测定mRNA平均分子量以及Cap0/1、修饰核苷酸及氧化物的方法与流程

技术特征：
1.一种测定样品中mrna平均分子量的方法，其特征在于，其包括：(1)获得样品的毛细管电泳图；(2)根据公式(i)∫
ba
(n*320.5 159)*f(n)d(n)计算得mrna平均分子量，其中，a为毛细管电泳中所检测到的最短mrna的碱基个数，b为最长碱基个数，f(n)＝mrna所占比例，n＝mrna总碱基个数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将毛细管电泳图横坐标分为n等分并命名为a1、a2…
a
n-1
、a
n
，其中a
n
＝b，所述n≥5，优选地，n≥10；通过如下公式(ii)对所述公式(i)进行求解：所述r为区间(a
n-1
,a
n
)内的峰面积占比。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用small rna reagent kit以及gx touch
tm
nucleic acid analyzer进行毛细管电泳，以获得样品的毛细管电泳图；优选地，所述样品在进行毛细管电泳前还包括除去游离核苷酸的步骤；所述除去游离核苷酸例如采用licl沉淀法，离子交换树脂层析，制备级液相色谱或商业用试剂盒进行。4.一种测定样品中mrna的物质的量的方法，其特征在于，其包括如下步骤：1)测定样品中mrna中的质量浓度，计算样品中mrna的质量；2)根据如权利要求1-3中任一项所述的方法，测定样品中mrna平均分子量；3)根据步骤1)所述的mrna的质量和步骤2)中所得样品中mrna平均分子量得出样品中mrna的物质的量。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用超微量分光光度计测定样品中mrna的质量浓度；所述超微量分光光度计例如thermo scientific nanodrop one或者mettler toledo uv5 nano。6.一种mrna中核苷酸含量的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括：(a)通过如权利要求4或5所述的方法获得所述mrna的物质的量；(b)测定不同的所述核苷酸的物质的量；(c)根据步骤(a)中不同的所述核苷酸的物质的量和步骤(b)中所述mrna的物质的量，计算不同的所述核苷酸在mrna中的含量；以上步骤(a)和(b)没有顺序要求，能够分别、同时进行或者先后进行。7.如权利要求6所述的测定方法，其特征在于，步骤(b)中，通过hplc测定水解的mrna中不同核苷酸的含量，根据其相对分子质量计算得到不同核苷酸的物质的量；优选地，所述水解包括如下步骤：i.将待水解mrna与核酸内切酶p1混合，并加入缓冲液a后42℃孵育；所述孵育的时间例如为2小时；所述待水解mrna、核酸内切酶p1与缓冲液a的体积比例如为100:10:33；ii.向步骤i所得孵育产物中添加磷酸二酯酶i和碱性磷酸酶，并加入缓冲液b，于37℃孵育；所述孵育的时间例如为2小时，所述磷酸二酯酶i、碱性磷酸酶以及缓冲液b的体积比
例如为3.3:3.3:10.6；和/或，步骤(b)中的所述hplc测定包括：i)使用不同浓度的特定核苷酸的标准品制作浓度与峰面积的标准曲线；ii)获得不同的所述核苷酸的峰面积后，对应所述标准曲线计算得所述核苷酸的浓度；其中，所述hplc的参数例如为：柱温25℃，流速0.85ml/min，检测波长254nm，流动相a为5mm醋酸铵水溶液，流动相b为40％乙腈水溶液，梯度100％a—20％b，50min。8.如权利要求6或7所述的测定方法，其特征在于，所述核苷酸包括尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、及其相应的修饰核苷酸以及氧化后核苷酸中的一种或多种；优选地，所述修饰核苷酸包括：7-甲基-鸟嘌呤核苷、2
’‑
氧甲基-鸟嘌呤核苷、假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷、5-甲基-胞嘧啶核苷、4-乙酰基-胞嘧啶核苷以及6-甲基-腺嘌呤核苷中的一种或多种。9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，a.所述7-甲基-鸟嘌呤核苷的占比通过如下公式获得：cap0％＝7-甲基-鸟嘌呤核苷物质的量/mrna物质的量
×
100％；b.所述2
’‑
氧甲基-鸟嘌呤核苷的占比通过如下公式获得：cap1％＝2
’‑
氧甲基-鸟嘌呤核苷物质的量/mrna物质的量
×
100％
×
cap0％；c.所述修饰核苷酸的占比通过如下公式计算：修饰核苷酸％＝修饰核苷酸的物质的量/(修饰核苷酸的物质的量 修饰前核苷酸的物质的量)
×
100％；d.所述氧化后核苷酸的占比通过如下公式计算：氧化后核苷酸％＝氧化后核苷酸的物质的量/(氧化后核苷酸的物质的量 氧化前核苷酸的物质的量)
×
100％。10.如权利要求8或9所述的测定方法，其特征在于，所述氧化后核苷酸包括8-氧-鸟嘌呤核苷。

技术总结
本发明公开了一种测定mRNA平均分子量以及Cap0/1、修饰核苷酸及氧化物的方法。所述方法包括：(1)获得样品的毛细管电泳图；(2)根据本发明公式(I)计算得mRNA平均分子量。利用本发明方法能够对mRNA平均分子量以及裂解mRNA后得到的各种类型的核苷酸的占比进行精确的测定。测定。


技术研发人员：郭传鑫 朱雷 刘连晓 张平静 蔡晓茹 刘韬 高海霞 钱其军
受保护的技术使用者：上海细胞治疗集团有限公司
技术研发日：2021.05.12
技术公布日：2022/11/15