检测痰液外泌体内胃蛋白酶的试剂在制备诊断胃食管反流性咳嗽产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及检测痰液外泌体内胃蛋白酶的试剂在制备诊断胃食管反流性咳嗽产品中的应用。


背景技术：

2.慢性咳嗽是指临床上以咳嗽为惟一症状或主要症状，病程超过8周，胸部x线检查无明显异常者，在不吸烟的成年人中发病率达10-40％，严重影响患者的日常工作和生活质量。胃食管反流性咳嗽(gastroesophageal reflux-induced chronic cough，gerc)占慢性咳嗽的病因10％～40％，为常见病因之一。随着对gerc认识的不断深入、检查方法的进展和人们生活方式改变，我国gerc的发病率有增多的趋势。
3.gerc的有效治疗需要在明确诊断的基础上进行。按照我国新修订的《咳嗽的诊断与治疗指南(2015)》gerc的诊断标准为：1)慢性咳嗽，以白天咳嗽为主；2)24h食管ph监测或多通道食管内阻抗-ph监测(multi-channel intraluminal impedance combined with ph monitoring，mii-ph)显示demeester积分≥12.70，和(或)sap≥80％，症状指数≥45％；3)抗反流治疗后咳嗽明显减轻或消失。其中24h食管ph监测是诊断gerc的主要客观检查依据，可以确切反映食管内异常酸反流(反流物的ph值＜4.0)的情况。对于非酸gerc反流(反流物ph值＞4)则需要联合mii-ph。然而，首先该设备仅少数医院配备，且目前国际上此诊断标准也不统一；再次部分患者不愿接受有创检查或无法配合完成该项检查；此外，检查结果也存在假阳性和假阴性的可能，给诊断造成一定的困扰。因而临床上亟待找到一项简便易行、准确可靠的方法确诊gerc。
4.胃蛋白酶原(pepsinogen，pg)是胃蛋白酶的无活性前体，主要是由泌酸腺的胃壁主细胞合成和分泌。pg大部分进入胃腔转化为有活性的胃蛋白酶，仅有1％通过胃黏膜毛细血管进入血液循环并经肾脏排出。在酸性环境或自我激活作用下，pg分离出1个含有44位氨基酸的多肽后形成有活性的胃蛋白酶，胃蛋白酶只有在酸性环境中才能发挥作用。有研究提示，采用elisa法检测80例疑似gerd患者的唾液胃蛋白酶，样本采集时间分别为睡前、症状发作时及晨起时，结果发现53.8％的患者胃蛋白酶阳性，健康对照组均为阴性；以24h食管ph监测为“金标准”，唾液胃蛋白酶诊断gerd的敏感性和阴性预测值较为理想(89％和95％)，特异性和阳性预测值欠佳(68％和44％)；同时发现症状发作时胃蛋白酶阳性率最高。以rsi量表、rfs量表和ppis试验性治疗联合诊断结果为诊断标准，发现咽喉反流患者的痰液胃蛋白酶浓度高于慢性咽喉炎组和健康对照组，胃蛋白酶诊断的敏感性、特异性、漏诊率及误诊率分别为93.8％、46.2％、6.2％、53.8％。
5.总之，胃内容物中的胃蛋白酶在反流性疾病的发生发展中起重要作用，胃蛋白酶检测技术虽然具有简单、创伤小等优点，但用于诊断胃食管反流病的敏感性和阴性预测值较为理想，但特异性和阳性预测值欠佳，而用于gerc的诊断价值目前无相关研究。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，基于外泌体可在体液中稳定存在且半衰期长，加之脂质双分子层的保护作用，通过超速离心法提取并通过透射电镜法鉴定外泌体，再进一步检测蛋白质具有纯度高和特异度高的优点，本发明提供了检测痰液外泌体内胃蛋白酶的试剂在制备诊断胃食管反流性咳嗽产品中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供检测痰液外泌体内胃蛋白酶的试剂在制备诊断胃食管反流性咳嗽产品中的应用。
9.进一步地，上述产品为检测试剂或检测试剂盒。
10.进一步地，上述产品包括分离纯化痰液中外泌体的试剂。
11.进一步地，上述产品包括检测痰液外泌体内胃蛋白酶表达量的试剂。
12.进一步地，上述产品通过如下方法中的一种检测痰液外泌体内胃蛋白酶的表达量：免疫组织化学测定法、酶联免疫吸附测定法(elisa)、蛋白质印迹测定法、胶体金法、原位杂交、色谱法、液相色谱法、尺寸排阻色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、串联质谱法、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、电喷雾电离质谱法、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法、四极飞行时间质谱法、大气压光电离质谱法、傅里叶变换质谱法、基质辅助激光解吸/电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法、二次离子质谱法、放射性免疫测定法、显微镜检查、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序。
13.本发明的第二方面是提供一种诊断胃食管反流性咳嗽的检测试剂盒，该试剂盒包括：
14.(i)用于对痰液样品进行分离纯化获得外泌体样本的试剂；
15.(ii)鉴定外泌体的试剂；和
16.(iii)用于对外泌体样本中胃蛋白酶表达量进行检测的试剂。
17.进一步地，上述组分(i)通过超速离心法获得外泌体样本。
18.进一步地，上述组分(ii)通过透射电镜法鉴定外泌体。
19.进一步地，上述组分(iii)通过酶联免疫吸附测定法检测外泌体内胃蛋白酶的表达量。
20.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
21.本发明利用外泌体的优点提取痰液中的外泌体后并检测外泌体内胃蛋白酶的表达量，进而用于诊断gerc，操作简单，创伤小，且具有较为理想的特异性和敏感性，对gerc具有较好的筛查和诊断价值，可用于代替有创检查。
附图说明
22.图1显示了本发明一实施例中常规手段检测痰液胃蛋白酶(图a)、检测痰液外泌体内胃蛋白酶(图b)和mii-ph监测(图c)对gerc的诊断价值；
23.图2显示了本发明一实施例中常规手段检测痰液胃蛋白酶、检测痰液外泌体内胃蛋白酶和mii-ph监测诊断gerc的roc比较结果。
具体实施方式
24.本发明人经过广泛而深入的研究，通过对单病因慢性咳嗽患者、正常人进行痰液提取鉴定外泌体后测定胃蛋白酶，首次意外发现痰液外泌体内检测胃蛋白酶对gerc具有较好的诊断价值。在此基础上，本发明提供了检测痰液外泌体内胃蛋白酶的试剂在制备诊断gerc产品中的应用以及用于诊断gerc的试剂盒。
25.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
26.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
27.实施例1
28.本实施例验证痰液外泌体内检测胃蛋白酶对gerc的诊断价值，具体的实验方法和结果如下：
29.1、对象
30.对象：2018年3月至2020年2月在同济大学附属同济医院呼吸内科门诊因慢性咳嗽就诊的患者309例(gerc组有126例受试者，其他病因的慢性咳嗽患者183例)，另外纳入80例健康受试者。
31.入选标准：
①
18岁≤年龄≤80岁；
②
咳嗽病程＞8周；
③
无喘息、咯血、发热等症状，体检肺部无啰音，包括抗生素在内的一般治疗无效；
④
胸部x线片无异常发现；
⑤
肺功能检查：第1秒用力呼气容积/用力肺活量(fev1/fvc)≥70％，fev1＞预计值的80％；
⑥
能理解上述评分表内容并正确完成者。
32.排除标准：
①
妊娠、哺乳期妇女；
②
吸烟或戒烟＜2年；
③
阅读书写能力障碍者；
④
就诊前已接受针对咳嗽病因治疗且症状改善者。
33.所有慢性咳嗽患者均参照中华医学会呼吸病学分会哮喘学组颁布的《咳嗽的诊断与治疗指南(2015)》推荐的慢性咳嗽病因诊断流程，视情接受肺功能、支气管激发试验、诱导痰细胞分析和mii-ph监测检查，结合针对性治疗效果建立病因诊断。纳入的患者的病因分布如下表1：
34.表1.慢性咳嗽患者病因分布
35.[0036][0037]
探究对象的基本信息如下表2，三组患者在年龄、性别、肺功能检查结果方面并没有显著差异。gerc组患者和非gerc组患者的咳嗽症状和咳嗽病程也没有显著差异。在辣椒素咳嗽敏感性测试(以吸入辣椒素溶液诱发≥2次或≥5次咳嗽的最低辣椒素浓度为咳嗽阈值c2和c5，并作为咳嗽敏感性指标)中，gerc组患者和非gerc组患者的咳嗽敏感性均要高于健康对照组，但其两者之间未见差异。
[0038]
表2研究对象的基本信息
[0039][0040]
2、观察指标
[0041]
(1)痰液外泌体内胃蛋白酶检测：
[0042]
1)外泌体提取-超速离心法：将诱导痰5ml在4℃条件下300g离心10min去除细胞，取上清；在2000g离心10min去除死亡细胞或凋亡小体，取上清；在10,000g离心30min去除细胞碎片，取上清；在100,000g离心70min，取沉淀，加pbs重悬；再次在100,000g离心70min去除残余蛋白，取沉淀，沉淀以100μl pbs重悬，分装，于-80℃保存。
[0043]
2)外泌体鉴定-透射电镜法：取分离纯化外泌体10μl，加入等体积pbs稀释后滴加于2mm的载样铜网上，室温静置1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3％磷钨酸钠溶液(ph＝6.8)室温下负染5min，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干，于透射电子显微镜观察并照相，随机选取20个外泌体测量其直径
[0044]
3)胃蛋白酶检测-elisa法：根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1∶1稀释后加入50μl于反应孔内。加入稀释好后的标准品50μl于反应孔、加入待测样品50μl于反应孔内。立即加入50μl的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入80μl的亲和链酶素-hrp，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物a、b各50μl，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50μl终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的od值。
[0045]
(2)常规痰液胃蛋白酶检测：获取诱导痰5ml，之后同上述第三步elisa法进行。
[0046]
(3)多通道食管内阻抗-ph监测(mii-ph监测)：
[0047]
患者空腹10h以上，经食管测压定位食管下括约肌位置后，将6通道阻抗电极导管(k6011-ei-0632，荷兰mms公司)和预先用ph分别为4.00和7.01缓冲液校正的ph电极导管(819100，荷兰mms公司)经鼻置入食管内。阻抗电极中心位置分别位于食管下括约肌上方3、5、7、9、15、17cm处，ph电极位于食管下括约肌上方5cm处，参考电极固定于胸骨中下段并连接至mii-ph监测仪(ohmega，荷兰mms公司)开始记录数据。监测期间患者保持平常作息时间和饮食习惯，用日记卡详细记录进食、平卧和症状起止时间，避免酸性食物和酒精等。监测24h后将数据传至计算机，用专业分析软件(mms database，v8.7，荷兰mms公司)进行数据分析。液体反流根据ph值分为酸反流(ph＜4.0)、弱酸反流(ph 4.0-7.0)和弱碱反流(ph＞7.0)。在此基础上自动计算反流数量、近端反流(反流物达食道下括约肌以上15cm)数量、食团暴露(总反流时间占总监测时间的百分比)、食团清除时间(食团从出现到清除的时间)和酸清除时间(酸反流后食管内ph值恢复到≥4.0所需时间)等监测指标。
[0048]
3、结果
[0049]
(1)如下表3所示，无论是在常规胃蛋白酶检测还是痰液外泌体内胃蛋白酶检测中，gerc组患者的胃蛋白酶均高于非gerc组以及正常对照组，提示胃蛋白酶可以作为诊断gerc的生物标记物。
[0050]
表3常规胃蛋白酶检测和痰液外泌体内胃蛋白酶检测参数
[0051][0052]
(2)接下来探究上述观察指标对于gerc的诊断价值。使用常规手段检测痰液胃蛋
白酶在诊断gerc中的auc为0.769，cutoff值为27.8；痰液外泌体内胃蛋白酶诊断gerc的auc为0.922，cutoff值为16.9；而mii-ph诊断gerc的auc为0.979(如图1)。
[0053]
接着对于三组roc曲线进行了delong test检验，如图2显示，三种检测手段的auc在诊断gerc中存在差异。其中mii-ph的诊断价值最佳，优于其他两种诊断手段；而痰液外泌体内胃蛋白酶相较于常规检测痰液胃蛋白酶在诊断gerc中有更好的价值。
[0054]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。