快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条及其制备方法和应用。


背景技术：

2.牙周病是仅次于癌症的全球第二大疾病。第三次全国口腔流行病学调查的结果显示，我国成人牙周疾病患病率高达85.5％。牙周病的早期症状不易引起重视，易导致牙周组织长期慢性感染，炎症反复发作，这不仅损害口腔咀嚼系统的功能，还会严重影响健康。目前，已有大量研究表明唾液中葡萄糖(唾糖)浓度的升高会为变形链球菌、念珠菌、乳杆菌等菌群的生长提供营养物质，造成口腔微生物增殖，对牙齿及牙周组织造成一定程度的破坏。尤其是糖尿病患者较高的唾糖含量显著提高了此类人群患牙龈炎、牙周炎和牙缺失等口腔疾病的几率。因此，唾糖浓度的测定对口腔疾病的预防和诊疗具有重要的意义。
3.纸基传感器是一种简易的分析工具，具有成本低、可生物降解、灵活轻便等优点。尤其是直接是通过裸眼进行结果读取的试纸，对于低收入和中等收入国家缺乏医疗基础设施和训练有素医护人员的患者来说，无疑是一种最佳的检测方式。目前的唾糖试纸响应时间较长(5分钟)，不利于快速诊断。


技术实现要素：

4.因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条及其制备方法和应用。
5.为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条，所述试纸条中包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林，和显色促进剂，以及ph调节剂；
6.优选地，所述显色促进剂选自以下一种或多种：壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、杂多糖、纤维素和聚乙烯醇；
7.优选地，所述ph调节剂选自以下的一种或多种：盐酸、磷酸、醋酸、硫酸；和/或
8.优选地，所述试纸条的显色响应时间为30s～3min，进一步优选为30s～2min，最优选为30s～1min。
9.根据本发明第一方面的试纸条，其中，所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶或过氧化氢酶优选为辣根过氧化物酶。
10.根据本发明第一方面的试纸条，其中，所述试纸条中还包括：维生素c氧化酶、聚乙二醇-200、柠檬醛、牛血清白蛋白。
11.根据本发明第一方面的试纸条，其中：所述显色促进剂的质量分数为0.001-0.05％，优选为0.01％；和/或
12.所述ph调节剂的体积分数为2-5％，优选为3％。
13.本发明的第二方面提供了第一方面所述的快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条
的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
14.(1)将原料加入酶试剂中，混匀；
15.(2)向步骤(1)得到的溶液中加入明胶，浸泡滤纸；
16.(3)将步骤(2)中浸泡完成的滤纸冷藏烘干得到所述试纸条。
17.根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，所述原料包括葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸、4-氨基安替比林、显色促进剂溶液以及ph调节剂水溶液，其中所述显色促进剂以及ph调节剂水溶液为将所述显色促进剂溶解于所述ph调节剂水溶液中制得；
18.优选地，所述葡萄糖氧化酶的添加量为50～200u/ml，优选为50～150u/ml，最优选为100u/ml；
19.优选地，所述过氧化物酶的添加量为50～200u/ml，进一步优选为100～200u/ml，最优选为150u/ml；
20.优选地，所述2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的添加量为1～20mg/ml，进一步优选为1～10mg/ml最优选为5mg/ml；
21.优选地，所述4-氨基安替比林的添加量为10～50mg/ml，进一步优选为10～30mg/ml最优选为20mg/ml；和/或
22.优选地，所述显色促进剂溶液与所述酶试剂的体积比为0.5～2:10，进一步优选为0.5～1.5:10，最优选为1：10。
23.根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(1)中，所述原料还包括维生素c氧化酶、聚乙二醇-200、柠檬醛、牛血清白蛋白；
24.优选地，所述所述维生素c氧化酶的浓度为1～10u/ml，进一步优选为1～5u/ml，最优选为2u/ml；
25.优选地，所述聚乙二醇-200的添加量为10μl/ml～500μl/ml，进一步优选为50～200μl/ml，最优选为100μl/ml；
26.优选地，所述柠檬醛的添加量为0.5～2mg/ml，进一步优选为1～1.5mg/ml，最优选为1.22mg/ml；和/或
27.优选地，所述牛血清白蛋白的添加量为5mg/ml～50mg/ml，进一步优选为5mg/ml～20mg/ml，最优选为10mg/ml。
28.根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(2)中，所述明胶为明胶的水溶液；
29.优选地，所述明胶溶液的浓度为1～5g/ml，进一步优选为2～4g/ml，最优选为3g/ml；和/或
30.优选地，所述明胶溶液与步骤(1)中所述酶试剂体积比为0.5～5:10，进一步优选为1～3:10，最优选为2：10。
31.根据本发明第二方面的制备方法，其中，步骤(3)中，所述滤纸的浸泡时间为1～10小时，优选为1～5小时，进一步优选为2.5～3小时；
32.所述冷藏温度为-10～-30℃，优选为-15～-25℃，最优选为-20℃；
33.所述冷藏时间为6～24小时，优选为6～18小时，最优选为12小时；
34.所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或
35.所述烘干时间为10～60分钟，优选为20～50分钟，最优选为30分钟。
36.本发明的第三方面提供了一种唾液葡萄糖检测方法，所述方法包括使用第一方面所述的试纸条或按照第二方面所述方法制备的试纸条进行唾液葡萄糖的检测。
37.本发明的快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条可以具有但不限于以下有益效果：
38.本发明涉及一款用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条，用于体外检测，响应时间短，测试结果供受试者参考。对于口腔疾病的早期预防、初步判断、治疗等均具有重要的临床意义。
附图说明
39.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
40.图1示出了试验例1中不同时间试纸颜色对比图。
41.图2示出了试验例1中葡萄糖浓度为20mg/l时rgb强度与反应时间的关系。
42.图3示出了试验例1中不同葡萄糖浓度下试纸的显色结果。具体地，图3a和图3b分别示出了试验例1中不同葡萄糖浓度下30s和60s试纸的显色照片和rgb强度数值曲线。
43.图4示出了试验例1中不同含量的显色促进剂壳聚糖在显色1min时的照片。
44.图5示出了试验例1中不同含量的ph调节剂醋酸在显色1min时的照片。
具体实施方式
45.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
46.本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
47.以下实施例中使用的试剂如下：
48.酶试剂购于保定长城临床试剂有限公司；葡萄糖氧化酶购于amresco，辣根过氧化物酶、聚乙二醇-200、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸(98％)、柠檬醛(97％)，牛血清白蛋白(96％)，4-氨基安替比林(98％)，明胶购于macklin；维生素c氧化酶购于上海源叶生物科技有限公司，壳聚糖(95％)购于山东澳康生物科技有限公司，滤纸whatman 3号。
49.实施例1
50.本实施例用于说明本发明试纸条的制备方法。
51.用移液枪取10ml酶试剂注入培养皿中，向培养皿中依次添加1000u葡萄糖氧化酶，1500u辣根过氧化物酶，20u维生素c氧化酶，1ml聚乙二醇-200，1ml质量分数为0.01％壳聚糖溶液，体积分数为2％的醋酸水溶液中，10μl柠檬醛，100mg牛血清白蛋白，50mg 2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸，200mg 4-氨基安替比林混匀，然后再加入2ml明胶(3g明胶加入10ml蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，浸泡滤纸；滤纸的浸泡时间为24小时，然后-20℃冷藏12小时，再30℃烘干30分钟，得到本发明快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸条。
52.待测唾液样本中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下与氧气发生反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢进一步在过氧化物酶的催化作用下和2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸反应生成2，4-二溴-3，6-二氧六环-1，4-二烯甲酸，生成物再和4-氨基安替比林反应，
生成红色亚胺类物质。红色物质的生成量与葡萄糖含量正相关，因此反应产物的色度可以间接指示唾糖含量。
53.试验例1
54.本试验例用于说明本发明试纸条的对唾液葡萄糖的检验效果。
55.1.显色时间
56.利用唾液采集管(salivette)采集受试者的空腹唾液。混合唾液是将几组人的唾液混合到一起，经离子色谱测试，混合唾液的葡萄糖浓度是1.5mg/l。
57.向混合唾液中加入葡萄糖，配置成20mg/l葡萄糖溶液，其中“0”点是加入人工唾液作为对比。采用实施例1制备的试纸条对其进行检测。
58.从图1可以看出，30s时，裸眼就可以较清晰地观察到葡萄糖浓度在20mg/l时试纸的颜色。同时，本发明人研究了rgb强度与反应时间的关系。从图2可以看出，当葡萄糖浓度为20mg/l时，随着反应时间的延长，rgb强度逐渐趋于稳定，且50s后基本保持不变。证明在50s时，样本中的葡萄糖基本反应完全。
59.2.不同葡萄糖浓度试纸显色
60.向混合唾液中加入不同浓度的葡萄糖，配置成20、50、100mg/l葡萄糖溶液，其中“0”点是加入人工唾液作为对比。从图3可以看出，30s时就可以比较清晰地观察葡萄糖浓度为20、50、100mg/l时试纸的颜色，且随着浓度的增大，试纸颜色越深。
61.对比例1
62.本试验例用于说明本发明试纸条的对唾液葡萄糖的检验效果。
63.本对比例分两组按照实施例1所述的方法制备试纸条，区别仅在于第一组中各试纸条为未加入和加入不同含量的显色促进剂壳聚糖；第二组中各试纸条为未加入和加入不同含量的ph调节剂醋酸。
64.采用试验例1所述的方法对对比例1制备的试纸条进行测试。结果如图4、5所示，具体地：
65.如图4所示，试验例1中不同含量的显色促进剂壳聚糖在显色1min时的照片表明，未加入壳聚糖的显色缓慢、效果不甚显著，而加入壳聚糖比例为0.001％以上显色迅速、效果较好，最佳显色效果为0.01％含量的壳聚糖。具体经测量结果为：未加入壳聚糖和加入含量分别为0.001％、0.01％和0.02％的壳聚糖后的rbd强度依次分别为116.4
±
21.5、126.7
±
25.0、121.2
±
21.2、125.1
±
24.6。
66.如图5所示，试验例1中不同含量的ph调节剂醋酸在显色1min时的照片表明，未加入醋酸的显色缓慢，效果不甚显著，而加入体积分数为2％以上的醋酸显色迅速，效果较好，最佳显色效果为3％的醋酸。具体经测量结果为：未加入醋酸和加入含量依次分别为2％、3％、4％和5％的醋酸后的rbd强度分别为171.7
±
8.9、142.4
±
10.8、143.0
±
6.9、129.1
±
4.3、129.2
±
6.2。
67.尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。