一种近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料

1.本发明涉及一种近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料，属于生物医用材料技术领域。


背景技术：

2.皮肤是保护身体的毛细血管、神经、脏器等组织不轻易受外界的环境变化所刺激伤害的重要器官，在润滑，调节体温，感知外界刺激等方面发挥着重要作用。受损皮肤的再生是重建组织完整性和恢复皮肤正常功能的最基本要求。众所周知，细菌感染是伤口愈合的主要障碍之一，并且会引起其他的并发症，严重伤口脱水会干扰理想的湿润愈合环境并延缓伤口愈合，严重时甚至可以危及生命。传统伤口敷料例如棉花、纱布等，由于本身干燥，在包扎伤口时容易黏附到伤口上，移除后会造成二次伤害，所以越来越多的研究人员将注意力转向湿敷料的开发上。其中水凝胶由于其亲水性的三维网络可以存储大量的水，强度和韧性可以调节等特点，备受关注。在允许气体交换的同时具有高吸水高保水的特性，生物相容性良好，在与外界起到屏障作用的同时除去伤口渗出物，保证伤口环境湿润，二次移除无伤害。
3.目前临床上普遍使用抗生素治疗破损皮肤感染，但抗生素除了治疗周期长，除会引起细菌耐药性外，还可以引起诸多不良反应。光热抗菌法是通过对一定波长的近红外光有吸收的物质将光能转换为热能，在近红外光达到深层的同时高温破坏细菌的蛋白质，达到抑菌效果。这种方法可以极大缩短治疗时间，且具有避免细菌产生耐药性、安全高效等优点。目前光热剂主要应用领域为抗肿瘤、抗血栓等，其在抗菌领域的应用有待进一步开发。
4.常规水凝胶由物理或化学交联而成，通常机械性能较差，平衡-溶胀比小，这极大限制了它们作为敷料的实际应用。基于医用敷料现状，亟需一种具有良好机械性能、光热抗菌性能、吸水保湿性、生物相容性水凝胶敷料，在为伤口提供必要的力学支撑的同时，实现对易感染伤口的治疗和管理。


技术实现要素：

5.本发明的敷料为一种近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料，具有优异的弹性和拉伸性能，在很好的贴合伤口的同时同步机体运动；在近红外光的辐照下，表现出良好的光热抗菌效果，防止伤口细菌感染。本发明采用热交联成胶，过程简单，操作容易，产量大且稳定，力学性能优异，光热抗菌效果明显，解决了现有技术存在的缺陷和不足。
6.本发明的目的在于解决传统伤口敷料和抗菌敷料存在的问题，提供一种近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料的制备方法，通过在海藻酸钠—丙烯酰胺凝胶网络中引入具有光热效果的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物制备具有近红外响应的纳米复合水凝胶。所制备的水凝胶具有良好的光热效果，在保证伤口环境湿润的同时实现无负载抗生素光热抗菌并促进伤口愈合。
7.本发明的另一目的在于提供由上述方法制备得到的具有近红外响应性能的水凝
胶抗菌敷料。本发明的水凝胶具有很好的弹性和拉伸性能，能在很好的贴合伤口的同时同步机体运动，在近红外光的辐照下，表现出良好的光热抗菌效果，防止伤口的细菌感染。本发明的近红外响应抗菌水凝胶敷料可应用于防止伤口术后感染和感染伤口治疗。
8.一种近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料，所述敷料由丙烯酰胺-海藻酸盐水凝胶和原位负载于水凝胶中的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物构成；所述敷料具有光热抗菌性。
9.本发明所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物中硫化铋为粒子状态，均匀分布于丙烯酰胺-海藻酸盐水凝胶中。
10.本发明所述近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料中，所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物在波长为808nm近红外光下发生光热转换。
11.本发明制得的近红外响应纳米复合水凝胶能够应用在感染的皮肤组织损伤修复中，如伤口敷料方面。
12.优选地，所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物中硫化铋为晶体粒子，平均粒径为100nm～200nm，zeta电位测定显示其带负电。
13.本发明所述近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料中，所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物于的水凝胶的负载量，以硫化铋计，为35～500μg/ml，优选为197～500μg/ml，更优选为197～395μg/ml。
14.本发明所述近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料中，硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物于水凝胶中的负载量，以硫化铋质量和水凝胶的体积计为35～500μg硫化铋：1ml水凝胶。
15.优选地，所述丙烯酰胺-海藻酸盐水凝胶为丙烯酰胺-海藻酸钠水凝胶，或丙烯酰胺-海藻酸钾水凝胶。
16.优选地，所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物按下述方法制得：将质量浓度为25.31％～37.25％的牛血清白蛋白水溶液与质量浓度为1.93％～2.84％的硝酸铋溶液混合均匀，得混合溶液；向所得混合溶液中加入2mol/l的氢氧化钠溶液，室温下调节溶液ph为10～14，得到反应液；所得的反应液在20～37℃持续搅拌反应12～24h，透析后冻干，得到硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物。
17.优选地，所述敷料按下述方法制得：将硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的水分散液与丙烯酰胺、海藻酸盐、交联剂、引发剂、催化剂充分搅拌后超声混合均匀，获得预聚液；将预聚液进行成胶，得到近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料。
18.进一步地，所述海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾；所述交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺或n-羟甲基丙烯酰胺，所述引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述催化剂为三甲基乙二胺；
19.所述丙烯酰胺的用量为硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的水分散液与丙烯酰胺总质量的6％～25％；所述海藻酸盐的用量为硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的水分散液与海藻酸盐总质量的1.5％～4％；所述交联剂的用量为丙烯酰胺质量的0.05％～1.5％；所述引发剂的用量为丙烯酰胺质量的0.04％～0.22％；所述催化剂的用量为丙烯酰胺质量的3.25％～8％。
20.进一步地，所述的超声条件为80～800w，20～100hz，超声时间为0.5～50h；所述成
胶温度为20～80℃，成胶时间为1～12小时。
21.进一步地，所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的水分散液按下述方法制得：所述硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的水分散液按下述方法制得：将冻干后的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散在水中，以硫化铋计，分散液中硫化铋为35～395μg/ml，借助超声使其分散均匀，超声条件为80～800w，20～100hz，超声时间为0.5～4h。
22.本发明的有益效果为：本发明公开的制备方法，以白蛋白为硫源，借助生物矿化法制备出的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物具有良好的生物相容性和水分散性；将海藻酸钠混入丙烯酰胺凝胶体系中，可以使其具备优良的力学性能和弹性；将硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物引入凝胶体系中可以使其具备优良的光热性能。
23.经本发明方法制得的水凝胶具有以下优点：本发明的水凝胶敷料具有优异光热抗菌效果，可以实现伤口表面的快速抗菌。本发明的水凝胶敷料中所用的光热材料硫化铋纳米粒生物相容性良好，毒性小。本发明所制备水凝胶敷料成分稳定，杀菌快速，方法安全，产量大且稳定，力学性能优异，光热效果明显，抗菌效果持久。本发明所制备水凝胶敷料保水透气效果好，能够很好的贴合皮肤运动且无残留。本发明的方法简单，成本较低，适于大规模制备和商业化生产。
24.实验结果表明：可以通过改变水凝胶中硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的含量来调节本发明所制备的水凝胶敷料的光热效；可以通过改变水凝胶中海藻酸钠、丙烯酰胺、交联剂、引发剂、催化剂用量来调节本发明所制备的水凝胶的孔隙率、溶胀性和保水性等；可以通过改变水凝胶的交联时间来调节水凝胶的交联度、孔隙率、溶胀性、伤口渗出液吸收等。实验结果验证了硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物赋予了水凝胶敷料的广谱光热抗菌活性，海藻酸钠赋予水凝胶敷料的弹性、组织粘附、止血等性能。此外，抑菌实验表明，该水凝胶具有良好的抗菌性能。溶血实验证实其具有良好的体外生物相容性。全血凝血实验证实其具有良好的促凝作用。水蒸气透过率实验证实其具有良好的透气性。伤口渗出液实验证实其具有良好伤口渗出液吸收能力。因此，该系列纳米复合水凝胶敷料在治疗细菌感染皮肤伤口愈合领域有着良好的应用前景。
附图说明
25.图1(a)是制备出的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物溶液图和透射电镜图，比例尺：200nm；图1(b)是水凝胶的溶胀曲线图；图1(c)是水凝胶的保水曲线图；图1(d)是水凝胶的sem图像，比例尺：50μm。
26.图2(a)是水凝胶的水蒸气透过率；图2(b)是光强度为2.0w/cm2时水凝胶的温度变化曲线；图2(c)是水凝胶的溶血曲线图；图2(d)是水凝胶的伤口模拟渗出液吸收率。
27.图3(a)是大肠杆菌的生长曲线图；图3(b)是大肠杆菌的生长曲线图；图3(c)为金黄色葡萄球菌的生长曲线图，图3(d)为金黄色葡萄球菌生长曲线图。
28.图4(a)是nir光照增强的水凝胶对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性；图4(b)是其对大肠杆菌的体外抗菌活性。
具体实施方式
29.下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以
任何方式限制本发明。
30.下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
31.具体实施方式之一：
32.硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物的制备步骤包括：
33.(1a)将白蛋白溶解于纯净水中，室温下充分搅拌使其溶解，其中白蛋白的质量浓度为25.31％～37.25％；
34.(1b)将五水硝酸铋bi(no3)3·
5h2o溶解于硝酸中，室温下充分搅拌使其溶解，其中五水硝酸铋的质量浓度为1.93％～2.84％；
35.(1c)将步骤(1b)所得到的混合溶液缓慢滴加步骤(1a)所得到的混合溶液中，室温下充分搅拌使其均匀；
36.(1d)向步骤(1c)所得到的混合溶液中加入氢氧化钠，室温下调节溶液为碱性ph＝12，得到反应液，其中氢氧化钠的浓度为2mol/l；
37.(1e)将步骤(1d)所得到的反应液在20～37℃持续搅拌反应12～24h，透析后冻干，得到硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物。
38.作为优选，步骤(1a)中，所述白蛋白为牛血清白蛋白；步骤(1b)中所述硝酸的体积为1毫升，硝酸的浓度为90～98％，与五水硝酸铋的质量比为1000～5000％；步骤(1d)中所述碱性为ph为10～14；步骤(1e)中采用去离子水透析12～24小时。
39.一种近红外光响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
40.(1)合成硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物；
41.(2)将硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物均匀分散在水中，以硫化铋纳米粒子计，硫化铋为35～500μg/ml，获得硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液；
42.(3)将硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物溶液与丙烯酰胺、海藻酸盐、交联剂、引发剂、催化剂超声混合均匀，获得预聚液；
43.(4)将预聚液进行成胶，得到近红外响应的抗菌纳米复合水凝胶敷料。
44.作为优选，步骤(2)中，硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物溶液的制备步骤包括：
45.将冻干后的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散在水中，借助超声使其分散均匀；所述的超声条件为80～800w，20～100hz，超声时间为0.5～4小时。
46.作为优选，步骤(3)中，所述丙烯酰胺的用量为硫化铋纳米粒分散液与丙烯酰胺总质量的6％～25％；
47.作为优选，步骤(3)中，所述海藻酸盐为海藻酸钠或海藻酸钾；
48.作为优选，步骤(3)中所述海藻酸盐的用量为硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物溶液与海藻酸盐总质量的1.5％～4％；
49.作为优选，步骤(3)中所述交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺或n-羟甲基丙烯酰胺，所述引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾；
50.作为优选，步骤(3)中所述交联剂的用量为丙烯酰胺质量的0.05％～1.5％；引发剂的用量为丙烯酰胺质量的0.04％～0.22％；
51.作为优选，步骤(3)中所述催化剂为三甲基乙二胺；
52.作为优选，步骤(3)中所述催化剂的用量为丙烯酰胺质量的3.25％～8％；
53.作为优选，步骤(3)中所述的超声条件为80～800w，20～100hz，超声时间为0.5～50小时；
54.作为优选，步骤(4)中所述成胶温度为20～80℃；成胶时间为1～12小时；
55.作为优选，步骤(4)中所述水凝胶在模具中成型，脱模后成胶厚度为1～3毫米。
56.实施例1
57.(1)合成硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物；
58.(1a)将牛血清白蛋白溶解于纯净水中(牛血清白蛋白占溶液质量的3.15％)，室温下充分搅拌10分钟使其溶解；
59.(1b)将五水硝酸铋bi(no3)3·
5h2o(0.024g，阿拉丁)溶解于1毫升浓度为90～98％的硝酸中，与五水硝酸铋的质量比为4000％，室温下充分搅拌10分钟使其溶解；
60.(1c)将步骤(1b)所得到的混合溶液缓慢滴加步骤(1a)所得到的混合溶液中，室温下充分搅拌30分钟使其均匀；
61.(1d)向步骤(1c)所得到的混合溶液中加入氢氧化钠，室温下调节溶液为碱性(ph＝12)，得到反应液，其中氢氧化钠的浓度为2mol/l；
62.(1e)将步骤(1d)所得到的反应液在37℃持续搅拌反应12小时，将上述反应液去离子水透析后12小时后冻干，得到硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物。
63.(2)将硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物均匀分散在水中，使硫化铋浓度为25μg/ml，超声处理20分钟获得均匀分散的硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液；
64.(3)将硫化铋浓度为39.45μg/ml硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液与丙烯酰胺(丙烯酰胺占混合溶液和丙烯酰胺总质量的16.67％)、海藻酸钠(海藻酸钠占混合溶液和海藻酸钠总质量的2.74％)、n,n-亚甲基双丙烯酰胺(n,n-亚甲基双丙烯酰胺相对丙烯酰胺质量的1％)、过硫酸铵(过硫酸铵相对丙烯酰胺质量的0.815％)、四甲基乙二胺(四甲基乙二胺相对丙烯酰胺质量的6.25％)，充分搅拌后超声60分钟混合均匀，获得预聚液；
65.(4)将预聚液倒入长5厘米，宽5厘米，厚度为3毫米的模具中，将倒入预聚液的模具静置12小时，在室温下，反应12小时成胶，脱模得到力学性能良好的具有光热抗菌性能的水凝胶敷料，将其命名为bi2s325 hydrogel。
66.实施例2
67.与实施例1不同的是，将步骤(3)中硫化铋浓度为25μg/ml硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液替换成0μg/ml(即不加入硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物，仅为水凝胶)，制得水凝胶命名为bi2s30 hydrogel。
68.实施例3
69.与实施例1不同的是，将步骤(3)中硫化铋浓度为25μg/ml硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液替换成78.9μg/ml，制得水凝胶命名为bi2s350 hydrogel。
70.实施例4
71.与实施例1不同的是，将步骤(3)中硫化铋浓度为25μg/ml硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液替换成197.29μg/ml，制得水凝胶命名为bi2s3125 hydrogel。
72.实施例5
73.与实施例1不同的是，将步骤(3)中铋离子浓度为25μg/ml硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液替换成394.58μg/ml，制得水凝胶命名为bi2s3250 hydrogel。
74.本发明中拥有粘附、止血、近红外光响应的抗菌水凝胶敷料，性能稳定，其抗菌性能在体内外抗菌测试中均表现良好，机械性能在测试中均表现优异，而且该方法制备的水凝胶显示出良好的生物相容性，下面结合附图及实验数据详细分析：
75.图1(a)硫化铋纳米晶体粒子-蛋白复合物分散液的分散性良好，稳定性良好，放置一段时间以后没有出现分层现象，透射电镜图可以清晰的看出纳米粒子的形貌和粒径大小，约为100纳米。
76.图1(b)水凝胶的溶胀行为测试结果表明随着水凝胶中硫化铋纳米粒含量的增加，水凝胶的溶胀率逐渐减小，表明水凝胶中的孔隙量减少。
77.图1(c)水凝胶的保水行为测试结果表明随着水凝胶中硫化铋纳米粒含量的增加，水凝胶的失水速度越快，随着时间的增加，水凝胶中水的含量逐渐减少。
78.图1(d)显示bi2s30 hydrogel(a)和bi2s3250 hydrogel(b)冻干的水凝胶sem图像，显示具有互连的均匀孔径微结构。
79.图2(a)水凝胶的水蒸气透过率测试结果表明本发明制得的水凝胶敷料的水蒸气透过率均在标准范围内(3～300g/m2/h)，具有良好的透气性,允许气体进行正常交换。
80.图2(b)水凝胶的光热性能测试结果表明本实验制备的不同铋离子浓度的水凝胶在光强为2.0w/cm2的808nm近红外光下照射10分钟的升温情况，铋离子浓度越高，升温越快，最后达到的温度也越高，bi2s3250 hydrogel的温度可以达到56℃。
81.图2(c)本发明制得的水凝胶敷料的体外溶血实验结果，将阳性组(水)的溶血率设定为100％时，所有水凝胶组的溶血率均小于3％，显示了良好的血液相容性。
82.图2(d)水凝胶敷料的伤口模拟渗出液实验结果，表明本发明制得的水凝胶敷料对伤口渗出液有良好的吸收能力。
83.图3(a)、图3(b)和图3(c)、图3(d)为本发明制得的水凝胶敷料体外对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的光热抗菌效果测试，结果显示bi2s3250 hydrogel处理组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的od值均接近于0，实验结果显示了水凝胶良好的体外光热抗菌性能。
84.图4(a)和图4(b)为本发明制得的水凝胶敷料体外对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的光热抗菌效果测试，结果显示10分钟近红外光照射几乎可以100％杀死所有的细菌(p《0.001)。实验结果同样显示了水凝胶良好的体外光热抗菌性能。