，然后在1％四氧化锇中固定过夜，在搅动下用超纯水洗涤两次持续30min，然后在液体丙烷中速-冻，并冷冻-干燥过夜。之后，将样品安装在显微镜针上并用15nm的au/pt涂覆。成像由zeiss supra 40vp sem在二次电极图像模式下完成。加速电压和工作距离分别为3kv和12mm。
[0276]
结果和讨论：
[0277]
结果在图12中示出，并且证明了cnf的作用方式。图12a-b是捕获铜绿假单胞菌的cnf的图像。图12c-d是捕获金黄色葡萄球菌的cnf的图像。纳米原纤维似乎形成了包围并捕获细菌的网络。羧化的纳米原纤维的空间分布似乎取决于氧化程度(羧基基团)，并且这可能促进cnf与细菌的相互作用。此外，在cnf表面上遇到的醛基团(表1)可能有助于将单独的纳米原纤维锚定到细菌细胞壁中的蛋白质上，从而捕获微生物并限制它们的移动性和生长。单独的纳米纤维在捕获细菌和潜在地限制它们的进一步移动性和生长的方面发挥着特定作用(图12)。
[0278]
实例9-充氧的cnf-水凝胶的制备
[0279]
通过与ca
2
阳离子交联(通过-coo-基团)，由相应的具有低浓度(0.2重量％或0.4重量％)的纳米原纤维的充氧的“cnf液体”来生产含有表面带电荷的纳米原纤维的充氧的水凝胶。
[0280]
方法：
[0281]
确定含有或不含cacl2的0.2重量％和0.4重量％的充氧的纳米纤维素中的溶解氧(do)含量，以测试添加cacl2是否改变do和粘度。在每个纳米纤维素被充氧后添加cacl2(50mm或100mm)。然后在生产日和1个月后通过winkler滴定法(三次测量)来测量do的水平。肉眼观察粘度的变化。
[0282]
结果和讨论：
[0283]
结果在图13中示出。将cacl2添加到0.2重量％的充氧的纳米纤维素中导致do的小幅降低
–
对于50mm cacl2，6.9mg/l的do和3.8mg/l的do(分别在生产当天和1个月后)，对于100mm cacl2，7.7mg/l的do和4.5mg/l的do(分别在生产当天和1个月后)。将cacl2添加到0.4重量％的充氧的纳米纤维素中导致do的小幅降低
–
对于50mm cacl2，2.2mg/l的do(1个月
后)，并且对于100mm cacl2，0.7mg/l的do和3.6mg/l的do(分别在生产当天和1个月后)。发现“cnf液体”与ca
2
的交联由于交联而增加了粘度，但不会过度影响充氧水平。
[0284]
实例10
–
充氧的cnf-水凝胶的制备
[0285]
通过与具有较高cnf含量(0.6重量％)的非充氧的cnf凝胶混合，由具有低浓度的纳米原纤维(0.2重量％)的相应的充氧的“cnf液体”生产含有表面带电荷的纳米原纤维的充氧的水凝胶。
[0286]
方法：
[0287]
将充氧的cnf(0.2重量％)与非充氧的cnf(0.6重量％)混合以获得具有更高cnf浓度(0.4重量％)的充氧的cnf。材料的详情在表4中阐述：
[0288]
表4
[0289][0290][0291]
如实例1所述测量材料的布鲁克菲尔德粘度。
[0292]
结果：
[0293]
材料的粘度在图14中给出。样品22_01至22_06的粘度对应于图5中给出的结果。观察到0.4重量％“凝胶”的粘度显著增加。
[0294]
实例11
–
充氧的cnf的3d打印
[0295]
用18g套管注射器(braun，einmal injektions-kanule，1.20
×
40mm bc/sb 18gx1 1/2)通过50ml针尖端挤出(即注射)浓度为0.2重量％和0.4重量％的充氧的cnf(cnf_6.0)以测试3d打印对其氧含量的潜在影响。
[0296]
图15中的结果表明，挤出过程没有导致氧气的显著损失。溶解氧(do)的减少很小且不显著(对于0.2重量％纳米纤维素，p值＝0.277，并且对于0.4重量％纳米纤维素，p值＝0.393)。
[0297]
用浓度为0.2重量％的cnf_2.5和cnf_3.8材料进行了类似的实验。使用22g套管注射器(brauneinmal injektions-kanule,0.45
×
12mm bl/lb 26gx1/2)通过50ml针尖端进行注射导致do的小幅降低，其不显著。
[0298]
实例12-cnf的抗微生物性质
[0299]
在体外评估了实例1中产生的cnf凝胶(cnf_2.5、cnf_3.8和cnf_6.0)对铜绿假单胞菌(atcc 15692，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection))和金黄色葡萄球菌(atcc 29213，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)的抗微生物作用。
[0300]
方法
–
细菌存活率的确定：
[0301]
将铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌的菌落在补充有5％去原纤化的马血(瑞典乌普萨拉的瑞典国家兽医研究所(swedish national veterinary institute))的马血琼脂板(哥伦比亚琼脂(columbia agar)，英国贝辛斯托克的oxoid)上培养，然后转移到10ml 3.7％脑心浸液(bhi)肉汤(新泽西州富兰克林湖的difco，bd diagnostics)中并在 37℃、250rpm下孵育过夜。将细菌悬浮液以2000
×
g离心10分钟。弃去上清液，并且将沉淀重新悬浮在1ml的0.037％bhi(在水中稀释100倍的bhi培养基，bhi100)中。该悬浮液在bhi100中进一步稀释，以达到1
×
108个菌落形成单位(cfu)/ml的最终细菌浓度，如通过测量600nm处的光密度所估计的。将10μl制备的细菌悬浮液(1
×
108cfu/ml)与500μl cnf凝胶混合，并在37℃下孵育24小时。将230μl的混合物悬浮在2ml的磷酸盐缓冲液(在0.0375m磷酸盐中的0.05％triton x-100)中，并以十倍步长稀释五倍。将来自每次稀释的50μl铺展在马血琼脂板上，并在37℃下孵育过夜。对板上的cfu的数量进行计数，并且计算含有凝胶和细菌混合物的原始管中的cfu的数量，并将其定义为处理24小时后的细菌存活率。在针对铜绿假单胞菌的三项单独的盲法试验和针对金黄色葡萄球菌的一项试验中，对每种凝胶进行了三次测试。对于每个试验，进行5次重复，并且作为阴性对照，使用500μl bhi100来代替cnf凝胶。
[0302]
方法-游动测定：
[0303]
将补充有0.5％葡萄糖和0.3％琼脂的luria-bertani肉汤在沸水中融化，然后冷却至45℃，然后将cnf(6重量％)添加到在5％v/v混合物中的融化的琼脂中，如silva等人《材料科学杂志》54(18),12159-12170,2019)所述。将混合物倒入55mm培养皿中(每皿7.5ml)并在盖子倾斜的情况下固化3小时。将其中cnf凝胶用水替换的一种样品用作对照。通过将移液管尖端稍微浸入琼脂中，将5μl的金黄色葡萄球菌(atcc 29213)(非鞭毛细菌)或铜绿假单胞菌(atcc 15692)(鞭毛细菌)悬浮液(1
×
109cfu/ml)接种到每个板的中心。以一式三份测试cnf和对照。将板在有氧条件下在37℃下在直立位置接种持续9小时。获取每个琼脂板的数字图像并使用imagej程序进行评估。使用中值滤波器对图像进行自动过滤以去除噪声，并自动将图像阈值化为二进制图像以分割细菌晕圈。细菌晕圈的费雷特直径被量化并被报告为每个测试的样品的游动程度。
[0304]
结果：
[0305]
图16中的结果证实了cnf凝胶的抗微生物作用。与对照相比，所有样品均显著不
同。图17中的结果显示了含有cnf的琼脂凝胶中铜绿假单胞菌的游动水平。
[0306]
实例13-体内手术部位感染(ssi模型)—cnf和充氧的cnf
[0307]
分别如根据实例1和5制备的cnf_3.8和充氧的cnf_3.8的抗微生物作用在体内确定并与伤口凝胶(从德国b.braun获得)进行比较。
[0308]
方法：
[0309]
细菌制备：将金黄色葡萄球菌(atcc 29213)的菌落在补充有5％去原纤化的马血(瑞典乌普萨拉的瑞典国家兽医研究所)的马血琼脂板(哥伦比亚琼脂，英国贝辛斯托克的oxoid)上培养，然后转移到10ml 3.7％脑心浸液(bhi)肉汤(新泽西州富兰克林湖的difco，bd diagnostics)中并在 37℃、250rpm下孵育过夜。将细菌悬浮液以2000
×
g离心10分钟。将沉淀重新悬浮在1ml bhi100中，并将悬浮液进一步在bhi100中稀释以达到2
×
109cfu/ml，如通过600nm处的光密度所估计的。将8ml的细菌悬浮液转移到15ml管中，并将3-0根丝缝合线(684g，ethicon，瑞典索伦蒂纳(sollentuna，sweden))在悬浮液中浸泡30分钟。缝合线在 4℃下在滤纸上干燥并保持在 4℃直到使用(最多4小时)。每cm缝合线吸附约5
×
103个细胞，如先前所述(hakansson等人，《抗微生物药剂和化学疗法(antimicrob.agents chemother.)》58(5),2982-4,2014)。
[0310]
动物模型：在本研究中使用的模型先前已被发表(gisby等人，《抗微生物药剂和化学疗法》44(2),255-60,2000；hakansson等人，《抗微生物药剂和化学疗法》58(5),2982-4,2014；mcripley《抗微生物药剂和化学疗法》10,38-44,1976；rittenhouse等人，《抗微生物药剂和化学疗法》50,3886-3888,2006)并且如下所述进行了修改所有动物实验均在瑞典哥德堡行政上诉法院当地动物研究伦理委员会(local ethics committee for animal studies at the administrative court of appeals in gothenburg,sweden)事先批准后进行。将动物保持在12小时的明-暗循环中，自由获取水和颗粒(瑞典马尔默的lab for,)，并按照保护实验动物的规定进行护理。用异氟烷(isobavet,shering-plough animal health，丹麦法鲁姆(farum,denmark))麻醉雌性cd1小鼠(25-30g，德国苏尔茨费尔特的charles river)。用剪刀将小鼠的背部剃毛，用70％乙醇清洗，并用手术刀在小鼠的背部上在颈部区域居中地放置1cm的全厚度切口伤口。将约1cm的被感染的缝合线置于伤口中，并使用单根尼龙缝合线5-0ethilon*ii(eh7800h，瑞典索伦蒂纳的ethicon)来封闭伤口以避免小擦伤。术前通过腹膜内注射给予丁丙诺芬(48μg/kg，temgesic,shering-plough，比利时布鲁塞尔(brussels,belgium))以用于术后疼痛缓解。感染后24小时，用微量移液器将30μl的安慰剂或活性治疗剂应用于伤口。3小时后，对伤口应用第二次30μl治疗剂。安慰剂和治疗剂留在伤口中的适当位置。最后一次治疗后2小时，通过颈椎脱臼法对小鼠实施安乐死，并切除伤口周围2
×
1cm的区域(包括整个伤口区域和周围组织)并用转子-定子均化器(t10 basic ultra-turrax，德国施陶芬的ika-werkegmbh&co.kg)在2ml冰冷的bhi100中均质化。通过在96孔板中转移22.2μl至200μl的磷酸盐缓冲液(在0.0375m磷酸盐中的0.05％triton x-100)，将匀浆以六个10倍步长稀释。将50μl的每种稀释液转移到马血琼脂板上并在 37℃下孵育过夜。对含有30-300cfu的板上的菌落进行计数，并确定cfu/伤口的数量。
[0311]
结果：
[0312]
结果在图18中示出。