特异性激动Mas受体在预防及治疗对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤中的应用的制作方法

特异性激动mas受体在预防及治疗对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地说，是特异性激动mas受体在预防及治疗对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤中的应用。


背景技术：

2.药物性肝损伤(drug-induced liver injury,dili)是最常见的药物不良反应，亦是严重影响新药开发和上市的重要阻碍。apap是临床上使用最为广泛的止痛药物之一，也是引起急性肝衰竭的首位致病药物。由于可获得与人类病理生理高度类似的小鼠模型，apap是目前研究得最广泛的肝细胞毒性药物。过量apap经由肝脏代谢产生的有害代谢产物是apap引发肝损伤的启动环节，其可进一步通过氧化应激反应诱发线粒体损伤并最终引起肝细胞死亡。近年来，脂质代谢在dili发病机制中的作用受到广泛的关注。
3.由于mas受体激活后可在肝组织内发挥改善脂质代谢紊乱、抗炎、抗氧化应激等多重有益效应，因此特异性激活mas受体可能对apap诱导的肝损伤发挥保护作用。因此我们通过实验：对mas1基因全身性敲除(mas1-/-)和野生型(wildtype,wt)小鼠腹腔注射apap以构建dili体内研究模型，结果表明同等剂量apap，mas1-/-相比wt小鼠，可观察到更为严重的肝细胞损伤及肝内炎症反应；而在对wt小鼠进行apap干预之前特异性激活mas受体，例如小分子mas激动剂ave0991则可显著减轻apap引起的肝损伤，降低小鼠死亡率。同时，在分子机制探讨方面，证实了mas受体激活可诱导脂质自噬和脂肪酸氧化发挥对apap诱导的dili的保护作用。基于目前所掌握的体内研究数据，mas受体可作为药物性肝损伤极具潜力的干预靶点。关于本发明特异性激动mas受体在预防及治疗对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤中的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有药物干预手段的不足，提供一种特异性激动mas受体在预防及治疗对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤中的应用。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
6.本发明提供了mas受体激动剂在制备预防和/或治疗肝损伤的药物中的应用。
7.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂在制备预防和/或治疗药物性肝损伤的药物中的应用。
8.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂在制备预防和/或治疗乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤的药物中的应用。
9.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂ave0991在制备预防和/或治疗乙酰氨基酚诱导的药物性肝损伤的药物中的应用。
10.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂在制备增强脂噬的药物中的应用。
11.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂在制备增强脂肪酸氧化的药物中的应用。
12.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂ave0991在制备增强脂噬的药物中的应用。
13.进一步地，本发明提供了mas受体激动剂ave0991在制备增强脂肪酸氧化的药物中的应用。
14.本发明优点在于：
15.我国药物种类繁多，中草药及保健品普遍滥用，再加之医务人员和公众对药品安全问题的认识仍然不足，近年来我国dili的发病率呈逐年上升趋势，目前虽然有少数药物可应用于治疗dili，但疗效有限，亟需加强基础机制研究及药物创新，有助于进一步推动我国dili防治。本发明聚焦原癌基因mas1编码的g蛋白偶联受体mas，在apap诱导的小鼠急性肝损伤模型体内层面充分证实了激活mas受体可显著减轻肝损伤，而拮抗mas受体可加重肝损伤(首次在apap诱导的小鼠dili模型上，证实mas受体激活的保护效应——显著减轻肝细胞损伤及肝组织内的炎症反应，并在机制上阐明其与脂质自噬激活和脂肪酸β氧化增强有关，为基于特异性激活mas受体的新药研发提供重要的前期数据基础)，有望为后期针对mas受体的新药开发提供重要的动物实验基础。
附图说明
16.附图1a-f是mas1基因全身敲除可显著加重apap诱导的急性肝损伤程度。
17.附图2a-l是特异性激活mas受体可通过增强脂噬及脂肪酸氧化显著减轻apap诱导的急性肝损伤。
具体实施方式
18.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
19.实施例1
20.1实验动物及方法
21.1.1a.转基因小鼠、小鼠疾病模型构建及实验分组：
①
采用的转基因小鼠mas1-/-(全身性mas1基因敲除)及wt小鼠的基因背景均为c57bl/6。
②
疾病模型及实验分组：腹腔注射apap(300mg/kg)构建急性药物性肝损伤小鼠模型。
22.b.实验设计：
①
收集并分离血清样本，elisa检测alt，评估肝损伤程度；
②
制备肝组织石蜡切片，并进行he染色、tunel染色评估肝组织内实质细胞的损伤程度；mpo及f4/80染色评估肝内炎症(中性粒细胞及巨噬细胞)浸润程度；
③
制备肝组织冰冻切片，bodipy及lamp1染色分别标记脂滴及溶酶体评估脂质自噬程度；
④
收集新鲜肝组织标本，透射电镜观察并计算自噬小泡数目，评估自噬活动；western blot检测自噬相关蛋白(lc3b、p62)及凋亡(bax、bcl2、cleaved-caspase3)、炎症相关蛋白(il-1β)表达；转录组、蛋白质组及代谢组测序检测mas1-/-及wt小鼠疾病模型中mrna、蛋白及代谢产物的表达差异；
⑤
mas1-/-及wt小鼠分别给予致死剂量(650mg/kg)的apap，观察并记录生存曲线；
23.1.2a.实验分组：
①
c57bl/6基因背景的wt小鼠；
②
在腹腔注射apap前诱导小鼠急
性肝损伤模型前分别给予小分子mas受体特异性激动剂(ave0991)及溶剂对照。
24.b.实验设计：
①
收集并分离血清样本，elisa检测alt，评估肝损伤程度；
②
分别制备干预组及对照组小鼠的肝组织石蜡切片，并进行he染色、tunel染色评估肝损伤程度；mpo及f4/80染色评估肝内炎症反应；
③
分别制备干预组及对照组小鼠的肝组织冰冻切片，bodipy及lamp1染色评估脂质自噬；
④
分别收集干预组及对照组小鼠的新鲜肝组织，使用透射电镜观察自噬情况并计算自噬小泡数目；western blot检测自噬相关蛋白(lc3b、p62)及凋亡(bax、bcl2、cleaved-caspase3)、炎症相关蛋白(il-1β)表达；转录组测序、蛋白质组测序及代谢组测序检测mas受体特异性激动剂ave0991干预前后基因、蛋白及代谢物的表达差异；
⑤
干预组及对照组分别给予腹腔注射致死剂量(650mg/kg)的apap，观察并记录生存曲线；
⑥
利用“daoslimit”观察干预组及对照组肝脏炎症细胞浸润，评估肝内炎症程度。
25.2实验结果
26.2.1实验结果具体可见附图1a-f。
27.附图1a-f：全身性mas1敲除加重了apap诱导的小鼠肝损伤。
28.(a,b,d-f)wt和mas1-/-小鼠给予腹腔注射apap，24小时后收集生物学样本进行检测(每组n＝6)。(a)肝组织免疫组化染色代表性图片：he(肝细胞坏死区域用白色虚线圈出)、tunel(细胞凋亡)、f4/80(巨噬细胞)、mpo(中性粒细胞)。箭头指向阳性染色。标尺:100μm。(b)血清alt水平。(c)对wt和mas1-/-小鼠进行致死剂量apap注射(650mg/kg，每组n＝12,log-rank检验)，绘制生存曲线。(d)具有代表性的肝组织western blot检测条带。(e)小鼠肝组织mrna水平：热图形式展示凋亡、坏死、铁死亡和炎症通路相关基因的表达＝(每组n＝3)。(f)daoslimit检测活体小鼠肝内中性粒细胞(ly6g,红色)和巨噬细胞(f4/80，绿色)在血管(wga，蓝色)内外的动态变化。在apap给药后3和22小时采集代表性活体亚细胞成像图像，结果展示了中性粒细胞的平均迁移速度，以及给药后3-4小时内中性粒细胞数量随着时间变化的轨迹。
29.2.2实验结果具体可见附图2a-l。
30.附图2a-l：体内激活小鼠mas受体可诱导脂噬和脂肪酸氧化，从而减轻apap诱导的肝损伤程度。
31.(a-l)基于wt小鼠构建apap诱导的急性肝损伤模型，造模前体内预先给予mas受体特异性激动剂(ave0991)及溶剂对照，24小时后收集生物学样本进行检测(每组n＝6)。(a)肝组织免疫组化染色代表性图片：he(肝细胞坏死区域用白色虚线圈出)、tunel(细胞凋亡)、f4/80(巨噬细胞)、mpo(中性粒细胞)。箭头表示阳性染色。标尺:100μm。(b)血清alt水平。(c)预先体内给予wt小鼠ave0991及溶剂对照，随后腹腔注射致死剂量apap(650mg/kg)并绘制生存曲线(每组n＝12)。(d)具有代表性的肝组织western blot检测条带。(e)daoslimit观察小鼠肝内中性粒细胞数量和平均迁移速度的代表性图像。(f)小鼠肝组织的自噬水平：代表性电镜照片(左)和统计分析(右)(黑色箭头指向自噬小体)。标尺:2μm。(g)小鼠肝组织的脂噬水平：bodipy(红色，标记脂滴)/lamp1(绿色，标记溶酶体)代表性共聚焦照片(上图)及共定位的定量(下图)。(h)具有代表性的肝组织western blot检测条带。(i)热图显示小鼠肝组织内脂肪酸降解、自噬和脂滴等通路相关基因的mrna水平。(j)采用spearman相关分析确定代谢组学(脂肪酸)和转录组学(脂肪酸降解和自噬途径相关基因)数据之间的相关性，并进行聚类分析。热图显示了目标类型脂肪酸的表达水平。(k)肝组织
tg浓度。(l)肝组织特定基因的mrna水平。
32.3实验结论
33.3.1敲除mas受体可显著加重apap诱导的急性肝损伤的严重程度，体内同时可观察到脂噬及脂肪酸β-氧化受到明显的抑制。
34.3.2激活mas受体可显著减轻apap诱导的急性肝损伤的严重程度，体内同时可观察到脂噬及脂肪酸β-氧化的水平显著上调。
35.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。