一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法与流程

1.本发明属于食品安全评价技术领域，涉及乳制品中溴氰菊酯毒性检测，具体地说是一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法。


背景技术：

2.溴氰菊酯是第二代拟除虫菊酯杀虫剂，是世界上应用最广泛的杀虫剂之一，由于其低毒、高效、残留少的优点，被广泛应用于农业和公共卫生领域。然而，大多数杀虫剂对生态系统都有影响，并且由于它们的广泛使用，会导致严重的环境问题：由于溴氰菊酯的亲脂性，生物膜和组织可以很容易地吸收它们，在生物体内长期积累的同时，可能对水生环境造成破坏。目前已在孕妇尿液中发现溴氰菊酯代谢物，接触溴氰菊酯可能导致低磷血症，这可能与电解质再分配和细胞内或细胞外区室之间的肾功能受损有关。溴氰菊酯通常对神经系统也有影响，会引起细胞凋亡，有研究表明溴氰菊酯可以诱导出现发育毒性、神经毒性和心血管毒性。
3.目前对于溴氰菊酯的检测多集中于仪器方法，只能机械的检测溴氰菊酯的含量，不能直观表示其生理毒性现象，但是由于生物体本身有一定的解毒能力；且一些有毒物质，如溴氰菊酯，会在生物体内富集或者代谢，这些都会对生物体内该物质的含量造成影响，因此仅用仪器检测的方法不能合理的表征溴氰菊酯含量对生物体造成的影响。现有技术中对溴氰菊酯的研究仅在部分植物、小鼠之间开展，并且只对溴氰菊酯进行某一器官的单独毒性研究，缺乏溴氰菊酯对生物体整体毒性水平的评价方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的，旨在要提供一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法，以解决现有技术中缺少能合理表征溴氰菊酯含量对生物体整体毒性影响的方法的问题。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法，包括依次进行的以下步骤：s1.制备梯度浓度的溴氰菊酯标准样品暴露液；s2.将斑马鱼胚胎暴露在溴氰菊酯标准样品暴露液中培养；s3.观测斑马鱼发育情况，拟合溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线，确定检出限；s4.将斑马鱼胚胎暴露在待测乳制品暴露液中培养，观测斑马鱼发育情况，将数据代入溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线，即可检测出待测乳制品中溴氰菊酯毒性水平，当数值大于检出限时报阳性检出。
6.作为一种限定，所述观测斑马鱼发育情况，观测指标包括孵化率、体长、头部面积、眼部面积、节间血管长度、背侧纵向吻合血管长度、心包水肿比例、心包面积和sv-ba距离。
7.作为另一种限定，所述步骤s1具体包括：
用经过处理的乳制品和二甲基亚砜作为溶剂将溴氰菊酯配置成不同浓度的标准样品浓缩液，再用培养水稀释，即得所述溴氰菊酯标准样品暴露液。
8.作为进一步限定，所述步骤s2具体包括：选择转基因斑马鱼与野生ab型斑马鱼进行侧交，取得受精卵，挑选发育正常的胚胎分别放入经培养水稀释的溶剂和不同浓度的溴氰菊酯标准样品暴露液中，每组设置平行样，27~28℃恒温培养24~72h。
9.作为更进一步限定，所述步骤s3具体包括：s31.将斑马鱼幼鱼摆放至两眼重合的侧卧位进行观测，若未孵化，则将膜挑破，再将斑马鱼幼鱼摆放至两眼重合的侧卧位进行观测，采集图像；s32.将采集的图像利用imagej软件分析，数据进行标准化，利用主成分降维后，利用最小二乘法进行拟合，即得溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线；s33.选择与经培养水稀释的溶剂中的斑马鱼幼鱼差异显著的溴氰菊酯标准样品暴露液的浓度作为检出限。
10.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
①
本发明提供的一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法，相较于现有技术中仪器检测溴氰菊酯含量的方法，其更能直观的展示溴氰菊酯的毒性对生物体的影响，且综合观测多种指标，确定检出限，更加科学合理地表示了生物体对不同含量的溴氰菊酯的生理反应；
②
本发明提供的一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法，用经过处理的乳制品和二甲基亚砜作为溶剂，可以消除乳制品中其他组分对生物体造成的影响，使得乳制品中溴氰菊酯的含量检测更加合理。
11.本发明提供一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法，可以直观展示溴氰菊酯对生物体的影响，综合多种观测指标，科学合理地测定了乳制品中的溴氰菊酯含量。
附图说明
12.图1为实施例中溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线；图2为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼的体长；图3为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼的头部面积；图4为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼的眼部面积；图5为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼的节间血管长度；图6为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼背侧纵向吻合血管长度；图7为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼心包面积；图8为实施例中暴露在乳制品中培养的斑马鱼sv-ba距离。
具体实施方式
13.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
14.实施例一种用斑马鱼评价乳制品中溴氰菊酯毒性水平的方法
本实施例具体包括依次进行的以下步骤：s1.制备梯度浓度的溴氰菊酯标准样品暴露液利用气相色谱-质谱联用仪对乳制品进行检测，找出不含溴氰菊酯的乳制品作为本底，准确称取乳制品2.00g（精确至0.01g），加0.5g氯化钠，5.0ml水，10.0ml乙腈，涡旋提取60s，超声提取10min，再以4000r/min离心5min，溶液分为水和乙腈层，在乙腈层准确移取5.0ml乙腈，于40℃氮吹至大约1ml；将其倾入预先用5ml乙腈预淋洗的c18固相萃取柱，用4ml乙腈洗脱，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，用0.5ml正己烷涡流混合溶解残渣后，倾入预先用5ml正己烷-乙酸乙酯预淋洗的氟罗里硅土固相萃取柱，用5.0ml正己烷-乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，采用1.0ml二甲基亚砜涡旋、复溶，得到基质浓缩液；准确称取溴氰菊酯加入到基质浓缩液中，分别配置溴氰菊酯浓度为0.1mg/l、1mg/l、10mg/l、25mg/l、50mg/l的溴氰菊酯标准样品浓缩液；暴露至斑马鱼时，将溴氰菊酯标准样品浓缩液分别利用培养水稀释1000倍，得到0.1μg/l、1μg/l、10μg/l、25μg/l、50μg/l的溴氰菊酯标准样品暴露液；s2.将斑马鱼胚胎暴露在溴氰菊酯标准样品暴露液中培养选择tg（flk:gfp）及tg（cmlc2:gfp）两种转基因斑马鱼分别与野生ab型斑马鱼进行侧交,将取得的受精卵移入培养皿，剔除发育异常的受精卵（包括死卵）以及杂质，利用培养水冲洗2~3遍，之后于体式显微镜下挑选出发育正常的胚胎用于暴露实验;取96孔成像板，每孔分别加入200μl用培养水稀释1000倍的基质浓缩液、不同浓度的溴氰菊酯标准样品暴露液以及挑选后的胚胎1枚，实验设置正常对照组（稀释后的基质浓缩液）和基质加标组（不同浓度的溴氰菊酯标准样品暴露液），每个处理组设置20个平行样，将96孔成像板放入恒温培养箱培养72h，恒温培养的温度为27℃；s3.观测斑马鱼发育情况，拟合溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线，确定检出限将斑马鱼幼鱼摆放至两眼重合的侧卧位进行观测，未孵化的，则用解剖镊轻轻将膜挑破，再用拨卵针将幼鱼身体摆正至两眼重合侧卧位进行观测，利用倒置荧光显微镜进行图像采集，观测指标为：孵化率、体长、头部面积、眼部面积、节间血管长度、背侧纵向吻合血管长度、心包水肿比例、心包面积和sv-ba距离；将采集得到的图像加上比例尺，并导出为图片格式（png、jpeg等），利用image j软件进行圈图及分析；数据利用spss软件先对9个变量进行标准化，再利用主成分进行降维后利用偏最小二乘回归法进行拟合，即得溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线，如图1所示；在溴氰菊酯标准样品浓度为50ppb时，基质加标组与对照组差异显著，故以50ppb为检出限；s4.选择tg（flk:gfp）及tg（cmlc2:gfp）两种转基因斑马鱼分别与野生ab型斑马鱼进行侧交,将取得的受精卵移入培养皿，剔除发育异常的受精卵（包括死卵）以及杂质，利用培养水冲洗2~3遍，之后于体式显微镜下挑选出发育正常的胚胎用于暴露实验；准确称取待检测的乳制品2.00g（精确至0.01g），加0.5g氯化钠，5.0ml水，10.0ml乙腈，涡旋提取60s，超声提取10min，再以4000r/min离心5min，溶液分为水和乙腈层，在乙腈层准确移取5.0ml乙腈，于40℃氮吹至大约1ml；
将其倾入预先用5ml乙腈预淋洗的c18固相萃取柱，用4ml乙腈洗脱，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，用0.5ml正己烷涡流混合溶解残渣后，倾入预先用5ml正己烷-乙酸乙酯预淋洗的氟罗里硅土固相萃取柱，用5.0ml正己烷-乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，于40℃氮吹至近干，采用1.0ml二甲基亚砜涡旋、复溶，得到乳制品样品浓缩液；将乳制品样品浓缩液用培养水稀释1000倍，得到乳制品样品暴露液；取96孔成像板，每孔加入200μl待检测的乳制品样品暴露液以及挑选后的胚胎1枚，设置20个平行样，将96孔成像板放入恒温培养箱培养72h，恒温培养的温度为27℃；将斑马鱼幼鱼摆放至两眼重合的侧卧位进行观测，未孵化的，则用解剖镊轻轻将膜挑破，再用拨卵针将幼鱼身体摆正至两眼重合侧卧位进行观测，利用倒置荧光显微镜进行图像采集，观测指标为：孵化率、体长、头部面积、眼部面积、节间血管长度、背侧纵向吻合血管长度、心包水肿比例、心包面积和sv-ba距离；将采集得到的图像加上比例尺，并导出为图片格式（png、jpeg等），利用image j软件进行圈图及分析，如图2~图8所示；其中孵化率为100%，体长为3.409mm，头部面积为0.155mm2，眼部面积为0.05mm2，节间血管长度为0.156mm，背侧纵向吻合血管长度为2.234mm，心包水肿比例为0%，心包面积为0.024mm2，sv-ba距离为0.27mm；将数据利用spss软件进行标准化，代入溴氰菊酯浓度-斑马鱼发育情况曲线，即可检测出乳制品中溴氰菊酯的浓度为0.002 ppb，数值小于50ppb，检出结果为阴性。