一种应用iTRAQ技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法与流程

一种应用itraq技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种应用itraq技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法。


背景技术：

2.在众多生食鱼片中，三文鱼凭借其颜色鲜艳、肉质细嫩、肥而不腻的口感和丰富的营养价值，成为众多消费者的首选。日式料理店中的三文鱼刺身、超市中销售的可生食三文鱼肉等都需要经过冷链物流的运输。特别是冰鲜三文鱼，需要在捕捞后短时间内将温度降到0℃左右，随即包装运输，在运输和存储过程中，均严格控制在一定的温度范围内。温度始终处于冰点临界点，以保持肉质的柔软，同时适当的低温又能防止细菌繁殖，如此一来口感和营养都最大程度地保留了下来，保持了三文鱼细胞活体状态和食用口味鲜美。但这需要尽快从生产地运达目的地，导致物流成本较高，因此一些商家为了降低运输成本，延长保存时间，会将三文鱼进行冷冻运输，在这个过程中，细胞内部分水冻结形成冰晶，体积增加，从而引起细胞膜刺穿、破裂及部分肌肉纤维空间结构损伤；然后在解冻过程中，因细胞膜和肌纤维的损坏，导致体内大量的营养物质伴随着汁液流失而减少。因此，相比冰鲜三文鱼，冻融后的三文鱼口感较差、营养损失较多，市场价值也就大打折扣，且潜在的寄生虫和病原菌微生物还对消费者的身体健康带来严重威胁。
3.针对市场上冻融三文鱼“以次充好”的现象，有必要对其进行检测。传统的冻融鱼类鉴别技术有感官评价、微生物检测和理化分析，但感官识别技术需要依靠专业的人员，且评价结果具有一定的主观性，而微生物和理化方法操作复杂。相比于以上技术，光谱技术和电子鼻、电子舌等无损检测技术克服了其操作复杂、消耗时间长的缺点，可以通过建立不同的判别模型，来实现对新鲜和冻融样品的精准鉴别。但这些技术只能从变化终端入手，无法深入了解冻融处理后三文鱼品质机理方面的变化过程。
4.反复冻融对三文鱼品质方面的影响有很多，其中蛋白质作为鱼类肌肉组织的主要成分之一，其结构与功能特性对鱼类品质的影响较为显著，而质谱和蛋白组学研究技术的不断发展为进一步探究冻融后三文鱼品质变化的机理提供了技术支持。同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，itraq)技术是一种多肽体外标记技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽n末端或赖氨酸侧链基团，经高分辨率质谱仪分析，可同时比较多达8个样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术，同时结合生物信息学分析可进一步探明冻融处理后三文鱼品质机制。
5.因此尚未见应用itraq技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼方法的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对目前中国市场上三文鱼标签混乱、以次充好等现象，提供一种应用itraq技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，通过itraq蛋白组学技术，进一步
结合mrm验证，对冰鲜和冻融的三文鱼中蛋白进行定量和定性分析，获得冰鲜和冻融三文鱼蛋白组的变化。
7.针对上述目的，本发明第一方面提供一种应用itraq技术鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，其包含以下步骤：
8.(1)采集冰鲜和冻融处理的三文鱼样品，提取样品中的蛋白；
9.(2)对步骤(1)获得的蛋白质样品进行酶解、itraq标记、分离肽段及lc-ms质谱分析；
10.(3)对步骤(2)获得的蛋白质谱数据进行定性和定量分析，筛选两次重复数据进行t-test检验，p值小于0.05的蛋白，以及差异倍数(fold change)》1.2或《0.83的差异蛋白进行功能注释和代谢通路分析；
11.(4)对步骤(3)所得差异蛋白进行mrm验证，获取冰鲜和冻融三文鱼蛋白组的变化情况。
12.优选的，所述步骤(1)中提取三文鱼蛋白的方法为尿素法，并用bradford法测定蛋白浓度。
13.优选的，所述步骤(2)中是在肽段定量后各组样品按照试剂盒说明书进行酶切、肽段标记后进行分级，并进行质谱鉴定。
14.优选的，所述步骤(2)中是在肽段定量后各组样品分别取80μg，按照试剂盒reagent-8plex multiplex kit(美国ab sciex公司)说明书进行酶切、肽段标记后进行分级，并进行质谱鉴定。
15.优选的，所述步骤(2)中采用durashell-c 18色谱柱对标记后的肽段进行分级，将分级后的肽段用流动相a溶解后上样到液质联用仪，进行梯度洗脱并进行质谱检测，其中流动相a为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相b为含有0.1％甲酸和2％水的乙腈溶液，流动相流速为0.265ml/min。
16.优选的，所述步骤(2)中梯度洗脱程序为：0-1min，2-5％b；1-30min，5-20％b；30-54min，20-42％b；54.5-62min，80％b；62.1-68min，2％b。
17.优选的，所述步骤(2)中质谱条件为：采用正离子扫描模式，扫描范围350-1500m/z；雾化器(gs1)：50psi；辅助加热气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：35psi；离子源温度(tem)：550℃；去簇电压(dp)：80v；离子碰撞能量(ce)：10v。
18.优选的，所述步骤(3)中蛋白数据处理是使用proteinpilot 5.0.2软件对质谱结果进行统一和数据转换，三文鱼物种原始蛋白库于uniprot(http://www.uniprot.org)上进行下载。
19.优选的，所述步骤(3)中功能注释的方法为：利用欧洲生物信息研究所(european bioinformatics institute，embl-ebi)维护的quickgo(http://www.ebi.ac.uk/quickgo/)注释工具对差异蛋白进行基因本体(gene ontology，go)功能注释。
20.优选的，所述步骤(3)中代谢通路分析的方法为：利用京都基因和基因组百科全书(kegg)数据库(http://www.genome.jp/kegg/)对差异蛋白质进行代谢通路分析。
21.优选的，所述步骤(4)中mrm验证的具体步骤为：利用triple-tof 6600质谱对冰鲜和冻融三文鱼肌肉全蛋白分别进行扫描，proteinpilot 5.0.2软件进行搜库，将质谱数据进行转化，找到已鉴定的目标差异蛋白的肽段，利用skyline软件构建离子对，其中每个肽
段选取3-6个离子对使用nexera x2液相色谱仪串联qtrap-5500质谱(美国ab sciex公司)进行mrm验证；然后选取3个响应高、质荷比在150-1250m/z之间的离子对进行定量，对比差异蛋白变化倍数和离子对峰面积变化倍数。
22.优选的，所述步骤(4)中目标差异蛋白的差异倍数(fold change)》1.2或《0.83。
23.更优选的，所述步骤(4)中目标差异蛋白的差异倍数(fold change)》1.5或《0.5。
24.优选的，所述步骤(4)中找到已鉴定的20个目标差异蛋白，其中15个蛋白下调，5个蛋白上调。
25.优选的，所述20个目标差异蛋白的uniprot登录号为b5dge7、b9ele8、b5ri29、a0a1s3pt89、b5dgt9、b5dg55、a0a1s3kkp9、b5dgl3、a0a1s3m1a4、c0puh3、a0a1s3knt1、a0a1s3qrr9、a0a1s3ngd5、b5dg30、b5dft9、b5dgz1、b5dh07、a0a1s2x0c2、a0a1s3r5j0和b5dh17。
26.本发明的第二方面提供一种鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的生物标志物组合物，所述生物标志物组合物包括uniprot登录号为b5dge7、b9ele8、b5ri29、a0a1s3pt89、b5dgt9、b5dg55、a0a1s3kkp9、b5dgl3、a0a1s3m1a4、c0puh3、a0a1s3knt1、a0a1s3qrr9、a0a1s3ngd5、b5dg30、b5dft9、b5dgz1、b5dh07、a0a1s2x0c2、a0a1s3r5j0和b5dh17中的一种或多种的蛋白。
27.优选的，所述生物标志物组合物包括uniprot登录号为b9ele8、b5ri29、a0a1s3pt89、a0a1s3m1a4、b5dg30、b5dh07和b5dh17中的两种以上、三种以上、四种以上、五种以上、六种以上或七种的蛋白。
28.优选的，所述生物标志物组合物包括uniprot登录号为b9ele8、b5ri29、a0a1s3pt89、a0a1s3m1a4、b5dg30、b5dh07和b5dh17的蛋白。
29.优选的，所述生物标志物组合物包括uniprot登录号为b5dge7、b9ele8、b5ri29、a0a1s3pt89、b5dgt9、b5dg55、a0a1s3kkp9、b5dgl3、a0a1s3m1a4、c0puh3、a0a1s3knt1、a0a1s3qrr9、a0a1s3ngd5、b5dg30、b5dft9、b5dgz1、b5dh07、a0a1s2x0c2、a0a1s3r5j0和b5dh17的蛋白。
30.本发明的第三方面提供上述生物标志物组合物在鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼方面的应用。
31.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32.1、本发明采用高通量、灵敏度的itraq定量蛋白组学技术研究冰鲜和冻融三文鱼蛋白组变化，后续结合mrm验证，为筛选与三文鱼新鲜度变化有关的差异蛋白提供依据。
33.2、本发明可以从蛋白质角度区分冰鲜和冷冻三文鱼，为进一步解释冻融处理后三文鱼品质变化机理提供理论基础。
34.3、本发明深入到分子水平，体现出冻融处理后三文鱼的新鲜度变化机理，为不同储存方式三文鱼的区分提供了借鉴。
35.4、本发明应用前景广阔，有助于解决中国市场上受利益驱动而产生的三文鱼以次充好现象。
附图说明
36.图1是冻融三文鱼蛋白包含的可信肽段数量统计(a)、蛋白序列覆盖度(b)和差异
蛋白火山图(c)；
37.图2是冻融处理后的三文鱼差异蛋白go功能注释图；
38.图3是冻融处理后的三文鱼差异蛋白变化倍数及显著富集kegg代谢通路；
39.图4是冻融处理后的三文鱼itraq和mrm结果的比较。
具体实施方式
40.下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.实施例1、应用itraq技术研究冰鲜和冻融三文鱼蛋白组变化
42.1、样品制备
43.(1)购买大西洋鲑冰运至实验室，将其去皮、去刺，切分成长
×
宽
×
高约为5cm
×
5cm
×
5cm的鱼块样本，然后将其均分成6小组，依次命名为f1、f2、f3和t1、t2、t3。其中，f1、f2和f3样品直接进行蛋白提取，作为冰鲜三文鱼的两组平行样本(f组)，t1、t2和t3样品在实验室-18℃冰箱放置30d后，在4℃冰箱过夜解冻，作为冻融三文鱼的两组平行样本(t组)。样品利用组织研磨仪研磨匀浆后，准确称取混合均匀的鱼糜1g，加入15倍体积的尿素裂解液(含有7mol/l尿素和2mol/l硫脲)涡旋混匀后冰浴震荡提取1h，结束后于4℃、12000g条件下离心20min，收集上清液，并用bradford法测定蛋白浓度。
44.(2)取含有80μg蛋白的提取液置于离心管中，分别加入4μl试剂盒中的reducing reagent溶液，37℃水浴反应1h，加入2μl的cysteine-blocking reagent，室温避光放置10min，将还原烷基化后的蛋白溶液转移至10k的超滤管中，12000g离心20min，弃掉收集管底部溶液。然后按照酶与底物1:40的比例向超滤膜中分别加入2μg胰蛋白酶，37℃条件反应6h，12000g离心20min，得到酶解后的肽段。按reagent-8plex multiplex kit试剂盒(ab sciex)说明书对获得的肽段进行处理和标记。混合标记后的样品，涡旋振荡混匀，取出20μl混合标记肽段，用ziptip脱盐后进行triple-tof 6600质谱(美国ab sciex公司)鉴定，以检测标记效率和质量，其余混合液旋转真空干燥后冷冻保存待用。
45.(3)将干燥后的标记肽段溶解在100μl流动相a(20mm甲酸铵，ph10.0)中，用durashell-c18(4.6mm
×
250mm，5μm)色谱柱进行洗脱分离。流速为0.8ml/min，流动相b为20mm甲酸铵，80％acn，ph 10.0，梯度洗脱程序如下：0-5min，5％b；5-30min，5-15％b；30-45min，15-38％b；46-55min，38-90％b；55-65min，90-5％b。总洗脱时间65min，将前60min的洗脱液接入60个1.5ml离心管中，按极性合并成16管肽段复合物，真空干燥备用。
46.2、蛋白鉴定
47.(1)分级后的肽段复溶于流动相a后上样至液质联用仪，进行梯度洗脱并进行质谱检测。高效液相色谱条件：色谱柱为xbridge peptide beh c18柱(2.1mm
×
150mm，3.5μm，)，流动相a为加有0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相b为加有0.1％(v/v)甲酸和2％(v/v)水的乙腈溶液，设定流速0.25ml/min，梯度洗脱程序：0-1min，2-5％b；1-30min，5-20％b；30-54min，20-42％b；54.5-62min，80％b；62.1-68min，2％b。triple-tof6600高分辨质谱条件：采用正离子扫描模式，扫描范围350-1500m/z。雾化器(gs1)：50psi；辅助加热气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：35psi；离子源温度(tem)：550℃；去簇电压(dp)：80v；离子碰撞
能量(ce)：10v。
48.(2)使用proteinpilot 5.0.2软件对16个质谱结果进行统一和数据转换。三文鱼物种原始蛋白库于uniprot(http://www.uniprot.org)上进行下载，共含有88995条目标肽段序列。在数据库搜索中，条件参数设定如下表1所示：
49.表1蛋白质质谱数据搜库参数表
50.itemvaluesampletypeitraq8plex(peptidelabeled)cysalkylation美国promega公司digestiontrypsininstrumenttriple-tof6600specialfactorsureadenaturationidfocusbiologicalmodificationsdatabaseuniprot-salmosalar.fastaconf》0.05(10.0％)
51.3、差异蛋白筛选及生物信息学分析
52.(1)对搜库结果进行差异蛋白筛选，筛选条件：p-value《0.05，即对两次重复数据进行t-test检验，p值小于0.05的蛋白认为差异显著；差异倍数(fold change)》1.2或《0.83，即倍数变化大于1.2(上调)或小于0.83(下调)认为是差异蛋白，分析结果如图1所示。
53.由图1可见，共获得9219个二级谱图，匹配到2231个肽段，对应263个蛋白质，其中由42个只含有1条可信肽段，其余221个蛋白至少含有两条可信肽段(图1-a)；有34.2％的蛋白质序列覆盖率即质谱检测出的肽段氨基酸序列占整个蛋白序列的比率超过50％(图1-b)；与冰鲜三文鱼样品相比，在冻融三文鱼处理组中共找到38个差异蛋白，其中有26个蛋白显著下调，12个蛋白显著上调(图1-c)。有7种共同蛋白，分别为adp/atp转位酶、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶、线粒体型肌酸激酶、真核细胞延长因子、肌球蛋白重链、磷酸甘油酸变位酶和泛素。
54.(2)利用欧洲生物信息研究所(european bioinformatics institute，embl-ebi)维护的quickgo(http://www.ebi.ac.uk/quickgo/)注释工具对差异蛋白进行基因本体(gene ontology，go)功能注释，结果如图2所示。
55.(3)利用京都基因和基因组百科全书(kegg)数据库(http://www.genome.jp/kegg/)对差异蛋白质进行代谢通路分析，结果共找到差异蛋白参与的30个代谢通路，其中显著富集的有12条通路，参与个通路的蛋白数量与蛋白变化倍数如图3所示。其中参与代谢途径(metabolic pathways)的有9个蛋白，与细胞坏死(necroptosis)的蛋白有4个，参与糖酵解/糖异生途径(glycolysis/gluconeogenesis)、淀粉与蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)、钙信号通路(calcium signaling pathway)和紧密连接(tightjunction)的各有3个蛋白，参与嘌呤代谢(purine metabolism)、氨基酸代谢(glycine,serine and threonine metabolism)、碳代谢(carbon metabolism)、氨基酸生物合成(biosynthesis ofamino acids)、细胞衰老(cellular senescence)和胰岛素信号通路(insulin signaling pathway)的各有2个蛋白质。
56.4、差异蛋白mrm验证
57.利用triple-tof 6600质谱对冰鲜和冻融三文鱼肌肉全蛋白分别进行扫描，proteinpilot 5.0.2软件进行搜库，将质谱数据进行转化，找到已鉴定的20个目标差异蛋白(其中15个蛋白下调，5个蛋白上调)的肽段，利用skyline软件构建离子对，其中每个肽段选取3-6个离子对使用nexera x2液相色谱仪串联qtrap-5500质谱(美国ab sciex公司)进行mrm验证。然后选取3个响应高、质荷比在150-1250m/z之间的离子对进行定量，对比差异蛋白变化倍数和离子对峰面积变化倍数。验证结果发现，这20个蛋白的变化趋势与itraq定量蛋白组学技术分析的变化趋势基本相似(参见图4和表2)，与新鲜度变化密切相关，说明itraq技术可以作为筛选冰鲜和冻融三文鱼潜在标志性蛋白的方法。
58.表2与冻融三文鱼品质变化相关的差异蛋白mrm验证结果与itraq定量结果对比
[0059][0060][0061]
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。