1.本发明涉及药物制备
技术领域：
：，尤其涉及电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.癫痫是一组脑部神经元异常放电导致的中枢神经系统短暂性功能障碍，威胁人类健康的慢性脑疾病，流行病学调查显示其发病率为5‰‑7‰。癫痫病如果能够得到合理有效治疗，约70％-80％可正常生活。目前控制癫痫发作仍以抗癫痫(anti-epilepticdrugs，aeds)药物为主，三分之二的发作可以通过合理服用抗癫痫药物得到控制，尽管近年来有大量新型抗癫痫药物以及新的治疗手段在癫痫治疗中应用，仍有30％最终发展为难治性癫痫(intractableepilepsy，ie)。3.目前针对难治性癫痫的治疗，一方面增加aeds剂量和品种，既大剂量多种aeds药物联合治疗，另一方面可采取外科手术治疗。但aeds药物联合治疗不仅增加患者经济负担，也不可避免产生药物毒副反应，造成全身系统损伤，而外科手术治疗价格昂贵，还要承受手术风险。因此寻求有效的、价格低廉、副作用低的治疗途径是癫痫治疗领域的热点。同时，进一步加强对癫痫正确诊断、有效治疗、发病机制、病理过程以及开发新的癫痫治疗途径的研究极为重要。4.癫痫病因错综复杂，病理及病理生理改变多样。病理表现主要为：神经元坏死、凋亡，神经胶质细胞增生，突触重塑，异常通路形成等密切相关。目前研究对于难治性癫痫病的解释有很多，其中一个极为重要的科学假说是血脑屏障中存在p-糖蛋白(p-gp)外排抗癫痫药物，导致脑脊液中抗癫痫药物浓度显著低于血清浓度，严重低于治疗剂量有关。其机制可能为脑血管内皮细胞中多药耐药1(mdr1)基因和其他外排转运蛋白(如多药耐药蛋白(mrp))编码的p-糖蛋白(p-gp)过表达在癫痫病灶区域内或周围可能导致癫痫的耐药性。临床众多抗癫痫药物，如拉莫三嗪(ltg)、托吡酯(tpm)、苯妥英钠(pht)、苯巴比妥(pb)、奥卡西平(oxc)、卡马西平(cbz)、非尔氨酯(fbm)、加巴喷丁(gbp)等，均由于该原因在治疗难治性癫痫时药效表现欠佳。如何减弱或逃逸p-gp外排作用，也成为难治性癫痫治疗中亟待解决的问题。5.综上，除了通过减少癫痫治疗中p-gp蛋白屏障效应外，通过削弱抗癫痫发作药物的跨血脑屏障的衰减效应，提高药物透过血脑屏障效率，并使药物载体具有电场亲和力及响应性，对痫性病灶具有电趋向性，亦可使致痫病灶周围局部药物浓度显著提高，从而达到治疗难治性癫痫为重要的研究方向。6.因此，本发明提供能够电响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法及其应用，为针对于难治性癫痫的新药的研发提供新的方向。技术实现要素：7.因此，基于以上背景，本发明的目的之一是提供电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法，其由电场响应性纳米载体、拉莫三嗪制成，其制备包括如下步骤：8.s1：将拉莫三嗪与电场响应性纳米载体按照比例，在pbs缓冲溶液中混合搅拌，终浓度为8-15mg/ml；9.s2：避光磁珠搅拌18-32h，1000-3000rpm离心10-30min除去过量的药物分子；10.s3：用pbs重悬洗涤一次至上清液无色透明，取上清液即为电场响应性拉莫三嗪制剂。11.本发明的目的之二是提供电场响应性纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：12.s1：以fecl3作为氧化剂，将二氨基吡啶单体于25-45℃中，在搅拌条件下进行聚合反应18-32h；13.s2：将s1的物料进行超声波进行分散，使得其成为均一溶液；14.s3：取s2的溶液滴在碳膜铜网上后，进行干燥后，即可获得纳米水凝胶冻干样的电场响应性纳米载体。15.本发明的目的之三是提供上述制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂的应用，其用于制备电场响应性拉莫三嗪复合片剂。16.进一步地，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂由权利要求4所述的电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、mcc(微晶纤维素)、cms-na(羧甲基淀粉钠)、pvpk30、tween-80、纯化水制成。17.进一步地，按重量计，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂所用原料的用量如下：18.电场响应性拉莫三嗪制剂30份、一水乳糖120份、mcc21.84份、cms-na4.5份、pvpk306份、tween-800.42份、纯化水21份。19.进一步地，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂的制备方法如下：20.s1：将电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、pvpk30混匀；21.s2：将tween-80溶于纯水中；22.s3：将步骤s2溶液加入s1中制软材；23.s4：过20目筛制粒，于60℃干燥至颗粒水分低于2％；24.s5：加入mcc和cms-na；混匀后加入适量的过80目筛的0.43％硬脂酸镁后，依次混匀，压片，包薄膜衣即可。25.本发明的目的之四是提供，本发明所制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂在制备抗癫痫药物中的应用。26.本发明的目的之五是提供，本发明所制备的电场响应性纳米载体在制备抗癫痫药物中的应用。27.采取上述技术方案，具有的有益效果如下：28.通过实验验证，本发明所制备的电场响应性纳米载体能够增加抗癫痫药物(拉莫三嗪)的血脑屏障效能，可提高拉莫三嗪的抗癫痫药效，以此可为难治性癫痫患者提供更价廉高效的抗癫痫药物的治疗选择。附图说明29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。30.图1为实施例:4的药效评价原理图；31.图2a为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的所用载体端粒径分布；32.图2b为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的载体端电位分c；33.图2c为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂载体的负载的sem图像；34.图2d为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的样品图；35.图3为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂体外释放曲线及在电场条件下的体外释放作用；36.图4为实施例4的大鼠海马神经元离体培养图片；37.图5为实施例4的拉莫三嗪纳米复合制剂细胞毒性检测；38.图6为实施例4的用药大鼠颞下颌关节he染色结果；39.图7为实施例4的拉莫三嗪纳米复合制剂及纳米空载载体细胞摄取结果；40.图8为实施例4的体外细胞抗癫痫效能评估；41.图9为实施例4的体外细胞抗癫痫效能评估结果。具体实施方式42.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。43.因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。下面结合实施例对本发明做进一步说明。44.实施例1：电场响应性纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：45.s1：以fecl3作为氧化剂，将二氨基吡啶单体于37℃中，在搅拌条件下进行聚合反应24h；46.s2：将s1的物料采用超声波震荡机进行超声波进行分散20分钟，使得其成为均一溶液；47.s3：取10ul的s2的溶液滴在碳膜铜网上后，进行干燥后，即可获得纳米水凝胶冻干样的电场响应性拉莫三嗪纳米载体。48.实施例2：以实施例1的电场响应性纳米载体制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法如下：49.s1：将拉莫三嗪与纳米载体按照质量1:1的比例，在pbs缓冲溶液中混合搅拌，终浓度为10mg/ml；50.s2：避光磁珠搅拌24h，1500rpm离心15min除去过量的药物分子；51.s3：用pbs重悬洗涤一次至上清液无色透明，取上清液即为电场响应性拉莫三嗪制剂。52.实施例3：采用实施例2的电场响应性拉莫三嗪复合制剂来制备电场响应性拉莫三嗪复合片剂，所用料如下：53.电场响应性拉莫三嗪制剂30g、一水乳糖120g、mcc21.84g、cms-na4.5g、pvpk306g、tween-800.42g、纯化水21g。54.所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂的制备方法如下：55.s1：将电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、pvpk30混匀；56.s2：将tween-80溶于纯水中；57.s3：将步骤s2溶液加入s1中制软材；58.s4：过20目筛制粒，于60℃干燥至颗粒水分低于2％；59.s5：加入mcc21.84g和cms-na4.5g；混匀后加入适量的过80目筛的0.43％硬脂酸镁后，依次混匀，压片，包薄膜衣即可。60.实施例4：实施例2的电场响应性拉莫三嗪复合制剂药效评价实验61.(1)电场响应性拉莫三嗪复合制剂药物代谢动力测定及毒理学检测62.1.1大鼠海马神经元离体培养63.1)分离海马：取e16-e18wistar大鼠胎鼠，75％酒精消毒后在无菌条件下断头，沿矢状缝剪开颅骨取脑,将大脑投入装有d-hanks液的培养皿中；用眼科弯镊轻轻拨开颞叶皮层,暴露双侧海马,钝性分离海马,置于另一个装有d-hanks液的培养皿中,仔细剥离脑膜和血管；再将己经剥离干净的海马移至装d-hanks液的培养皿中,剪碎海马组织成1mm*1mm*1mm的小块。64.2)消化离心，将剪碎的组织移入含有4-5倍体积0.125％胰酶的离心管中,在37℃水浴箱中作用10-15分钟,振荡数次，当消化液混浊、组织块成拉丝状时,吸除上层的胰酶液,加入3ml种植培养液终止消化,移液枪头轻轻吹打细胞数次,至液体成米糊状即停止吹打；1000转/分钟，离心5分钟。65.3)细胞计数及培养：弃上清后加入适量培养基，200目细胞筛过筛；取过筛后的单细胞悬液0.5ml于试管中，加入0.4％的台盼蓝溶液0.5ml，染色2-3分钟后显微镜下对活细胞进行计数，调整细胞浓度为1*106/ml，以此浓度接种于预先用多聚赖氨酸包被过夜的培养皿中，24小时后更换新鲜培养基，此后每3天换液，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。66.4)神经元鉴定：采用map-2染色鉴定海马神经元，细胞培养至6天，弃去培养基，pbs清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞30min，pbs清洗2*3min；3％去离子水室温处理5-10分钟，以灭活内源性酶；加入5％山羊血清封闭液，室温处理20min，弃去多余液体，勿洗；加入兔map-2抗体稀释液(1:100)，4℃孵育过夜；吸去一抗，pbs清洗2*3min；加入生物素标记二抗工作液，室温避光孵育1h，pbs清洗2*3min；加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温处理15min，pbs清洗2*3min；加入新鲜配制的dab显色液，室温放置5-10min，清水洗涤阻断显色；中性树胶封片，倒置相差显微镜下观察细胞情况，计算神经元纯度。67.5)癫痫细胞模型构建68.神经元细胞培养至第10天，无镁细胞外液处理3h，对照组正常细胞外液处理3h后更换为正常培养基继续培养至第14天。69.(2)电场响应性拉莫三嗪复合制剂细胞毒性检测70.不同浓度载体(由低到高浓度)与胚鼠海马神经元共培育，cck8法检测细胞毒性。采用公式如下：71.细胞抑制率(％)＝(1-odt/odc)×100％；72.上式中，odt为实验组570nm处的吸光度值，odc为空白对照组570nm处的吸光度值。73.(3)电场响应性拉莫三嗪复合制剂活体毒性实验74.3.1急性毒性试验75.急性毒性试验，由于拉莫三嗪及纳米载体比例为1:1对应，预先进行供试品储备液配制：取40mlpbs溶解预制备的拉莫三嗪纳米复合剂10g，充分溶解形成水凝胶后将上述溶液加入10k透析袋中，4℃，对pbs透析48h，4℃保存备用。使用前用pbs将供试品稀释到所需浓度。spf级昆明小鼠，雌雄各半5～6周60只(北京华阜康生物科技股份有限公司；实验动物生产许可证号：scxk(京)2019-0008；实验动物质量合格证编号：110322210103291948；spf级动物房：实验动物使用许可证号：syxk(吉)2021-0003，签发单位：吉林省科学技术厅)。76.根据预实验确定的最小全致死量1250mg/kg和最大非致死量312mg/kg，确定急毒正式试验最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，按照20ml/kg给予相应药品。具体分组情况见表1。77.表1：动物分组情况[0078][0079][0080]给药方法：所有动物，使用1ml注射器给予相应剂量供试品。每只动物的给药量根据测定的体重确定。给药体积介于两个分度容量线之间时，按照上位分度值吸取给药量。抽取供试品前用不带针头的合适注射器反复吹打供试品液2次。[0081]由于供试品临床拟给药途径为口服，所以选择灌胃给药，根据预实验确定的最小全致死量1250mg/kg和最大非致死量312mg/kg，确定急毒正式试验最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，分别为312mg/kg、412mg/kg、549mg/kg、722mg/kg、950mg/kg、1250mg/kg，灌胃给药1次，观察可能产生的毒性反应。[0082]3.2长期毒性试验[0083]长期毒性试验是观察动物因连续用药而产生的毒性反应及其严重程度，以及停药后的发展和恢复情况，为临床研究提供依据。[0084]如前预制备拉莫三嗪复合剂，spf级昆明小鼠，雌雄各半5～6周60只(批准文号如前)，根据单次给药毒性试验获得的最大非致死量(312mg/kg)，确定重复给药毒性试验剂量为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，灌胃注射给药，给药容量：20ml/kg，给药频率及期限：d1开始每周给药6次，连续给药24周，停药后恢复期4周。具体分组情况见表2。[0085]表2：动物分组情况[0086][0087]根据此剂量，设定重复给药队毒性试验中，大、中、小剂量分别为160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg；剂量相当于1120mg/人、560mg/人、280mg/人；受试物临床拟用药周期为长期用药，因此本研究中观察连续给药24周及恢复期4周小鼠可能产生的毒性反应。[0088]结果采集动物活体检测指标，死亡和濒死、体重、食量、血细胞计数及血生化，大体和组织病理学检查。对重要脏器病理学检查，在200倍数下详细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变如充血、淤血、出血、水肿、变性、坏死、增生、纤维化、机化、肉芽组织、炎性变化等情况文字描述。[0089]3.3生殖毒性试验[0090]生殖毒性试验是评价连续灌胃给予孕鼠拉莫三嗪纳米复合制剂，可能对胎鼠发育产生的影响。选取spf级昆明小鼠60只，雌鼠40只，雄鼠20只(实验动物来源证书如前)。雌雄小鼠于前日晚8:00按2:1夜间合笼，次日晨7:00前观察阴道栓。若观察到阴道栓为妊娠第1天，隔离饲养。将孕鼠按照体重随机分为四组，分别为溶媒对照组、拉莫三嗪纳米复合制剂小剂量组、中剂量组、大剂量组。给药途径：20ml/kg容量灌胃注射，孕6天至孕18天每天给药1次，连续给药13天。具体分组情况见下表3。[0091]表3：动物分组情况[0092][0093]结果观察大体观察：孕18天，通过脱臼方式处死孕鼠，对子宫、胎盘、胎鼠进行大体观察，记录胎鼠数量、吸收胎数量、胎盘、胎鼠重量、胎鼠发育情况评价、胎盘病理学检查。[0094]3.4药物代谢动力学[0095]sd大鼠随机分为2组，每个时间点每组6只，实验前一日晚上8：00开始禁食不禁水，试验当日早晨8：00给药，按50mg/kg腹腔注射ltg溶液作为对照组、腹腔注射相同剂量的ltg-nano(相当于ltg50mg/kg)作为实验组。于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h眼眶取血0.3ml，置肝素管中，4000rpm离心10min，取上清液按同样方法处理并检测。[0096](4)电场响应性拉莫三嗪复合制剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能比较[0097]4.1体外细胞摄取纳米复合剂的效能评估[0098]光显微镜观察bend.3细胞在含有10％fbs的dmem培养基中连续培养,将对数生长期的bend.3细胞以1×104个/孔的细胞密度种于24孔培养板中,待板中的细胞贴壁生长后，加入50ug/ml采用mcherry荧光染色标记的ltg纳米复合剂，mcherry标记的纳米载体空载体用作对照，并于37摄氏度分别孵育0.5h和2h后，吸去培养液，用冷的pbs洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛溶液固定细胞。加入5ug/ml的dio绿色细胞膜荧光探针标记细胞膜，并加入20ul的0.1mg/ml核染料物质dapi对细胞核进行染色，继续孵育30min，再用pbs洗涤细胞3次，取出盖玻片倒扣在载玻片上，封片，用荧光显微镜观察并拍照。[0099]4.2体外细胞抗癫痫效能评估[0100]采用前述构建的体外细胞模型，使用膜片钳鉴定阵发神经细胞发电异常,采用膜片钳放大器识取癫痫神经元模型的电压信号，并经digidata1440a转换器转换后输入计算机，分别采用pclamp9.2软件、fetchan6.0软件和origin9.1软件分析，记录神经元放电情况。给予拉莫三嗪纳米复合剂及拉莫三嗪原药(分别给予相同效价高至低剂量各3组)及空白对照组于体外细胞模型进行抗痫治疗，膜片钳测定，对比细胞模型放电频率、波幅改变。[0101]4.3癫痫大鼠体内实验抗癫痫效能评价[0102]应用亚抽搐剂量戊四氮建立慢性点燃动物模型,后给予较大剂量的一线的抗癫痫药物不规则给药进行诱导,最后制成难治性癫痈的动物模型。随着应用aed的剂量增加,耐药大鼠数量显著增加。给予拉莫三嗪纳米复合剂及拉莫三嗪原药及空白对照组以比较抗癫痫疗效。[0103]5电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的研制[0104]5.1本实施例采用实施例3制备的电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂。[0105]1)工艺筛选直接压片法压制样品，一定条件下放置10天，分别于0、5、10天取样检测药物的含量、有关物质和溶出度。[0106]2)制剂的质量研究[0107]①含量测定[0108]建立hplc法测定药物含量的方法。[0109]5.2电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的初步稳定性研究[0110](1)影响因素试验[0111]①高温试验[0112]取自制拉莫三嗪纳米复合制剂片剂，裸露置于开口洁净容器中，于60℃放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0113]②高湿试验[0114]取自制纳米片剂(即拉莫三嗪纳米复合制剂片剂)，裸露置于开口洁净恒湿容器中，在25℃，湿度rh值为90％±5％条件下放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0115]③强光照射试验[0116]取自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，裸露置于开口光照培养箱内，在照度为(4500±500)lx条件下放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0117]④加速试验[0118]取3批自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，按市售包装，置于恒温培养箱内，在温度为(40±2)℃，rh值为(75±5)％条件下放置6个月。于第1、2、3、6月末分别取样，测定含量，溶出度。[0119]⑤留样试验[0120]取3批自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，按市售包装，置于恒温培养箱内，在温度为(25±2)℃，rh值为(60±10)％条件下放置。于第0、3、6月末分别取样，测定含量及溶出度。[0121]6统计分析[0122]使用spss22.0软件进行统计学分析。采用t检验(统计结果以平均值±标准差表示)、x2检验、wilcoxonmann-whitney秩和检验(两独立样本之间比较，统计结果以中位数和范围表示),p值≤0.05被认为差异有统计学意义。[0123]7实验结果[0124]7.1本实施例在体外合成了电场响应性拉莫三嗪纳米复合剂，进而通过体外及大鼠体内实验对其安全性，有效性进行了验证，其采用所制备的载体提高药效的原理见图1。[0125]7.2电响应性拉莫三嗪纳米复合制剂的制备[0126](1)电响应性拉莫三嗪纳米载体[0127]采用实施例1制备电响应性拉莫三嗪纳米载体，其纳米水凝胶的得率、溶胀率、粒径、多分散系数、电位、电导率及黏度测定结果见表4、图2(a,b)，其中图2(a)为纳米孔载体的粒径分布，图2(b)为拉莫三嗪纳米复合剂的载体端电位分布。[0128]表4：纳米水凝胶载体的性质[0129][0130](2)拉莫三嗪纳米复制剂[0131]采用实施例2制备电响应性拉莫三嗪复合制剂，此过程也即是将载体与药物的结合的过程，制作过程中空载体sem图像见图2(c)，制成的拉莫三嗪纳米复合制剂(ltg-nano)的样品见图2(d)。[0132]7.3电响应拉莫三嗪纳米复合制剂药物代谢动力测定及毒理学检测[0133](1)拉莫三嗪纳米复合制剂的理化性质[0134]ltg(拉莫三嗪)和ltg-nano(拉莫三嗪纳米复合制剂)在ph7.4的pbs中的体外药物释放曲线如图3a所示，可见复合制剂(载药纳米水凝胶ltg-nano)的体外药物释放行为几乎一致，其8h的药物累积释放百分率分别为52.7％和54.3％，24h为84.3％和85.8％。进一步评价在电场作用下两种药物(分别为ltg和ltg-nano)的体外释放行为，以明确纳米复合制剂修饰是否对电场有积极的响应，简要步骤为：将负载药物的材料修饰在玻碳电极表面，以pt电极作为对电极，两个电极共同插入ph7.4的pbs缓冲溶液中，两个电极之间的距离是1cm，在两个电极之间施加一定的电位刺激药物的释放，然后再通过紫外光谱测定药物的释放量。结果见图3b。相较于普通ltg药物，拉莫三嗪纳米复合剂在电场条件下具有更好的药物释放作用。[0135](2)大鼠海马神经元离体培养[0136]大鼠原代海马神经元细胞种板后1-2小时开始贴壁，24小时候开始有突起，72h后可见明显轴突与树突。通过map-2免疫细胞化学染色，倒置相差显微镜下可见棕黄色颗粒沉积，pbs代替一抗的对照组中并无此现象，鉴定神经元纯度在90％以(图4(a,b))上。[0137]神经元体外培养至10天，无镁细胞外液处理后的神经元细胞较正常细胞外液处理后的神经元细胞，突触间融合更加明显，异常网络结构初步形成(图4(c,d))。[0138](3)拉莫三嗪纳米复合制剂细胞毒性检测[0139]采用cck8法测定拉莫三嗪纳米复合剂对bend.3细胞的增值抑制能力，并计算其半数细胞抑制浓度(ic50值)，结果如图5a中所示。ltg纳米复合剂和ltg原药对bend.3细胞的增殖抑制作用均呈现浓度依赖性，两者的ic50值分别为639.0ug/ml和614.9ug/ml，没有显著性差异，表现为相对低的细胞毒性。pi染色(图5c,d)和流式细胞术(图5b)的相关结果也表明，无论是ltg纳米复合剂和ltg原药的细胞毒性均较低，具有良好的生物安全性。[0140](4)拉莫三嗪纳米复合制剂活体毒性[0141]有文献表明(lamotrigine-inducedlupus)，ltg的过量使用会影响患者关节的生理学结构。生理浓度的ltg-nano是否会对机体组织产生毒理影响尚不明确。本实验采用大鼠颞下颌关节组织进行he染色观察，相较于ctrl组(图6(a,c))，ltg-nano组(图6(b,d))未见明显异常现象。[0142](5)急性毒性试验[0143]选取昆明小鼠单次灌胃给予拉莫三嗪纳米复合制剂，评价可能出现的急性毒性反应。供试品临床拟给药途径为口服，因此选择灌胃给药，确定最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，分别为312mg/kg、412mg/kg、549mg/kg、722mg/kg、950mg/kg、1250mg/kg，灌胃给药1次，观察可能产生的毒性反应。观察给药当天药后笼旁观察，包括动物死亡、发病、呼吸、分泌物、粪便以及饮食饮水情况。体重、食量、大体和组织病理学检查。结果显示体重可见一定的剂量反应关系。脏器重量与同期同性别1组动物相比，各组动物d15的脏器重量、脏器系数未见统计学意义的改变。大体解剖观察中d15对所有存活小鼠进行系统的大体解剖检查，未见大体病理学改变。950mg/kg组和722mg/kg组动雄性物d1-d7出现体重增长和食量的降低，脏器重量和脏器系数未见异常。[0144](6)急性毒性试验[0145]长期毒性试验采用昆明小鼠重复灌胃给予拉莫三嗪纳米复合制剂24周及恢复期4周，评价可能出现的毒性反应。根据单次给药毒性试验获得的最大非致死量(312mg/kg)，确定重复给药毒性试验剂量为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg。灌胃注射，观察连续给药24周及恢复期4周小鼠可能产生的毒性反应。所获结果显示，剂量分别为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，重复灌胃给予昆明小鼠拉莫三嗪纳米复合制剂24周及停药后恢复4周，小鼠体重增长、食量、脏器重量、脏器系数、血细胞计数、血液生化检测以及主要脏器的组织学检查未见异常。进行重要脏器24周及停药后恢复4周病理检查，在200倍数下详细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变如充血、淤血、出血、水肿、变性、坏死、增生、纤维化、机化、肉芽组织、炎性变化等情况文字描述，并反映出片子之间的差异。结果显示：心肌纤维、肝脏、脾脏、肺组织、肾脏组织、脑皮层、卵巢组织、子宫、肾上腺、胸腺、甲状腺和睾丸未见异常。[0146](7)生殖毒性试验[0147]评价连续灌胃给予孕鼠拉莫三嗪纳米复合制剂，可能对胎鼠发育产生的影响。自孕6天起，每天按照体重灌胃给予对应供试品，直至孕18天，设定剂量为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，根据体表面积折算为人的剂量为210mg/人、420mg/人、840mg/人，自孕6天开始给药至孕18天，相当于孕中期开始给药至孕晚期。分析死亡和濒死、体重、胎鼠和吸收胎数量、胎盘、胎鼠重量、胎鼠发育情况分析、胎盘病理学检查，结果显示昆明小鼠孕6天至孕18天连续灌胃给药13天，剂量分别为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。未见孕鼠状态、胎盘结构和胎鼠发育的异常。[0148]7.4药物代谢动力学[0149]腹腔注射单纯ltg后药物被迅速吸收入血，血药浓度迅速升高，ltg的治疗窗狭窄，ltg血药浓度高于有效血药浓度(10-20ug/ml)，可能会发生中毒现象。ltg个体药代动力学参数差异大，治疗癫痫患者往往是进行血药浓度的监测，实行个体化给药。本实验测得ltg溶液及ltg纳米复合剂(拉莫三嗪纳米复合制剂)的相关数据见表5。[0150]表5：两种药物的药代动力学[0151][0152]两种药物给药后，大鼠体内的药动学过程均符合二室模型。如表5所示，ltg-nano溶液在大鼠体内的药代动力学过程与ltg溶液相比发生了较大的变化，其体内消除半衰期(t1/2)延长了近3倍，平均滞留时间(mrt)延长了2倍，具有显著性差异(p《0.01)，药物吸收常数ka显著提高，cmax提高，以上结果均表明拉莫三嗪纳米制剂在体内吸收快，消除较慢，达到了缓释的效果，明显地延长了ltg在体内循环的时间(p《0.05)。[0153]同样采用das2.0药动学软件对ltg溶液和ltg纳米复合剂在大鼠体内的组织中的药物浓度数据进行处理，得到的药代动力学主要参数见表6。可见与ltg溶液相比，ltg-nano溶液在肝、脾、肾组织的auc分别增加了1.44、3.05、2.50和1.60、2.74、2.25倍，在脑组织的auc分别增加了1.40和3.36倍。[0154]表6：大鼠体内各组织药物浓度的药代动力学[0155][0156]7.5拉莫三嗪纳米复合制剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能比较[0157](1)体外细胞拉莫三嗪纳米复合制剂摄取实验[0158]本实验采用mcherry标记的纳米载体进行细胞摄取实验，以方便荧光显微镜定性观察定量测定bend.3小鼠脑微血管内皮细胞与空纳米载体(图7a)和ltg-nano(图7b)孵育后2h,相关细胞摄取结果见图7，图7中的mcherry为荧光探针，dio荧光染料为靶标细胞膜结构，dapidio荧光染料为靶标细胞核，merge融合图像可见mcherry为荧光探针纳米载体透过脑微血管内皮细胞网络结构。[0159](2)体外细胞抗癫痫效能评估[0160]全细胞膜片钳实验结果表明：拉莫三嗪纳米复合剂与拉莫三嗪对癫痫细胞的放电反应均有一定的抑制作用，相较于原药，其抗癫痫放电作用的几乎相当(抗癫痫效能差值在20％以内)，结果见图8。[0161](3)癫痫大鼠体内实验抗癫痫效能评价[0162]本实验采用两种大鼠癫痫模型，以在体内验证拉莫三嗪纳米复合剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能的比较。其分别为大鼠最大电休克癫痫模型和鼠ptz诱导的癫痫模型。[0163]最大电休克(maximalelectroshockseizure，mes)模型是使用最多的癫痫模型，模型制作简便，惊厥率高，广泛应用于抗癫痫药物的高通量筛选[6]。若给予aeds后，动物不再出现后肢强直，即提示该药有抗mes效应，在实验中常以给药后惊厥中强直消失为该药物控制有效的指标[7]。在本实验的大鼠最大电休克模型中，ltg溶液，和ltg-nano溶液均能呈现剂量依赖性地缓解强直发作，表现为降低发作等级和缩短强直发作的持续时间(图9(a,b))。在剂量为20mg/g时，ltg-nano溶液相比ltg溶液有更好的抗癫痫作用，表现为发作更低的发作等级和更短的强直时间(1.9±1.3)svs(6.8±1.5)s提示ltg-nano可以降低治疗的有效治疗浓度(图9(a,b)。[0164]进一步采用化学试剂ptz诱导并筛选出难治性大鼠癫痫模型来评价ltg制剂的抗癫痫药效。ptz是一种具有致痉作用的四唑衍生物，通过作用于γ-氨基丁酸a型受体(gabaa受体)，阻断gaba介导的抑制作用而诱发癫痫。戊四氮诱导的癫痫发作与人类癫痫发作的行为学改变及神经病理改变高度相似，广泛用于颞叶癫痫发病机理及筛选抗癫痫药物的研究中。在本实验ptz诱发的急性癫痫模型中，剂量为50mg/kg时，两种ltg制剂(ltg溶液和ltg-nano溶液)均能有效降低发作等级并延长大发作的潜伏期。而在10mg/kg或20mg/kg时，ltg-nano溶液明显具有更好的抗癫痫效果，大大的延长发作的潜伏期(图9(c,d))。[0165]7.6电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的初步稳定性研究[0166]实施例3中通过直接压片法获得电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂，[0167]在强光实验中，将制成的药片直接暴露于空气中，测得其含水量有轻微的变化。采用高效液相色谱法测定了强光照射后三种药物前后的含量变化。结果表明，经强光照射10天后药片中的主药含量等指标并未发生改变，其也未出现降解产物(表7)，符合中国药典的要求。[0168]表7：强光照射实验结果[0169][0170][0171]在高温实验考察中，将药片直接暴露于烘箱热空气中，所有样品的液相色谱均没有杂质出现，主药成分含量指标没有改变，并且未发现新的降解产物。上述结果表明，ltg-nano与其辅料没有发生相互作用，各项数据见表8。[0172]表8：高温(60℃)实验考察结果[0173][0174]在高湿实验考察中，将药片直接暴露于90％的湿空气中，高效液相色谱法测定主药含量，由图谱可见，供试品和样品的谱图均没有出现新的杂质峰。进行相关物质分析，结果表明主药成分含量指标没有改变，并且未发现新的降解产物。上述结果表明，ltg-nano与其辅料没有发生相互作用，在高湿环境下复合标准，各项数据见表9。[0175]表9:高湿(90％)实验考察结果[0176][0177]取电场响应性拉莫三嗪复合片剂10片，分成两组，每组5片，分别称定每组的质量，然后放入脆碎度测定装置的塑料盒中，开动机器，旋转震荡3分钟后取出，再次测定每组的质量并求出其损失率，其测定结果见表10。[0178]表10:脆碎度测定结果[0179][0180]从上表测定的结果可以看出，测定前后的片剂质量损失率均低于中国药典的标准，该片剂的脆碎度符合要求。[0181]将压制好的电场响应性拉莫三嗪复合片剂按照中国药典中记载的方法和标准制作成6个样品，在紫外分光光度计下测定其吸光度。溶出度实验结果见表11。[0182]表11：溶出度测定结果[0183][0184]从上述结果可得出，所有样品在45分钟的溶出度均大于80％，符合中国药典关于溶出度的有关规定。[0185]结果表明，本发明通过电场响应性纳米载体可以以电场响应的方式协助拉莫三嗪药物穿透血脑屏障，有效的减少p-gp过表达导致的难治性耐药型癫痫病，其可以有效弥补现阶段实验室中通过抑制血脑屏障中p-gp表达来抑制耐药型癫痫的耐药性操作复杂且效果不佳的问题。[0186]本发明所制备电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂在体内及体外实验中表现出其具有低毒性，高血脑屏障穿透效率，无机体其他副作用的优势。采用常规手段制作的电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂复合中国药典的各项规定，具有良好的稳定性和溶出率，有望成为治疗耐药型癫痫的新的临床一线药物。[0187]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，尤其涉及电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.癫痫是一组脑部神经元异常放电导致的中枢神经系统短暂性功能障碍，威胁人类健康的慢性脑疾病，流行病学调查显示其发病率为5‰‑7‰。癫痫病如果能够得到合理有效治疗，约70％-80％可正常生活。目前控制癫痫发作仍以抗癫痫(anti-epilepticdrugs，aeds)药物为主，三分之二的发作可以通过合理服用抗癫痫药物得到控制，尽管近年来有大量新型抗癫痫药物以及新的治疗手段在癫痫治疗中应用，仍有30％最终发展为难治性癫痫(intractableepilepsy，ie)。3.目前针对难治性癫痫的治疗，一方面增加aeds剂量和品种，既大剂量多种aeds药物联合治疗，另一方面可采取外科手术治疗。但aeds药物联合治疗不仅增加患者经济负担，也不可避免产生药物毒副反应，造成全身系统损伤，而外科手术治疗价格昂贵，还要承受手术风险。因此寻求有效的、价格低廉、副作用低的治疗途径是癫痫治疗领域的热点。同时，进一步加强对癫痫正确诊断、有效治疗、发病机制、病理过程以及开发新的癫痫治疗途径的研究极为重要。4.癫痫病因错综复杂，病理及病理生理改变多样。病理表现主要为：神经元坏死、凋亡，神经胶质细胞增生，突触重塑，异常通路形成等密切相关。目前研究对于难治性癫痫病的解释有很多，其中一个极为重要的科学假说是血脑屏障中存在p-糖蛋白(p-gp)外排抗癫痫药物，导致脑脊液中抗癫痫药物浓度显著低于血清浓度，严重低于治疗剂量有关。其机制可能为脑血管内皮细胞中多药耐药1(mdr1)基因和其他外排转运蛋白(如多药耐药蛋白(mrp))编码的p-糖蛋白(p-gp)过表达在癫痫病灶区域内或周围可能导致癫痫的耐药性。临床众多抗癫痫药物，如拉莫三嗪(ltg)、托吡酯(tpm)、苯妥英钠(pht)、苯巴比妥(pb)、奥卡西平(oxc)、卡马西平(cbz)、非尔氨酯(fbm)、加巴喷丁(gbp)等，均由于该原因在治疗难治性癫痫时药效表现欠佳。如何减弱或逃逸p-gp外排作用，也成为难治性癫痫治疗中亟待解决的问题。5.综上，除了通过减少癫痫治疗中p-gp蛋白屏障效应外，通过削弱抗癫痫发作药物的跨血脑屏障的衰减效应，提高药物透过血脑屏障效率，并使药物载体具有电场亲和力及响应性，对痫性病灶具有电趋向性，亦可使致痫病灶周围局部药物浓度显著提高，从而达到治疗难治性癫痫为重要的研究方向。6.因此，本发明提供能够电响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法及其应用，为针对于难治性癫痫的新药的研发提供新的方向。技术实现要素：7.因此，基于以上背景，本发明的目的之一是提供电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法，其由电场响应性纳米载体、拉莫三嗪制成，其制备包括如下步骤：8.s1：将拉莫三嗪与电场响应性纳米载体按照比例，在pbs缓冲溶液中混合搅拌，终浓度为8-15mg/ml；9.s2：避光磁珠搅拌18-32h，1000-3000rpm离心10-30min除去过量的药物分子；10.s3：用pbs重悬洗涤一次至上清液无色透明，取上清液即为电场响应性拉莫三嗪制剂。11.本发明的目的之二是提供电场响应性纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：12.s1：以fecl3作为氧化剂，将二氨基吡啶单体于25-45℃中，在搅拌条件下进行聚合反应18-32h；13.s2：将s1的物料进行超声波进行分散，使得其成为均一溶液；14.s3：取s2的溶液滴在碳膜铜网上后，进行干燥后，即可获得纳米水凝胶冻干样的电场响应性纳米载体。15.本发明的目的之三是提供上述制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂的应用，其用于制备电场响应性拉莫三嗪复合片剂。16.进一步地，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂由权利要求4所述的电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、mcc(微晶纤维素)、cms-na(羧甲基淀粉钠)、pvpk30、tween-80、纯化水制成。17.进一步地，按重量计，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂所用原料的用量如下：18.电场响应性拉莫三嗪制剂30份、一水乳糖120份、mcc21.84份、cms-na4.5份、pvpk306份、tween-800.42份、纯化水21份。19.进一步地，所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂的制备方法如下：20.s1：将电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、pvpk30混匀；21.s2：将tween-80溶于纯水中；22.s3：将步骤s2溶液加入s1中制软材；23.s4：过20目筛制粒，于60℃干燥至颗粒水分低于2％；24.s5：加入mcc和cms-na；混匀后加入适量的过80目筛的0.43％硬脂酸镁后，依次混匀，压片，包薄膜衣即可。25.本发明的目的之四是提供，本发明所制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂在制备抗癫痫药物中的应用。26.本发明的目的之五是提供，本发明所制备的电场响应性纳米载体在制备抗癫痫药物中的应用。27.采取上述技术方案，具有的有益效果如下：28.通过实验验证，本发明所制备的电场响应性纳米载体能够增加抗癫痫药物(拉莫三嗪)的血脑屏障效能，可提高拉莫三嗪的抗癫痫药效，以此可为难治性癫痫患者提供更价廉高效的抗癫痫药物的治疗选择。附图说明29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。30.图1为实施例:4的药效评价原理图；31.图2a为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的所用载体端粒径分布；32.图2b为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的载体端电位分c；33.图2c为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂载体的负载的sem图像；34.图2d为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂的样品图；35.图3为实施例4所制备的拉莫三嗪纳米复合制剂体外释放曲线及在电场条件下的体外释放作用；36.图4为实施例4的大鼠海马神经元离体培养图片；37.图5为实施例4的拉莫三嗪纳米复合制剂细胞毒性检测；38.图6为实施例4的用药大鼠颞下颌关节he染色结果；39.图7为实施例4的拉莫三嗪纳米复合制剂及纳米空载载体细胞摄取结果；40.图8为实施例4的体外细胞抗癫痫效能评估；41.图9为实施例4的体外细胞抗癫痫效能评估结果。具体实施方式42.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。43.因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。下面结合实施例对本发明做进一步说明。44.实施例1：电场响应性纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：45.s1：以fecl3作为氧化剂，将二氨基吡啶单体于37℃中，在搅拌条件下进行聚合反应24h；46.s2：将s1的物料采用超声波震荡机进行超声波进行分散20分钟，使得其成为均一溶液；47.s3：取10ul的s2的溶液滴在碳膜铜网上后，进行干燥后，即可获得纳米水凝胶冻干样的电场响应性拉莫三嗪纳米载体。48.实施例2：以实施例1的电场响应性纳米载体制备的电场响应性拉莫三嗪复合制剂的制备方法如下：49.s1：将拉莫三嗪与纳米载体按照质量1:1的比例，在pbs缓冲溶液中混合搅拌，终浓度为10mg/ml；50.s2：避光磁珠搅拌24h，1500rpm离心15min除去过量的药物分子；51.s3：用pbs重悬洗涤一次至上清液无色透明，取上清液即为电场响应性拉莫三嗪制剂。52.实施例3：采用实施例2的电场响应性拉莫三嗪复合制剂来制备电场响应性拉莫三嗪复合片剂，所用料如下：53.电场响应性拉莫三嗪制剂30g、一水乳糖120g、mcc21.84g、cms-na4.5g、pvpk306g、tween-800.42g、纯化水21g。54.所述电场响应性拉莫三嗪复合片剂的制备方法如下：55.s1：将电场响应性拉莫三嗪制剂、一水乳糖、pvpk30混匀；56.s2：将tween-80溶于纯水中；57.s3：将步骤s2溶液加入s1中制软材；58.s4：过20目筛制粒，于60℃干燥至颗粒水分低于2％；59.s5：加入mcc21.84g和cms-na4.5g；混匀后加入适量的过80目筛的0.43％硬脂酸镁后，依次混匀，压片，包薄膜衣即可。60.实施例4：实施例2的电场响应性拉莫三嗪复合制剂药效评价实验61.(1)电场响应性拉莫三嗪复合制剂药物代谢动力测定及毒理学检测62.1.1大鼠海马神经元离体培养63.1)分离海马：取e16-e18wistar大鼠胎鼠，75％酒精消毒后在无菌条件下断头，沿矢状缝剪开颅骨取脑,将大脑投入装有d-hanks液的培养皿中；用眼科弯镊轻轻拨开颞叶皮层,暴露双侧海马,钝性分离海马,置于另一个装有d-hanks液的培养皿中,仔细剥离脑膜和血管；再将己经剥离干净的海马移至装d-hanks液的培养皿中,剪碎海马组织成1mm*1mm*1mm的小块。64.2)消化离心，将剪碎的组织移入含有4-5倍体积0.125％胰酶的离心管中,在37℃水浴箱中作用10-15分钟,振荡数次，当消化液混浊、组织块成拉丝状时,吸除上层的胰酶液,加入3ml种植培养液终止消化,移液枪头轻轻吹打细胞数次,至液体成米糊状即停止吹打；1000转/分钟，离心5分钟。65.3)细胞计数及培养：弃上清后加入适量培养基，200目细胞筛过筛；取过筛后的单细胞悬液0.5ml于试管中，加入0.4％的台盼蓝溶液0.5ml，染色2-3分钟后显微镜下对活细胞进行计数，调整细胞浓度为1*106/ml，以此浓度接种于预先用多聚赖氨酸包被过夜的培养皿中，24小时后更换新鲜培养基，此后每3天换液，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。66.4)神经元鉴定：采用map-2染色鉴定海马神经元，细胞培养至6天，弃去培养基，pbs清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞30min，pbs清洗2*3min；3％去离子水室温处理5-10分钟，以灭活内源性酶；加入5％山羊血清封闭液，室温处理20min，弃去多余液体，勿洗；加入兔map-2抗体稀释液(1:100)，4℃孵育过夜；吸去一抗，pbs清洗2*3min；加入生物素标记二抗工作液，室温避光孵育1h，pbs清洗2*3min；加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温处理15min，pbs清洗2*3min；加入新鲜配制的dab显色液，室温放置5-10min，清水洗涤阻断显色；中性树胶封片，倒置相差显微镜下观察细胞情况，计算神经元纯度。67.5)癫痫细胞模型构建68.神经元细胞培养至第10天，无镁细胞外液处理3h，对照组正常细胞外液处理3h后更换为正常培养基继续培养至第14天。69.(2)电场响应性拉莫三嗪复合制剂细胞毒性检测70.不同浓度载体(由低到高浓度)与胚鼠海马神经元共培育，cck8法检测细胞毒性。采用公式如下：71.细胞抑制率(％)＝(1-odt/odc)×100％；72.上式中，odt为实验组570nm处的吸光度值，odc为空白对照组570nm处的吸光度值。73.(3)电场响应性拉莫三嗪复合制剂活体毒性实验74.3.1急性毒性试验75.急性毒性试验，由于拉莫三嗪及纳米载体比例为1:1对应，预先进行供试品储备液配制：取40mlpbs溶解预制备的拉莫三嗪纳米复合剂10g，充分溶解形成水凝胶后将上述溶液加入10k透析袋中，4℃，对pbs透析48h，4℃保存备用。使用前用pbs将供试品稀释到所需浓度。spf级昆明小鼠，雌雄各半5～6周60只(北京华阜康生物科技股份有限公司；实验动物生产许可证号：scxk(京)2019-0008；实验动物质量合格证编号：110322210103291948；spf级动物房：实验动物使用许可证号：syxk(吉)2021-0003，签发单位：吉林省科学技术厅)。76.根据预实验确定的最小全致死量1250mg/kg和最大非致死量312mg/kg，确定急毒正式试验最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，按照20ml/kg给予相应药品。具体分组情况见表1。77.表1：动物分组情况[0078][0079][0080]给药方法：所有动物，使用1ml注射器给予相应剂量供试品。每只动物的给药量根据测定的体重确定。给药体积介于两个分度容量线之间时，按照上位分度值吸取给药量。抽取供试品前用不带针头的合适注射器反复吹打供试品液2次。[0081]由于供试品临床拟给药途径为口服，所以选择灌胃给药，根据预实验确定的最小全致死量1250mg/kg和最大非致死量312mg/kg，确定急毒正式试验最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，分别为312mg/kg、412mg/kg、549mg/kg、722mg/kg、950mg/kg、1250mg/kg，灌胃给药1次，观察可能产生的毒性反应。[0082]3.2长期毒性试验[0083]长期毒性试验是观察动物因连续用药而产生的毒性反应及其严重程度，以及停药后的发展和恢复情况，为临床研究提供依据。[0084]如前预制备拉莫三嗪复合剂，spf级昆明小鼠，雌雄各半5～6周60只(批准文号如前)，根据单次给药毒性试验获得的最大非致死量(312mg/kg)，确定重复给药毒性试验剂量为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，灌胃注射给药，给药容量：20ml/kg，给药频率及期限：d1开始每周给药6次，连续给药24周，停药后恢复期4周。具体分组情况见表2。[0085]表2：动物分组情况[0086][0087]根据此剂量，设定重复给药队毒性试验中，大、中、小剂量分别为160mg/kg、80mg/kg、40mg/kg；剂量相当于1120mg/人、560mg/人、280mg/人；受试物临床拟用药周期为长期用药，因此本研究中观察连续给药24周及恢复期4周小鼠可能产生的毒性反应。[0088]结果采集动物活体检测指标，死亡和濒死、体重、食量、血细胞计数及血生化，大体和组织病理学检查。对重要脏器病理学检查，在200倍数下详细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变如充血、淤血、出血、水肿、变性、坏死、增生、纤维化、机化、肉芽组织、炎性变化等情况文字描述。[0089]3.3生殖毒性试验[0090]生殖毒性试验是评价连续灌胃给予孕鼠拉莫三嗪纳米复合制剂，可能对胎鼠发育产生的影响。选取spf级昆明小鼠60只，雌鼠40只，雄鼠20只(实验动物来源证书如前)。雌雄小鼠于前日晚8:00按2:1夜间合笼，次日晨7:00前观察阴道栓。若观察到阴道栓为妊娠第1天，隔离饲养。将孕鼠按照体重随机分为四组，分别为溶媒对照组、拉莫三嗪纳米复合制剂小剂量组、中剂量组、大剂量组。给药途径：20ml/kg容量灌胃注射，孕6天至孕18天每天给药1次，连续给药13天。具体分组情况见下表3。[0091]表3：动物分组情况[0092][0093]结果观察大体观察：孕18天，通过脱臼方式处死孕鼠，对子宫、胎盘、胎鼠进行大体观察，记录胎鼠数量、吸收胎数量、胎盘、胎鼠重量、胎鼠发育情况评价、胎盘病理学检查。[0094]3.4药物代谢动力学[0095]sd大鼠随机分为2组，每个时间点每组6只，实验前一日晚上8：00开始禁食不禁水，试验当日早晨8：00给药，按50mg/kg腹腔注射ltg溶液作为对照组、腹腔注射相同剂量的ltg-nano(相当于ltg50mg/kg)作为实验组。于给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h眼眶取血0.3ml，置肝素管中，4000rpm离心10min，取上清液按同样方法处理并检测。[0096](4)电场响应性拉莫三嗪复合制剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能比较[0097]4.1体外细胞摄取纳米复合剂的效能评估[0098]光显微镜观察bend.3细胞在含有10％fbs的dmem培养基中连续培养,将对数生长期的bend.3细胞以1×104个/孔的细胞密度种于24孔培养板中,待板中的细胞贴壁生长后，加入50ug/ml采用mcherry荧光染色标记的ltg纳米复合剂，mcherry标记的纳米载体空载体用作对照，并于37摄氏度分别孵育0.5h和2h后，吸去培养液，用冷的pbs洗涤细胞3次，用4％多聚甲醛溶液固定细胞。加入5ug/ml的dio绿色细胞膜荧光探针标记细胞膜，并加入20ul的0.1mg/ml核染料物质dapi对细胞核进行染色，继续孵育30min，再用pbs洗涤细胞3次，取出盖玻片倒扣在载玻片上，封片，用荧光显微镜观察并拍照。[0099]4.2体外细胞抗癫痫效能评估[0100]采用前述构建的体外细胞模型，使用膜片钳鉴定阵发神经细胞发电异常,采用膜片钳放大器识取癫痫神经元模型的电压信号，并经digidata1440a转换器转换后输入计算机，分别采用pclamp9.2软件、fetchan6.0软件和origin9.1软件分析，记录神经元放电情况。给予拉莫三嗪纳米复合剂及拉莫三嗪原药(分别给予相同效价高至低剂量各3组)及空白对照组于体外细胞模型进行抗痫治疗，膜片钳测定，对比细胞模型放电频率、波幅改变。[0101]4.3癫痫大鼠体内实验抗癫痫效能评价[0102]应用亚抽搐剂量戊四氮建立慢性点燃动物模型,后给予较大剂量的一线的抗癫痫药物不规则给药进行诱导,最后制成难治性癫痈的动物模型。随着应用aed的剂量增加,耐药大鼠数量显著增加。给予拉莫三嗪纳米复合剂及拉莫三嗪原药及空白对照组以比较抗癫痫疗效。[0103]5电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的研制[0104]5.1本实施例采用实施例3制备的电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂。[0105]1)工艺筛选直接压片法压制样品，一定条件下放置10天，分别于0、5、10天取样检测药物的含量、有关物质和溶出度。[0106]2)制剂的质量研究[0107]①含量测定[0108]建立hplc法测定药物含量的方法。[0109]5.2电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的初步稳定性研究[0110](1)影响因素试验[0111]①高温试验[0112]取自制拉莫三嗪纳米复合制剂片剂，裸露置于开口洁净容器中，于60℃放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0113]②高湿试验[0114]取自制纳米片剂(即拉莫三嗪纳米复合制剂片剂)，裸露置于开口洁净恒湿容器中，在25℃，湿度rh值为90％±5％条件下放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0115]③强光照射试验[0116]取自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，裸露置于开口光照培养箱内，在照度为(4500±500)lx条件下放置10d，于第5、10d取样，测定含量、溶出度。[0117]④加速试验[0118]取3批自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，按市售包装，置于恒温培养箱内，在温度为(40±2)℃，rh值为(75±5)％条件下放置6个月。于第1、2、3、6月末分别取样，测定含量，溶出度。[0119]⑤留样试验[0120]取3批自制拉莫三嗪纳米复合剂片剂，按市售包装，置于恒温培养箱内，在温度为(25±2)℃，rh值为(60±10)％条件下放置。于第0、3、6月末分别取样，测定含量及溶出度。[0121]6统计分析[0122]使用spss22.0软件进行统计学分析。采用t检验(统计结果以平均值±标准差表示)、x2检验、wilcoxonmann-whitney秩和检验(两独立样本之间比较，统计结果以中位数和范围表示),p值≤0.05被认为差异有统计学意义。[0123]7实验结果[0124]7.1本实施例在体外合成了电场响应性拉莫三嗪纳米复合剂，进而通过体外及大鼠体内实验对其安全性，有效性进行了验证，其采用所制备的载体提高药效的原理见图1。[0125]7.2电响应性拉莫三嗪纳米复合制剂的制备[0126](1)电响应性拉莫三嗪纳米载体[0127]采用实施例1制备电响应性拉莫三嗪纳米载体，其纳米水凝胶的得率、溶胀率、粒径、多分散系数、电位、电导率及黏度测定结果见表4、图2(a,b)，其中图2(a)为纳米孔载体的粒径分布，图2(b)为拉莫三嗪纳米复合剂的载体端电位分布。[0128]表4：纳米水凝胶载体的性质[0129][0130](2)拉莫三嗪纳米复制剂[0131]采用实施例2制备电响应性拉莫三嗪复合制剂，此过程也即是将载体与药物的结合的过程，制作过程中空载体sem图像见图2(c)，制成的拉莫三嗪纳米复合制剂(ltg-nano)的样品见图2(d)。[0132]7.3电响应拉莫三嗪纳米复合制剂药物代谢动力测定及毒理学检测[0133](1)拉莫三嗪纳米复合制剂的理化性质[0134]ltg(拉莫三嗪)和ltg-nano(拉莫三嗪纳米复合制剂)在ph7.4的pbs中的体外药物释放曲线如图3a所示，可见复合制剂(载药纳米水凝胶ltg-nano)的体外药物释放行为几乎一致，其8h的药物累积释放百分率分别为52.7％和54.3％，24h为84.3％和85.8％。进一步评价在电场作用下两种药物(分别为ltg和ltg-nano)的体外释放行为，以明确纳米复合制剂修饰是否对电场有积极的响应，简要步骤为：将负载药物的材料修饰在玻碳电极表面，以pt电极作为对电极，两个电极共同插入ph7.4的pbs缓冲溶液中，两个电极之间的距离是1cm，在两个电极之间施加一定的电位刺激药物的释放，然后再通过紫外光谱测定药物的释放量。结果见图3b。相较于普通ltg药物，拉莫三嗪纳米复合剂在电场条件下具有更好的药物释放作用。[0135](2)大鼠海马神经元离体培养[0136]大鼠原代海马神经元细胞种板后1-2小时开始贴壁，24小时候开始有突起，72h后可见明显轴突与树突。通过map-2免疫细胞化学染色，倒置相差显微镜下可见棕黄色颗粒沉积，pbs代替一抗的对照组中并无此现象，鉴定神经元纯度在90％以(图4(a,b))上。[0137]神经元体外培养至10天，无镁细胞外液处理后的神经元细胞较正常细胞外液处理后的神经元细胞，突触间融合更加明显，异常网络结构初步形成(图4(c,d))。[0138](3)拉莫三嗪纳米复合制剂细胞毒性检测[0139]采用cck8法测定拉莫三嗪纳米复合剂对bend.3细胞的增值抑制能力，并计算其半数细胞抑制浓度(ic50值)，结果如图5a中所示。ltg纳米复合剂和ltg原药对bend.3细胞的增殖抑制作用均呈现浓度依赖性，两者的ic50值分别为639.0ug/ml和614.9ug/ml，没有显著性差异，表现为相对低的细胞毒性。pi染色(图5c,d)和流式细胞术(图5b)的相关结果也表明，无论是ltg纳米复合剂和ltg原药的细胞毒性均较低，具有良好的生物安全性。[0140](4)拉莫三嗪纳米复合制剂活体毒性[0141]有文献表明(lamotrigine-inducedlupus)，ltg的过量使用会影响患者关节的生理学结构。生理浓度的ltg-nano是否会对机体组织产生毒理影响尚不明确。本实验采用大鼠颞下颌关节组织进行he染色观察，相较于ctrl组(图6(a,c))，ltg-nano组(图6(b,d))未见明显异常现象。[0142](5)急性毒性试验[0143]选取昆明小鼠单次灌胃给予拉莫三嗪纳米复合制剂，评价可能出现的急性毒性反应。供试品临床拟给药途径为口服，因此选择灌胃给药，确定最大剂量组的给药剂量为1250mg/kg，最小剂量组的给药剂量为312mg/kg，按照组距0.76等比稀释，分为6个剂量组，分别为312mg/kg、412mg/kg、549mg/kg、722mg/kg、950mg/kg、1250mg/kg，灌胃给药1次，观察可能产生的毒性反应。观察给药当天药后笼旁观察，包括动物死亡、发病、呼吸、分泌物、粪便以及饮食饮水情况。体重、食量、大体和组织病理学检查。结果显示体重可见一定的剂量反应关系。脏器重量与同期同性别1组动物相比，各组动物d15的脏器重量、脏器系数未见统计学意义的改变。大体解剖观察中d15对所有存活小鼠进行系统的大体解剖检查，未见大体病理学改变。950mg/kg组和722mg/kg组动雄性物d1-d7出现体重增长和食量的降低，脏器重量和脏器系数未见异常。[0144](6)急性毒性试验[0145]长期毒性试验采用昆明小鼠重复灌胃给予拉莫三嗪纳米复合制剂24周及恢复期4周，评价可能出现的毒性反应。根据单次给药毒性试验获得的最大非致死量(312mg/kg)，确定重复给药毒性试验剂量为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg。灌胃注射，观察连续给药24周及恢复期4周小鼠可能产生的毒性反应。所获结果显示，剂量分别为40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg，重复灌胃给予昆明小鼠拉莫三嗪纳米复合制剂24周及停药后恢复4周，小鼠体重增长、食量、脏器重量、脏器系数、血细胞计数、血液生化检测以及主要脏器的组织学检查未见异常。进行重要脏器24周及停药后恢复4周病理检查，在200倍数下详细观察组织切片情况，对切片中基本病理改变如充血、淤血、出血、水肿、变性、坏死、增生、纤维化、机化、肉芽组织、炎性变化等情况文字描述，并反映出片子之间的差异。结果显示：心肌纤维、肝脏、脾脏、肺组织、肾脏组织、脑皮层、卵巢组织、子宫、肾上腺、胸腺、甲状腺和睾丸未见异常。[0146](7)生殖毒性试验[0147]评价连续灌胃给予孕鼠拉莫三嗪纳米复合制剂，可能对胎鼠发育产生的影响。自孕6天起，每天按照体重灌胃给予对应供试品，直至孕18天，设定剂量为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg，根据体表面积折算为人的剂量为210mg/人、420mg/人、840mg/人，自孕6天开始给药至孕18天，相当于孕中期开始给药至孕晚期。分析死亡和濒死、体重、胎鼠和吸收胎数量、胎盘、胎鼠重量、胎鼠发育情况分析、胎盘病理学检查，结果显示昆明小鼠孕6天至孕18天连续灌胃给药13天，剂量分别为30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg。未见孕鼠状态、胎盘结构和胎鼠发育的异常。[0148]7.4药物代谢动力学[0149]腹腔注射单纯ltg后药物被迅速吸收入血，血药浓度迅速升高，ltg的治疗窗狭窄，ltg血药浓度高于有效血药浓度(10-20ug/ml)，可能会发生中毒现象。ltg个体药代动力学参数差异大，治疗癫痫患者往往是进行血药浓度的监测，实行个体化给药。本实验测得ltg溶液及ltg纳米复合剂(拉莫三嗪纳米复合制剂)的相关数据见表5。[0150]表5：两种药物的药代动力学[0151][0152]两种药物给药后，大鼠体内的药动学过程均符合二室模型。如表5所示，ltg-nano溶液在大鼠体内的药代动力学过程与ltg溶液相比发生了较大的变化，其体内消除半衰期(t1/2)延长了近3倍，平均滞留时间(mrt)延长了2倍，具有显著性差异(p《0.01)，药物吸收常数ka显著提高，cmax提高，以上结果均表明拉莫三嗪纳米制剂在体内吸收快，消除较慢，达到了缓释的效果，明显地延长了ltg在体内循环的时间(p《0.05)。[0153]同样采用das2.0药动学软件对ltg溶液和ltg纳米复合剂在大鼠体内的组织中的药物浓度数据进行处理，得到的药代动力学主要参数见表6。可见与ltg溶液相比，ltg-nano溶液在肝、脾、肾组织的auc分别增加了1.44、3.05、2.50和1.60、2.74、2.25倍，在脑组织的auc分别增加了1.40和3.36倍。[0154]表6：大鼠体内各组织药物浓度的药代动力学[0155][0156]7.5拉莫三嗪纳米复合制剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能比较[0157](1)体外细胞拉莫三嗪纳米复合制剂摄取实验[0158]本实验采用mcherry标记的纳米载体进行细胞摄取实验，以方便荧光显微镜定性观察定量测定bend.3小鼠脑微血管内皮细胞与空纳米载体(图7a)和ltg-nano(图7b)孵育后2h,相关细胞摄取结果见图7，图7中的mcherry为荧光探针，dio荧光染料为靶标细胞膜结构，dapidio荧光染料为靶标细胞核，merge融合图像可见mcherry为荧光探针纳米载体透过脑微血管内皮细胞网络结构。[0159](2)体外细胞抗癫痫效能评估[0160]全细胞膜片钳实验结果表明：拉莫三嗪纳米复合剂与拉莫三嗪对癫痫细胞的放电反应均有一定的抑制作用，相较于原药，其抗癫痫放电作用的几乎相当(抗癫痫效能差值在20％以内)，结果见图8。[0161](3)癫痫大鼠体内实验抗癫痫效能评价[0162]本实验采用两种大鼠癫痫模型，以在体内验证拉莫三嗪纳米复合剂与拉莫三嗪原药抗癫痫效能的比较。其分别为大鼠最大电休克癫痫模型和鼠ptz诱导的癫痫模型。[0163]最大电休克(maximalelectroshockseizure，mes)模型是使用最多的癫痫模型，模型制作简便，惊厥率高，广泛应用于抗癫痫药物的高通量筛选[6]。若给予aeds后，动物不再出现后肢强直，即提示该药有抗mes效应，在实验中常以给药后惊厥中强直消失为该药物控制有效的指标[7]。在本实验的大鼠最大电休克模型中，ltg溶液，和ltg-nano溶液均能呈现剂量依赖性地缓解强直发作，表现为降低发作等级和缩短强直发作的持续时间(图9(a,b))。在剂量为20mg/g时，ltg-nano溶液相比ltg溶液有更好的抗癫痫作用，表现为发作更低的发作等级和更短的强直时间(1.9±1.3)svs(6.8±1.5)s提示ltg-nano可以降低治疗的有效治疗浓度(图9(a,b)。[0164]进一步采用化学试剂ptz诱导并筛选出难治性大鼠癫痫模型来评价ltg制剂的抗癫痫药效。ptz是一种具有致痉作用的四唑衍生物，通过作用于γ-氨基丁酸a型受体(gabaa受体)，阻断gaba介导的抑制作用而诱发癫痫。戊四氮诱导的癫痫发作与人类癫痫发作的行为学改变及神经病理改变高度相似，广泛用于颞叶癫痫发病机理及筛选抗癫痫药物的研究中。在本实验ptz诱发的急性癫痫模型中，剂量为50mg/kg时，两种ltg制剂(ltg溶液和ltg-nano溶液)均能有效降低发作等级并延长大发作的潜伏期。而在10mg/kg或20mg/kg时，ltg-nano溶液明显具有更好的抗癫痫效果，大大的延长发作的潜伏期(图9(c,d))。[0165]7.6电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂的初步稳定性研究[0166]实施例3中通过直接压片法获得电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂，[0167]在强光实验中，将制成的药片直接暴露于空气中，测得其含水量有轻微的变化。采用高效液相色谱法测定了强光照射后三种药物前后的含量变化。结果表明，经强光照射10天后药片中的主药含量等指标并未发生改变，其也未出现降解产物(表7)，符合中国药典的要求。[0168]表7：强光照射实验结果[0169][0170][0171]在高温实验考察中，将药片直接暴露于烘箱热空气中，所有样品的液相色谱均没有杂质出现，主药成分含量指标没有改变，并且未发现新的降解产物。上述结果表明，ltg-nano与其辅料没有发生相互作用，各项数据见表8。[0172]表8：高温(60℃)实验考察结果[0173][0174]在高湿实验考察中，将药片直接暴露于90％的湿空气中，高效液相色谱法测定主药含量，由图谱可见，供试品和样品的谱图均没有出现新的杂质峰。进行相关物质分析，结果表明主药成分含量指标没有改变，并且未发现新的降解产物。上述结果表明，ltg-nano与其辅料没有发生相互作用，在高湿环境下复合标准，各项数据见表9。[0175]表9:高湿(90％)实验考察结果[0176][0177]取电场响应性拉莫三嗪复合片剂10片，分成两组，每组5片，分别称定每组的质量，然后放入脆碎度测定装置的塑料盒中，开动机器，旋转震荡3分钟后取出，再次测定每组的质量并求出其损失率，其测定结果见表10。[0178]表10:脆碎度测定结果[0179][0180]从上表测定的结果可以看出，测定前后的片剂质量损失率均低于中国药典的标准，该片剂的脆碎度符合要求。[0181]将压制好的电场响应性拉莫三嗪复合片剂按照中国药典中记载的方法和标准制作成6个样品，在紫外分光光度计下测定其吸光度。溶出度实验结果见表11。[0182]表11：溶出度测定结果[0183][0184]从上述结果可得出，所有样品在45分钟的溶出度均大于80％，符合中国药典关于溶出度的有关规定。[0185]结果表明，本发明通过电场响应性纳米载体可以以电场响应的方式协助拉莫三嗪药物穿透血脑屏障，有效的减少p-gp过表达导致的难治性耐药型癫痫病，其可以有效弥补现阶段实验室中通过抑制血脑屏障中p-gp表达来抑制耐药型癫痫的耐药性操作复杂且效果不佳的问题。[0186]本发明所制备电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂在体内及体外实验中表现出其具有低毒性，高血脑屏障穿透效率，无机体其他副作用的优势。采用常规手段制作的电场响应性拉莫三嗪纳米复合制剂片剂复合中国药典的各项规定，具有良好的稳定性和溶出率，有望成为治疗耐药型癫痫的新的临床一线药物。[0187]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。当前第1页12当前第1页12
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