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t细胞在gvhd早期诊断中的应用
技术领域
1.本发明属于医学检验技术领域，具体涉及cd38

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t细胞在gvhd早期诊断中的应用。


背景技术：

2.在移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，gvhd)是异基因造血干细胞移植后出现的多系统损害(包括皮肤、食管、胃肠、肝脏等)的全身性疾病。移植物抗宿主病是一种特异的免疫现象，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与免疫受抑制的宿主、组织不相容性抗原的组织之间的免疫反应。移植物抗宿主病又可分为急性移植物抗宿主病(agvhd)和慢性移植物抗宿主病(cgvhd)。其中，agvhd是异基因造血细胞移植后非复发性死亡的主要原因，通常发生在异基因造血细胞移植后3个月内。供体t细胞对宿主细胞上基因确定的蛋白质表现出免疫不耐受是移植物抗宿主病发生的本质。
3.异基因造血干细胞移植术后急性移植物抗宿主病从发病机理分为三个阶段：1、预处理：预处理放化疗导致组织损伤，炎症因子释放及抗原暴露；2、供者t细胞诱导及增殖：供者t细胞识别受者抗原并激活、互相刺激及过度增殖；3、效应阶段：供者t细胞中激活的cd4 细胞通过释放细胞因子、激活的cd8

细胞通过细胞毒效应导致受者非造血组织的损伤，并表现出agvhd的各种临床表现。目前agvhd临床诊断集中在阶段3，主要根据非造血组织损伤的临床表现诊断继而启动治疗，特异性高，但敏感性较低。早期诊断，早期治疗是agvhd诊治成功的关键。本专利中，我们尝试在阶段2，争取在t细胞超量活化阶段，及早诊断、及早治疗。
4.降低gvhd相关发病率和死亡率的重要方法集中于在临床表现之前能够预测移植物抗宿主病、确定测量预测指标的最佳时间，这样就有机会先发制人，提供一个机会终止移植物抗宿主病的发展，并对移植物抗宿主病的病理生理学获得新的见解。并将很好地测试gvhd风险分层方案，指导风险适应治疗(通过选择预防方案或进行“抢先”干预治疗)，以改善异基因造血干细胞移植后的结果。
5.目前gvhd的诊断大多需要待患者出现皮疹、腹泻等病理变化，不利于尽快用药干预和治疗。因此，对gvhd早期诊断尤为重要，可及时指导临床用药。
6.cd38

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t细胞是一群活化的t细胞，已被研究证实可作为区分噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和早期败血症的诊断标记物。但其与gvhd之间的关系尚未有研究涉及。


技术实现要素：

7.基于此，本发明的目的在于提供cd38

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t细胞在gvhd早期诊断中的应用，检测灵敏度和特异性均高达100％。
8.实现上述目的的具体技术方案如下。
9.cd38

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t细胞在制备移植物抗宿主病检测试剂的应用。
10.cd38

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t细胞在筛选移植物抗宿主病检测试剂中的应用。
11.cd38

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t细胞检测试剂在制备移植物抗宿主病检测试剂盒中的应用。
12.在一些实施例中，所述移植物抗宿主病为急性移植物抗宿主病。
13.在一些实施例中，所述检测试剂为流式细胞术检测试剂。
14.在一些实施例中，所述检测试剂为流式细胞术检测抗体。
15.本发明还提供了一种移植物抗宿主病检测试剂盒，所述试剂盒包含检测cd38

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t细胞在生物样本中的含量的试剂。
16.在一些实施例中，所述检测cd38

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t细胞在生物样本中的含量的试剂包含抗cd38抗体、抗hla-dr抗体和抗cd8抗体。
17.在一些实施例中，所述试剂盒还包括外周血单个核细胞分离试剂。
18.在一些实施例中，所述试剂盒还包括红细胞裂解液和pbs缓冲液。
19.以上所述cd38

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t细胞是指cd38阳性hla-dr阳性cd8阳性t细胞。
20.本发明通过对移植物抗宿主病患者外周血样本进行分析发现，与健康志愿者和移植后未出现移植物抗宿主病的患者相比，移植物抗宿主病患者外周血中cd38

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t细胞的比例显著升高，且经过roc曲线分析发现，cd38

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t细胞在用于急性移植物抗宿主病的早期诊断时auc为1，灵敏度和特异性均高达100％(p＜0.0001)。这些结果表明cd38

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t细胞是一个诊断效果很好的的急性移植物抗宿主病早期标记物，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，减轻患者的负担和痛苦。因此，cd38

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t细胞检测试剂可作为急性移植物抗宿主病的早期诊断试剂，用于制备急性移植物抗宿主病早期诊断试剂盒。
附图说明
21.图1为代表样本的流式结果分析图。
22.图2为流式细胞分析结果统计图；其中，hds代表健康志愿者；non-gvhd代表移植后未出现移植物抗宿主病的患者；agvhd代表急性移植物抗宿主病患者。
23.图3为cd38

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t细胞在用于急性移植物抗宿主病诊断时的roc曲线分析图；其中，non-gvhd代表移植后未出现移植物抗宿主病的患者；agvhd代表急性移植物抗宿主病患者。
具体实施方式
24.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
25.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
26.以下结合具体实施例对本发明进行说明。
27.实施例1
28.本实施例利用流式细胞书对健康志愿者、移植后未出现移植物抗宿主病的患者和急性移植物抗宿主病患者外周血样本中cd38

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t细胞的含量进行检测。具体如
下：
29.一、实验方法
30.1、样本信息
31.急性移植物抗宿主病患者(agvhd)纳入标准：
32.(1)接受异基因造血干细胞移植；
33.(2)主要根据皮肤、胃肠道和肝脏受累临床症状及实验室结果诊断。必要时经病理活检证实。根据ibmtr分级系统，临床诊断为ii至iv级急性gvhd；
34.由受试者或受试者的法律上可接受的代表签署知情和书面同意书。
35.未出现移植物抗宿主病的患者(non-gvhd)纳入标准：
36.(1)接受异基因造血干细胞移植；
37.(2)移植后，采集受试者样本之前，不符合以上agvhd的临床及实验室标准。未达到ibmtr分级系统中未达ii至iv级急性gvhd。
38.由受试者或受试者的法律上可接受的代表签署知情和书面同意书。
39.健康志愿者(hds)纳入标准：
40.(1)无任何全身疾病，包括：未控制的高血压、不稳定心绞痛、最近3个月内开始发作的心绞痛，充血性心力衰竭(≥纽约心脏病协会[nyha]i级)、半年内的心肌梗死、需要药物治疗的严重心律失常、无肝脏、肾脏或代谢性疾病；
[0041]
(2)无感染、精神疾病。
[0042]
由受试者或受试者的法律上可接受的代表签署知情和书面同意书。
[0043]
根据上述纳入标准，agvhd组共纳入10例，其中，男性7例，女性3例，平均年龄29岁；non-gvhd组共纳入18例，其中，男性6例，女性12例，平均年龄22岁；hds共纳入8例，其中，男性6例，女性2例。样本临床信息统计分析如表1所示，年龄和性别等临床信息差异无统计学意义。
[0044]
表1
[0045][0046]
2、流式细胞术检测
[0047]
用含edta抗凝采血管收集各组外周血样本后，先外周血单个核细胞(pbmc)分离，具体操作如下：向外周血样本中加入血液3倍体积的pbs溶液，混匀，得到稀释血液样本。向50ml无菌离心管中加入与所述稀释血液样本等体积的淋巴细胞分离液，用吸管将所述血稀释液沿着管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液的上方，然后将离心管于18℃下600g(升5，降0)，
离心22min。离心结束后，小心吸取中间白膜层，放人干净的15ml离心管中，然后加入10ml预冷的pbs溶液，混匀；室温下将离心管于2000rpm/min离心5min，弃尽上清。向获得的细胞沉淀中加入3ml红细胞裂解液(ack)进行红细胞裂解，室温裂解5min后，加入10ml预冷的pbs终止裂解。室温下将离心管于2000rpm/min离心5min，弃尽上清。用5ml pbs进行重悬细胞沉淀，获得pbmc单细胞悬液，计数后用于流式细胞术检测。
[0048]
流式细胞术检测使用的抗体组合为：pe anti-human cd38(biolegend，356604)、apc-cyanine7 anti-human hla-dr(tonbo，25-9952-t100)、percp/cyanine5.5 anti-human cd8(biolegend，301032)、pe-cyanine7 anti-human cd3(tonbo，60-0037-t100)。检测方法如下：
[0049]
(1)各取1million的pbmc加入流式管中，然后加入5ml pbs，混匀，将流式管于2000rpm/min离心5min，弃上清；
[0050]
(2)按照抗体说明书，将cd38、hla-dr、cd3和cd8抗体以体积比为1:200的比例加入pbs中，获得抗体稀释液，每个样本的pbmc中加入100μl抗体稀释液进行染色：将流式管于振荡器上振荡，充分混匀，于4℃冰箱避光染色30min。
[0051]
(3)染色结束后，向流式管中加入4ml pbs，并于2000rpm/min离心5min，弃上清；向细胞沉淀中加入300μl pbs重悬细胞，得到待上机检测样品。
[0052]
(4)使用流式分析仪进行检测，并用flowjo10软件进行分析。
[0053]
3、统计分析
[0054]
利用graphpad 9.2.0计算各组数据中位数和计算p值，以p＜0.05视为差异具有统计学意义。
[0055]
二、实验结果
[0056]
流式结果分析流程如图1所示，根据图1所示分析方法获得各样本中cd38

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t细胞的比例，并进行统计分析。图2为流式分析结果统计图，如图所示，与健康志愿者(hds)和移植后未出现移植物抗宿主病的患者(non-gvhd)相比，急性移植物抗宿主病患者(agvhd)外周血中cd38

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t细胞的比例显著升高，提示cd38

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t细胞可作为agvhd潜在的诊断标记物。
[0057]
为此，本发明进一步进行了roc曲线分析，结果显示，cd38

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t细胞在用于agvhd的早期诊断时，auc为1，灵敏度和特异性均高达100％(图3)。
[0058]
上述结果表明，cd38

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t细胞是一个诊断效果很好的的agvhd早期诊断标记物，准确率高，具有很高的临床应用价值，可及时指导临床用药，降低gvhd相关发病率和死亡率。
[0059]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0060]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。