一种自组装纳米药物、其制备方法及应用

1.本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，具体涉及一种自组装纳米药物、其制备方法及应用。


背景技术：

2.1923年，otto warburg首次观察到癌细胞的表型特征，显示出即使在氧气充足的情况下，也会出现高葡萄糖摄取和过量乳酸的形成，这后来被称为warburg效应。癌细胞产生的乳酸进一步分泌到细胞外空间积累，而肿瘤微环境中积累的乳酸可以通过多种途径抑制机体免疫响应，严重影响肿瘤免疫治疗效果。因此，靶向乳酸代谢可能成文一种新兴、有效的辅助癌症治疗策略。
3.α-氰-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，chca)是一种单羧酸转运体1(mct1)抑制剂，可以有效破坏肿瘤细胞的乳酸传递链，诱导肿瘤细胞内乳酸积累，下调肿瘤细胞外乳酸含量，实现乳酸代谢调控增强的免疫治疗。然而，chca的水溶性和生物相容性较差，极大地限制了其进一步应用。
4.目前，现有技术通常采用介孔材料或纳米材料对其进行包覆并递送至肿瘤细胞内，在一定程度上提高了其生物利用度，但这种方式得到的材料对chca的负载率较低，一般在10％以下且不能有效地包封药物。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自组装纳米药物、其制备方法及应用。所述自组装纳米药物能够极大地提高对chca的负载率(不低于85％)，具有良好的肿瘤选择性。
6.第一方面，本发明提供一种自组装纳米药物，由三价铁和α-氰-4-羟基肉桂酸反应形成。
7.优选地，所述自组装纳米药物中α-氰-4-羟基肉桂酸的包封率不低于85％。
8.优选地，所述自组装纳米药物的粒径为40～60nm。
9.第二方面，本发明提供一种上述自组装纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
10.将三价铁的化合物溶液与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液混合后反应，得到自组装纳米药物。
11.优选地，所述α-氰-4-羟基肉桂酸溶液由α-氰-4-羟基肉桂酸与有机溶剂混合后得到。
12.优选地，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、n，n-二甲基甲酰胺或无水甲醇中的任意一种或多种。
13.优选地，所述三价铁的化合物包括氯化铁、硝酸铁或硫酸铁中的任意一种或多种。
14.优选地，所述三价铁的化合物与α-氰-4-羟基肉桂酸的质量比为1:(0.8～1.25)。
15.优选地，所述三价铁的化合物溶液中三价铁的化合物的质量浓度为0.2～0.8mg/ml。
16.优选地，所述α-氰-4-羟基肉桂酸溶液中α-氰-4-羟基肉桂酸的质量浓度为3～8mg/ml。
17.第三方面，本发明提供一种肿瘤治疗药物，包括所述的自组装纳米药物或根据所述的制备方法制备得到的自组装纳米药物。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
19.(1)本发明提供的自组装纳米药物具有优异的稳定性和药物包封率，对α-氰-4-羟基肉桂酸的包封率不低于85％，且具有良好的肿瘤细胞选择性，可用于制备肿瘤治疗药物，能够提高对肿瘤的治疗效果；
20.(2)本发明提供的自组装纳米药物的制备方法简单，在水溶液且室温条件下进行，条件温和，环境友好，可重复性强，可实现批量制备，且原料成本低廉，具有很大的应用前景。
附图说明
21.图1为实施例1得到的自组装纳米药物的sem图像；
22.图2为实施例8得到的自组装纳米药物的sem图像；
23.图3为实施例9得到的自组装纳米药物的sem图像；
24.图4为实施例9得到的自组装纳米药物的tem图像；
25.图5为实施例9得到的自组装纳米药物对小鼠结肠癌细胞(ct26)的抑制结果图；
26.其中iactate-rmpi表示添加有乳酸的1640培养基，rmpi表示纯的1640培养基
27.图6为实施例9得到的自组装纳米药物fe(iii)-chca对小鼠正常细胞(l929)的抑制结果图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明所涉及的所有原料，对其来源没有特别的限制，从市场上购买或者按照本领域技术人员熟知的常规方法制备得到的即可。
30.本发明提供一种自组装纳米药物，由三价铁和α-氰-4-羟基肉桂酸反应形成。
31.在本发明中，所述自组装纳米药物优选由三价铁和α-氰-4-羟基肉桂酸表面的羟基或羧基等活性基团发生配位反应而形成。所述α-氰-4-羟基肉桂酸是一种单羧酸转运体1(mct1)抑制剂，可以有效破坏肿瘤细胞的乳酸传递链，诱导肿瘤细胞内乳酸积累，下调肿瘤细胞外乳酸含量，从而实现乳酸代谢调控增强的免疫治疗。本发明对α-氰-4-羟基肉桂酸的来源没有特别的限制，为一般市售品即可。本发明中，所述自组装纳米药物中α-氰-4-羟基肉桂酸的包封率优选不低于85％，甚至不低于86％。所述自组装纳米药物的粒径优选为40～60nm，更优选为45～55nm。
32.第二方面，本发明提供一种上述自组装纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
33.将三价铁的化合物溶液与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液混合后反应，得到自组装纳米
药物。
34.在本发明中，优选将三价铁的化合物溶液与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液混合后反应，得到自组装纳米药物。在本发明中，所述三价铁的化合物溶液优选由三价铁的化合物和溶剂混合后得到。所述三价铁的化合物优选包括氯化铁、硝酸铁或硫酸铁中的任意一种或多种。本发明对三价铁的化合物的来源没有特别的限制，为一般市售品即可。所述溶剂优选为水，更优选为去离子水。所述三价铁的化合物溶液中三价铁的化合物的质量浓度优选为0.2～0.8mg/ml，更优选为0.2～0.6mg/ml。在本发明中，所述α-氰-4-羟基肉桂酸溶液优选由α-氰-4-羟基肉桂酸与有机溶剂混合后得到。所述有机溶剂优选包括二甲基亚砜、n，n-二甲基甲酰胺或无水甲醇中的任意一种或多种。所述α-氰-4-羟基肉桂酸溶液中α-氰-4-羟基肉桂酸的质量浓度优选为3～8mg/ml，更优选为3～6mg/ml。
35.本发明中，对于三价铁的化合物溶液与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液的加入顺序没有特别的限制，优选将α-氰-4-羟基肉桂酸溶液加入至三价铁的化合物溶液中进行反应，更优选在搅拌条件下将α-氰-4-羟基肉桂酸溶液加入至三价铁的化合物溶液中进行反应。所述反应优选在搅拌条件下进行。所述反应的温度优选为室温，所述反应的时间优选为1min～24h，更优选为1min～12h。在本发明中，所述三价铁的化合物与α-氰-4-羟基肉桂酸的质量比优选为1:(0.8～1.25)，可以是1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.15、1:1.2或1:1.25等，上述数值范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。在本发明中，优选在三价铁的化合物溶液与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液混合反应后，对混合溶液进行离心处理，收集沉淀，得到自组装纳米药物。本发明还优选对沉淀进行洗涤，所述洗涤的试剂优选为水，更优选为去离子水，所述洗涤的次数优选不低于2次。
36.本发明提供的制备方法中，整个反应过程在水溶液且室温条件下进行，条件温和，环境友好，操作步骤简单，反应时间短，通过三价铁离子和chca之间的配位作用，可实现室温条件下超快自组装，且可重复性强，原料成本低廉，可以实现批量制备。
37.第三方面，本发明提供一种肿瘤治疗药物，包括所述的自组装纳米药物或根据所述的制备方法制备得到的自组装纳米药物。
38.在本发明中，所述自组装纳米药物除了chca药物和三价铁离子，不引入其他任何化学物质，对chca药物的包封率不低于85％，得到的纳米药物本身具有良好的肿瘤细胞选择性，能够用于制备肿瘤治疗药物，可以有效提高对肿瘤细胞的治疗效果。
39.为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例中所用的原料，对其来源没有特别的限制，从市场上购买或者按照本领域技术人员熟知的常规制备方法即可。
40.实施例1
41.本实施例提供一种自组装纳米药物，其制备方法如下：
42.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，4mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤2次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
43.采用扫描电子显微镜对fe(iii)-chca自组装纳米药物进行表面形貌的表征，结果如图1所示，可以看出自组装纳米药物为尺寸均一的球形颗粒。
44.实施例2
45.在室温下，将4mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤两次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
46.实施例3
47.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤3次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
48.实施例4
49.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml n，n-二甲基甲酰胺中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤两次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
50.实施例5
51.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml无水甲醇中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤两次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
52.实施例6
53.在室温下，将5mg氯化铁分散于10ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤两次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
54.实施例7
55.在室温下，将5mg氯化铁分散于5ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应10h。离心收集沉淀，去离子水洗涤3次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
56.实施例8
57.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应1min。离心收集沉淀，去离子水洗涤4次，得到fe(iii)-chca自组装纳米药物。
58.采用扫描电子显微镜对fe(iii)-chca自组装纳米药物进行表面形貌的表征，结果如图2所示，可以看出自组装纳米药物为尺寸均一的球形颗粒。
59.实施例9
60.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于
1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应5min。离心收集沉淀，去离子水洗涤3次，即可得到所述的超快自组装纳米药物fe(iii)-chca。
61.分别采用扫描电子显微镜与透射电子显微镜对fe(iii)-chca自组装纳米药物进行表面形貌的表征，结果如图3-4所示，其中，图3为自组装纳米药物的sem图像，图4为自组装纳米药物的tem图像，可以看出自组装纳米药物为尺寸均一的球形颗粒。
62.实施例10
63.在室温下，将5mg氯化铁分散于20ml去离子水中，5mgα-氰-4-羟基肉桂酸分散于1ml二甲基亚砜中。将上述氯化铁的水溶液置于磁力搅拌器上，快速搅拌下，逐滴加入α-氰-4-羟基肉桂酸溶液，并在室温下搅拌反应24h。离心收集沉淀，去离子水洗涤两次，即可得到所述的超快自组装纳米药物fe(iii)-chca。
64.性能测试
65.采用电感耦合等离子光谱发生仪对实施例1-10得到的自组装纳米药物进行fe
3
和chca的含量测试，测试结果如下表1所示：
66.表1
67.组别fe
3
含量(wt％)chca含量(wt％)实施例113.8786.13实施例213.7786.23实施例312.6387.37实施例414.7285.28实施例514.4785.53实施例613.5286.48实施例711.7888.22实施例813.2586.75实施例913.3086.70实施例1012.5787.43
68.由上表数据可知，本技术提供的自组装纳米药物对chca具有优异的包封率，均在85％以上。与现有技术中，选择两性离子甲基丙烯酸磺基甜菜碱(sbma)作为聚合单体，n,n
′‑
双-(丙烯酰)半胱氨酸(bac)作为交联剂，通过自由基聚合得到psbma两性离子纳米颗粒(简称pnps)，然后加载l-cys和chca构建得到的两性离子h2s驱动的纳米马达pca相比，pca纳米马达对l-cys和chca的加载量仅为10％和8％。另外，该纳米药物对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，并且具有剂量依赖性，但在浓度为400μg
·
ml-1
时，细胞活力在24h内可下降到34.3％左右。
69.针对实施例1得到的自组装纳米药物进行体外细胞毒性分析的测试，测试方法如下：
70.采用cck-8法测定细胞毒性：ct26细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，分别在rmpi培养基和含10mm乳酸的rmpi培养基(iactate-rmpi)中培养12h。l929细胞以每孔6000个细胞的密度接种于96孔板，在mem培养基中培养12h。加入不同浓度的fe(iii)-chca(浓度范围为0-400μg
·
ml-1
)共孵育24h，利用cck-8检测法检测细胞增殖。
71.测试结果如图5-6所示，图5为实施例9得到的自组装纳米药物fe(iii)-chca对小鼠结肠癌细胞(ct26)的抑制结果图，其中iactate-rmpi表示添加有乳酸的1640培养基，rmpi表示纯的1640培养基；图6为实施例9得到的自组装纳米药物fe(iii)-chca对小鼠正常细胞(l929)的抑制结果图。由图5可以看出，自组装纳米药物fe(iii)-chca通过对乳酸的抑制能够对ct26细胞实现一定的抑制作用，并且具有剂量依赖性。由图6可以看出，fe(iii)-chca对l929细胞并没有明显的毒性作用。由图5-6的对比，可以看出自组装纳米药物fe(iii)-chca具有良好的肿瘤细胞选择性。
72.所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。