一种用于胶质瘤恶性程度诊断标志物及其检测方法与流程

技术特征：
1.一种用于胶质瘤恶性程度诊断标志物，其特征在于：是由天冬酰胺内肽酶介导切割产生的人原肌球蛋白调节蛋白3的特异性切割带。2.一种如权利要求1所述用于胶质瘤恶性程度诊断标志物的作用，其特征在于：观察检测样本的所述人原肌球蛋白调节蛋白3特异性切割带的切割率。3.一种检测如权利要求1所述的用于胶质瘤恶性程度诊断标志物方法，其特征在于：通过免疫印迹法检测样本中的人原肌球蛋白调节蛋白3特异性切割带。4.如权利要求3所述的一种检测胶质瘤恶性程度诊断标志物方法，其特征在于，所述免疫印迹法为：1)蛋白样品准备，细胞或组织蛋白抽提后加入适量的电泳上样缓冲液,金属浴100℃煮10min；2)聚丙烯酰胺凝胶电泳，用微量加样器将蛋白样品及蛋白分子量标准小心地加入孔中，正确连接电泳槽，设置电泳为80v,待蛋白样品前沿进入分离胶后，将电压调为120v，直到样品前沿迁移至凝胶底部，关闭电泳仪；3)转膜，提前备好1
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转膜缓冲液，并预冷处理，裁剪好pvdf膜，取出pvdf膜放入甲醇中浸泡14～16秒，活化pvdf膜；蛋白电泳转膜装置的夹板正确顺序依次摆放；在冰浴中用250ma恒流转膜2小时；4)封闭，先将已经转膜好的pvdf膜移至含有洗涤缓冲液溶液的器皿中，然后再浸入5％脱脂牛奶中，在室温下封闭1小时；5)一抗孵育，将所需要的一抗anti-flag、anti-tmod3、anti-aep按照抗体说明书上的比例要求，稀释在洗涤缓冲液溶液配置的5％脱脂牛奶中，放在摇床上4℃过夜；次日，取出已孵育好一抗的pvdf膜，需用洗涤缓冲液溶液洗，每隔10min换一次洗涤缓冲液溶液,共3次；6)二抗孵育，根据不同的种属一抗，选择hrp标记过的鼠/兔/羊二抗；将所需要的二抗按说明书上的稀释比例用洗涤缓冲液溶液配置的5％脱脂牛奶稀释，然后把清洗后的pvdf膜放置在二抗中孵育，密封后放在在摇床上或电动转子上孵育2小时；取出pvdf膜，继续用洗涤缓冲液溶液洗15min，每5min换一次洗涤缓冲液溶液；7)显影，将化学发光显影剂将试剂盒中a、b液按照1:1的比例配好制成发光工作液，所需剂量要根据膜面积大小而定，在使用前需要避光；曝光前先用平头镊将pvdf膜从洗涤缓冲液溶液中取出，用滤纸将膜背面水分略微吸干后放到压片盒内，正面向上；表面滴加适量的发光工作液，在显影仪内进行显影。5.一种构建野生型tmod3及相应点突变tmod3过表达胶质瘤稳转细胞株方法，其特征在，包括下列步骤：1)慢病毒包装，将正处于对数生长期的293t细胞按照1
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106细胞/孔接种到6cm细胞培养皿中，常规培养过夜；次日，倒掉培养液并用pbs轻轻地洗涤一次，再加入1.5ml无抗、无血清的dmem培养液；再取250μl的dmem培养液，并加入10μl的转染试剂，常温下静置5min后，加入4μg/平皿的慢病毒载体混合物250μl，在室温下放置20min后，轻缓地将其加入至上述细胞培养液，轻轻摇晃使其混匀，混匀后放入37℃、5％co2温箱中培养6小时；6小时后丢弃培养液，再加入2ml含10％fbs、无抗生素的dmem培养基，继续培养72小时；72小时后，收集病毒上清液，离心管内3000rpm离心10分钟，并吸取上清分装到ep管中,-80℃保存备用；
2)慢病毒感染，将处于对数生长期的胶质瘤细胞按照2
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105细胞/孔接种在6孔板中，加入上述步骤1)制成病毒液，再加入终浓度6μg/ml的助染液，常规恒温孵育箱内培养过夜；次日更换新鲜的培养液，继续培养48h，在光镜下观察荧光。6.如权利要求5所述的一种构建野生型tmod3及相应点突变tmod3过表达胶质瘤稳转细胞株方法，其特征在于：所述慢病毒载体混合物包括tmod3克隆质粒、壳蛋白质粒pmd2g和包装质粒pspax2，并将上述按照摩尔数4:1:2比例配制。7.一种构建tmod3重组质粒与相应点突变的tmod3重组质粒的方法，其特征在于：包括下列步骤：1)片段扩增；使用高保真dna聚合酶进行片段扩增；2)琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收；3)载体酶切；4)连接及感受态转化；5)质粒抽提。8.如权利要求7所述的一种构建tmod3重组质粒与相应点突变的tmod3重组质粒的方法，其特征在于：所述3)载体酶切中的表达载体pcdna3.1( )-3
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flag-c。9.如权利要求7所述的一种构建tmod3重组质粒与相应点突变的tmod3重组质粒的方法，其特征在于：所述2)琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收中用的琼脂糖胶包括tae缓冲液与琼脂糖。10.如权利要求7所述的一种构建tmod3重组质粒与相应点突变的tmod3重组质粒的方法，其特征在于，所述1)片段扩增中用到的引物如下：

技术总结
本发明公开了一种用于胶质瘤恶性程度诊断标志物及其检测方法，是由天冬酰胺内肽酶(AEP)介导切割产生的人原肌球蛋白调节蛋白3(TMOD3)的特异性切割带；本发明检测到了TMOD3的特异性切割带，并通过点突变的方法准确筛选到了相应的AEP切割位点；在胶质瘤相关细胞系中进行了验证，相较于正常细胞，胶质瘤细胞中存在显著的TMOD3切割带；因此，人原肌球蛋白调节蛋白3(TMOD3)切割率可以用做患者的预后数据使用指标之一；在动物实验上提供了AEP切割人TMOD3是AEP小分子抑制剂发挥抗肿瘤疗效的指征之一。指征之一。指征之一。


技术研发人员：高海洋
受保护的技术使用者：汉尹生物科技（上海）有限公司
技术研发日：2021.05.10
技术公布日：2022/11/10