一种比率荧光探针的制备及其在亚硝酸盐检测中的应用

1.本发明涉及一种比率荧光探针的制备及其在亚硝酸盐检测中的应用，属于快速检测、装备传感平台、高灵敏度检测等领域。


背景技术：

2.在农业中，亚硝酸盐由于其氮含量丰富且与nh
4
和no
3-具有协同作用，因此常被用作植物促生长肥料。同时，亚硝酸盐在食品加工中被广泛用作添加剂或防腐剂，因为它可以抑制细菌的生长并有助于保持肉脯的色泽和风味。然而，值得注意的是，亚硝酸盐会干扰人体的氧气运输系统，因为它会不可逆地将血液中的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，严重损害血红蛋白交换氧气的能力。这种危害对孕妇和婴儿尤为严重。亚硝酸盐还可以与胃中的仲胺和酰胺反应形成致癌的n-亚硝胺。世界卫生组织将饮用水中亚硝酸盐的致死量设定为1.0mg/l。因此，有必要快速检测生物和环境系统中的亚硝酸盐含量。
3.近年来，关于亚硝酸盐检测方法的报道越来越多，包括电化学法、比色法、紫外可见吸收法、化学发光法(cl)、毛细管电泳法、分光光度法和色谱法。然而，这些报道的方法需要繁琐的检测程序，昂贵的仪器，或者视觉半定量能力差，或者耗时。与上述方法相比，荧光传感器检测亚硝酸盐具有简便、灵敏度高、选择性好、响应快等优点，得到了广泛的应用。
4.随着纳米技术的飞速发展，荧光纳米材料(包括量子点和金属纳米材料)由于具有高发光性、高光化学稳定性、大斯托克斯位移、谱线宽等特点，尤其是在传感和探测领域的应用，引起了人们的极大兴趣。然而，大多数量子点的合成过程需要苛刻复杂的条件，尤其是量子点的毒性限制了其应用。因此，开发一种可靠、简便、无毒、无害的荧光纳米材料制备方法具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供一种比率荧光探针的制备及其在亚硝酸盐检测中的应用。本发明以蓝色发光的碳点(bcds)作为内部参考、以金纳米团簇(auncs@ew)作为传感单元来构建比率荧光探针体系。随着no
2-浓度的增加，本发明比率荧光探针提供从红色到蓝色的连续荧光颜色变化。本发明比率荧光探针具有9.38nm的超常检测极限(lod)，并在1s内完成响应，具有良好的灵敏度、选择性以及快速的响应速度。此外，比率荧光探针与水凝胶相结合，还能提供一种新型的水凝胶手套，这种智能制造装备可以用于no
2-的视觉和定量检测。该手套装备具有良好的灵敏度和选择性以及快速的响应速度，这意味着该制造装备在现场和定量no
2-分析方面具有巨大的应用潜力，为快速直观检测no
2-提供了有效途径。
6.本发明比率荧光探针的制备方法，是以蓝色发光的碳点(bcds)作为内部参考、以金纳米团簇(auncs@ew)作为传感单元来构建比率荧光探针体系，包括如下步骤：
7.步骤1：bcds的制备
8.将20～30ml无果肉柠檬汁与10～20ml水混合形成透明溶液，然后转移到50～75ml内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，并在180～200℃下加热12～24h；反应结束后自然冷却
至室温，将cds溶液用去离子水透析(500纳米尺寸的透析袋)24～48h以去除小分子，碳量子点溶液冷冻干燥后得到蓝色碳点粉末bcds。储存在4℃的冰箱中，以备日后使用。
9.步骤2：auncs@ew的合成
10.将10.0～20ml浓度为5～10mmol/l的haucl4溶液和10.0～20ml浓度为50～70mg/ml的鸡蛋清溶液在室温下剧烈搅拌混合5～10min，然后将溶液ph值调至8-10，在37～40℃下反应12～24h；将制备获得的auncs@ew置于60～80℃的真空烘箱中干燥12～24h，收集干燥粉末。将其制备成溶液，并将其储存在冰箱中，温度为4～6℃，以备日后使用。
11.步骤3：比率荧光探针的制备
12.将蓝色碳点粉末bcds溶解到auncs@ew溶液中，浓度为摩尔比为1:1，构建比率荧光探针。
13.ph值和温度对探针的荧光强度有一定的影响，当ph》8时，比值探针的荧光随着ph的降低而逐渐升高。荧光强度的比值结果表明，比值探针在ph＝3-6条件下对no
2-有更好的灵敏度。温度的变化对合成的比例荧光探针的荧光强度影响不大。加入no
2-后，在50℃以下，比值荧光探针的荧光恢复幅度相似。所以综合考虑，本发明中探针的合成选择室温作为最佳的温度。
14.本发明比率荧光探针的应用，是在no
2-的检测过程中作为检测试剂使用，实现no
2-的可视化定性或定量检测。
15.具体的，在365nm的单波长激发下，通过蓝色值和红色值的比率与亚硝酸盐的浓度来构建标准曲线，并用于待测试样的定量检测。
16.进一步的，通过本发明比率荧光探针构建水凝胶手套装备传感平台来实现no
2-的检测。具体是将2.5～3.5g的泊洛沙姆407溶于提前准备好的7.5～11.5ml的融入一定比例au ncs@ew和bcds的蒸馏水中，将溶液放入4℃冰箱中，反应6～8h后拿出，均匀的涂抹/旋涂在无荧光的实验手套表面，在40～60℃烘箱中放置5～10min，即可得到水凝胶手套装备传感平台。
17.本发明比率荧光探针混合了红色发射的aunc和蓝色发射的cd，用于no
2-的视觉检测，可以快速检测水和猪肉中的no
2-，在不进行复杂前处理的情况下进行灵敏、准确的检测。
18.水凝胶手套在365nm的单波长激发下在461和647nm处具有两个发射峰。auncs的红色荧光可以被no
2-淬灭，而作为背景参考的cds的蓝色荧光对no
2-不敏感。随着no
2-的加入，荧光强度比的变化产生了明显的荧光颜色由红变蓝，在紫外灯下用肉眼很容易区分，不需要复杂的仪器。该手套的检测限低至9.38nm，远低于who对饮用水中no
2-残留(》1mg/l)的最高水平。此外，由比例探针构成的水凝胶手套传感装备可应用于真实水和猪肉样品中no
2-的视觉荧光识别。
19.本发明比率荧光探针可用于检测水和猪肉中的no
2-。通过水凝胶手套装备传感平台结合智能手机颜色识别器在实际样品中对no
2-的视觉和定量检测，该过程与传统的仪器方法相比，本发明的传感平台操作简单，省时，无需大量的样品预处理。从荧光照片可以看出，随着no
2-浓度的增加，传感装备在实际样品中也显示出明显的颜色变化。与传统的仪器分析方法相比，该传感装备具有现场目视和定量测定no
2-的潜力。
附图说明
20.为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的阐述说明。
21.图1一种基于多重色度响应的水凝胶传感装备用于亚硝酸盐残留的快速目视定量测定。
22.图2bcds和auncs@ew探针的合成和no
2-比率荧光检测机制的说明。
23.图3比率探针溶液对不同浓度的亚硝酸根响应的荧光光谱图。
24.图4(a)比率探针溶液的选择性，(b)荧光照片，(c)比率探针溶液的选择性和抗干扰性。
25.图5(a)4℃液态水凝胶和荧光色，25℃凝胶状态水凝胶和荧光色，25℃加入过量no
2-后凝胶态水凝胶和荧光色，(b)水凝胶手套的制备和(e)手套展示，(c)水凝胶手套接触不超标的no
2-猪肉和(f)手套展示，(d)水凝胶手套接触no
2-过量猪肉和(g)手套展示；(h)随着no
2-浓度的增加，水凝胶的荧光颜色发生变化。
具体实施方式
26.下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
27.本发明旨在提供一种基于多重色度响应的水凝胶手套传感装备用于亚硝酸盐残留的快速目视定量测定，可以快速检测水和猪肉中的no
2-，可以在不进行复杂前处理的情况下进行灵敏、准确的检测。
28.本发明快速检测no
2-的核心是设计的比率荧光系统和水凝胶手套装备传感平台，用于亚硝酸盐(no
2-)的超快速和灵敏检测，其中蓝色发光的碳点(bcds)用作内部参考，金纳米团簇(auncs@ew)作为传感单元。随着no
2-浓度的增加，传感平台提供从红色到蓝色的连续荧光颜色变化。该探针具有9.38nm的超常检测极限(lod)，并在1秒内完成响应，从而实现对no
2-的视觉剂量敏感和快速检测。此外，比率荧光探针与水凝胶相结合，开发出了一种新型的水凝胶手套，这种智能制造装备可以用于no
2-的视觉和定量检测。该手套装备具有良好的灵敏度和选择性以及快速的响应速度，这意味着该制造装备在现场和定量no
2-分析方面具有巨大的应用潜力，为快速直观检测no
2-提供了有效途径。
29.实施例1：比率荧光探针的制备
30.1、bcds的制备
31.将20～30ml无果肉柠檬汁与10～20ml水混合形成透明溶液，然后将混合物转移到50～75ml内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，并在180～200℃下加热12～24h。反应结束后，将反应器自然冷却至室温，将cds溶液用去离子水透析(500纳米尺寸的透析袋)24～48h以去除小分子。碳量子点溶液冷冻干燥后得到蓝色碳点粉末。收集干燥粉末并将其储存在4℃的冰箱中，以备日后使用；
32.2、auncs@ew的合成
33.将10.0～20mlhaucl4溶液(5～10mmol l-1
)和10.0～20ml鸡蛋清溶液(50～70mgml-1
)在室温下剧烈搅拌混合5～10min。然后，将溶液调至微碱性，在37～40℃下反应进行12～24h。将制备好的auncs@ew置于60～80℃的真空烘箱中12～24h。收集干燥粉末，溶解
在50ml水中，将其制备成溶液，并将其储存在冰箱中，温度为4～6℃，以备日后使用。
34.步骤3：比率荧光探针的制备
35.将蓝色碳点粉末bcds溶解到au ncs@ew溶液中，浓度为摩尔比为0.1mmol/l:0.1mmol/l，构建比率荧光探针。
36.实施例2：比率荧光体系的传感机制、各组分的表征、对no
2-的响应及组分配比优化
37.1、比率荧光体系传感机制
38.auncs@ew和no
2-之间的重氮反应，生成重氮盐。重氮盐为吸电子基团，n电子孤对电子云与苯环上的π电子云不共面，n到π*的跃迁为禁止进程。s1和t1之间系统间交叉跃迁的概率很大，诱导了au ncs@ew的荧光猝灭。加入no
2-后，647nm处的红色荧光变弱，随着no
2-浓度的增加，传感系统产生从红色到蓝色的显著颜色变化，可以实现no
2-的剂量敏感视觉检测。与通常的单一发射波长相比，该模式提高了检测效率和灵敏度。
39.2、比率荧光体系组分表征
40.考虑到探针对分析物的检测灵敏度与其本身的性质有关，使用ft-ir，uv-vis和荧光光谱分别研究了bcds和au ncs@ew探针的结构特征和光谱特性。此外，使用tem来确定bcds和auncs@ew探针的形貌以及其分散性。
41.3、比率荧光体系各组分对no
2-的响应
42.由于荧光探针对分析物的检测与其荧光强度有关，在365nm激发下，对于bcds，no
2-的荧光强度虽不是最高，但是由于眼睛对蓝色很敏感，所以bcds有足够的荧光亮度可以作为内标荧光。通过适当的配比，制备了双发射比荧光探针，该探针在紫外光照射下发出红色荧光。加入no
2-后，荧光探针在紫外光照射下呈现蓝色荧光。此外，荧光光谱法也被用于研究荧光探针的光稳定性。它们在5h内的光稳定性都很好。所设计的比例荧光探针用于no
2-的检测是可行的。
43.4、ph和温度对荧光探针的影响
44.ph值和温度对探针的荧光强度有一定的影响，当ph》8时，比值探针的荧光随着ph的降低而逐渐升高。荧光强度的比值结果表明，比值探针在酸性条件下对no
2-有更好的灵敏度。
45.温度的变化对合成的比例荧光探针的荧光强度影响不大。加入no
2-后，在50℃以下，比值荧光探针的荧光恢复幅度相似。所以综合考虑，本发明中探针的合成选择室温作为最佳的温度。
46.5、比率荧光体系的选择性和抗干扰能力
47.对于出色的荧光传感系统，选择代表性nh
4
，na

，zn
2
，cu
2
，cd
2
，k

，fe
3
，hclo-，so
42-，hco
3-，no
3-，cl-这12种物质，评价了比率荧光传感系统对no
2-的选择性和抗干扰能力。
48.实施例3：基于水凝胶手套装备传感平台比率荧光系统进行传感器的设计
49.为了评价比率荧光探针的适用性，对no
2-进行了检测。通过荧光光谱仪计算蓝色值和红色值的比率来评估其具有良好的线性关系r2＝0.9914，lod＝9.38nm。结果表明，结合智能手机应用，该传感装备首次实现了对no
2-的便携式、可视化和定量监测。
50.为了进一步评估其在实际样品中的适用性，将泊洛沙姆407溶于提前准备好的融入一定比例auncs@ew和bcds的蒸馏水中(auncs@ew和bcds的制备过程参见实施例1)，将溶液放入4℃冰箱中，反应后拿出，均匀的涂抹/旋涂在无荧光的实验手套表面，在烘箱中放置
几分钟，即可得到水凝胶手套装备传感平台。
51.具体是将2.5～3.5g的泊洛沙姆407溶于提前准备好的7.5～11.5ml的融入一定比例au ncs@ew和bcds的蒸馏水中，将溶液放入4℃冰箱中，反应6～8h后拿出，均匀的涂抹/旋涂在无荧光的实验手套表面，在40～60℃烘箱中放置5～10min，即可得到水凝胶手套装备传感平台。
52.我们的传感平台被用于检测水和猪肉中的no
2-。通过水凝胶手套装备传感平台结合智能手机颜色识别器在实际样品中对no
2-的视觉和定量检测，该过程与传统的仪器方法相比，本发明的传感平台操作简单，省时，无需大量的样品预处理。从荧光照片可以看出，随着no
2-浓度的增加，传感装备在实际样品中也显示出明显的颜色变化。与传统的仪器分析方法相比，该传感装备具有现场目视和定量测定no
2-的潜力。