一种适用于甘蔗健康种苗简洁高效的培育方法

1.本发明涉及甘蔗种苗的培育方法；尤其是一种适用于甘蔗健康种苗简洁高效的培育方法，其技术领域属于甘蔗健康种苗的繁育。


背景技术：

2.甘蔗线条花叶病毒(sugarcane streak mosaic virus,scsmv)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一，该病毒在全球甘蔗主产区均普遍发生，主要为害甘蔗叶片，导致叶片细胞的叶绿体受损，从而出现叶片失绿、黄绿相间不规则的嵌纹、条斑等症状，尤以新叶最为明显。大部分甘蔗商业品种均一定程度感甘蔗线条花叶病毒，有些品种田间甘蔗线条花叶病发病率几乎为100%。感染scsmv会导致植株矮化，生长缓慢，分蘖率和茎径明显减少，汁液量减少，严重影响甘蔗的产量和品质。当scsmv发生率超过50%时，可导致一般品种的蔗糖产量减少20%左右，有些品种产量损伤则达到60～80%。
3.使用甘蔗脱毒健康种苗可恢复品种的优良种性，是防治种茎携带病害最有效的举措。与常规甘蔗种苗相比，脱毒种苗在整个生长早期表现出生长快、出苗好、拔节早以及病害症状少等明显优势。putra等（2014）将携带scsmv的种茎用52～55℃热水处理，能明显延迟甘蔗花叶病发生时间和减少病害发生严重程度，但不能完全清除植株中scsmv，且随着温汤处理的时间或温度增加甘蔗芽的萌发率明显降低。采用甘蔗茎尖分生组织组培对甘蔗花叶病毒的脱毒效果较好，但是需要非常高的技术水平来取茎尖分生组织。
4.在现在甘蔗scsmv脱毒技术下，需经过单芽茎段收获、温烫处理、沙床或培养箱催芽、取分生组织组培等环节。甘蔗种苗的脱毒效果与温汤处理温度、处理时间、分生组织的大小密切相关。由于高温处理不利于芽的生长，但是甘蔗茎中病毒又需要尽量脱毒彻底，否则后期培养过程中病毒会通过维管束组织在植物体内进行传输，从而增加分生组织组培时的感病风险，因此现有脱毒技术很难在达到彻底脱毒目标下提高组培的成功率。


技术实现要素：

5.本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种适用于甘蔗种苗无甘蔗线条花叶病毒的培育方法。本发明在甘蔗健康种苗繁育中经实践形成，通过设置比常规脱毒温度高一些的温度，同时延长恒温处理时间，然后不经过栽种催芽而直接取芽分生组织组培，在保证高出芽率的要求下培育出了无scsmv的健康种苗。
6.本发明采用如下技术方案实现。
7.一种适用于甘蔗健康种苗简洁高效的培育方法，本发明所述的简洁高效培育方法包括以下步骤：步骤1）材料准备；步骤2）温汤处理；步骤3）芽分生组织培养。
8.本发明所述步骤1）材料准备，包括：甘蔗芽点的确定，a、芽高度大于等于0.6cm，符合；b、芽高度小于0.6cm，砍去甘蔗末梢并用塑料薄膜包扎茎末端，促进蔗芽萌动，直至芽高度大于等于0.6cm。
9.本发明所述步骤2）温汤处理，包括：将蔗芽高度大于等于0.6cm的蔗茎，并砍成
10cm的茎段，用自来水清洗干净，将茎段移置水浴锅中于恒温水浴。
10.本发明所述步骤3）芽分生组织培养，包括：取出茎段并用75%乙醇表面消毒后放到无菌超净工作台上；去除蔗芽使芽顶端分生组织暴露，然后用无菌刀片取出0.3mm的芽顶端分生组织并接种到愈伤组织培养基上。
11.本发明所述步骤3）芽分生组织培养，包括：将含有芽顶端分生组织的培养皿置于恒温培养箱中暗培养，用镊子夹取愈伤组织转接到分化培养基中并在光照条件下分化出小苗。
12.本发明所述的恒温水浴参数为，温度52℃-58℃；时间为1-3小时。
13.本发明所述的恒温水浴参数为，温度52℃；时间为3小时。
14.本发明所述的恒温水浴参数为，温度54℃；时间为3小时。
15.本发明所述的恒温水浴参数为，温度58℃；时间为1小时。
16.本发明所述的恒温培养箱参数为温度25℃，暗培养15天。
17.本发明的有益效果为，1、本发明提高了脱毒苗的存活率。传统方法中茎芽温水处理后需要沙床或培养箱培养催芽，该培养过程中幼芽对土壤、水分、温度等环境因子较敏感，幼苗的存活率低。而本发明则省去了温水处理后沙床或培养箱催芽环节，直接将温汤处理后的材料组培，无菌条件下保障了无毒苗的存活率。
18.2、与传统方法相比，该方法比常规方法所使用的温度较高。同时直接用温汤处理后的蔗芽进行组培，避免了催芽生长过程中少量病毒大量扩增所导致的二次侵染，同时蔗芽由于体积小、与热水接触面大，加上迅速取样，从而有助于提高蔗芽的脱毒效率。
19.3、本发明减少了实验所需的生产成本。传统方法中催芽环节需要耗费人力和物力进行精细管理以确保材料的存活，本发明不仅缩短了健康种苗生产的实验周期，还可以减少甘蔗取样量，节约了人力和物力。
20.4、本发明在组培过程中，并未使用次氯酸钠和升汞等之类的消毒试剂进行消毒，而只是用75%的酒精进行表面消毒，其结果并不会导致组培过程的污染，所以此方法也可用于简单、方便、快速和减少后代变异的甘蔗快繁。
21.下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释和说明。
附图说明
22.图1为本发明芽高度大于等于0.6cm的甘蔗芽点照片图；图2为本发明去除蔗芽使芽顶端分生组织暴露的照片图；图3为本发明用无菌刀片取出0.3mm长度的分生组织的照片图；图4为图3所述分生组织暗培养15天的照片图；图5为对照沙床培养的蔗芽，全部死亡的照片图；图6为本发明步骤方法处理后的蔗苗照片图。
具体实施方式
23.本发明的技术方案是：选取成熟期生长旺盛的甘蔗品种作为实验材料，若蔗芽高度大于等于0.6cm可直接进行后续实验；若蔗芽高度小于0.6cm，则砍去甘蔗末梢促进蔗芽萌动，待萌动芽高度大于等于
0.6cm后准备脱毒。
24.选择蔗芽高度大于等于0.6cm的蔗茎，并砍成约10cm的茎段，用自来水清洗干净，将茎段移置水浴锅中于58℃恒温水浴1小时。
25.取出茎段并用75%乙醇表面消毒后放到无菌超净工作台上。
26.用手掰下蔗芽使芽顶端分生组织暴露，然后用无菌刀片取出芽顶端0.3mm的分生组织并接种到愈伤组织培养基上。
27.同时温水处理后的蔗芽直接通过沙床培育，分析蔗芽存活率和脱毒率作为对照。
28.将含有芽顶端分生组织的培养皿置于25℃恒温培养箱中暗培养15天，用镊子夹取愈伤组织转接到分化培养基中并在光照条件下分化出小苗。
29.待分化小苗长至高4cm左右时取叶片提取rna，进一步通过反转录合成cdna作为pcr模板。
30.用scsmv特异引物进行pcr检测，无目的条带的样品即为无scsmv的健康种苗。
31.实施例：1、材料准备以生长约8个月的拔地拉为材料，根据甘蔗芽点情况，选择是否需要去顶。
32.芽高度大于等于0.6cm时，可直接取甘蔗成熟茎来脱毒，如图1。
33.芽高度低于0.6cm的，可以将甘蔗末梢砍去并用塑料薄膜包扎茎末端，让侧芽萌动到为图1大小便可取材。
34.2、温汤处理：选择表现症状植株，挑选160个优质饱满的蔗芽，流水清洗后，平均分配40个蔗芽分别处理50℃ 3h、52℃ 3h、54℃ 3h、和58℃ 1h。然后每个处理中20个蔗芽直接进行取分生组织培养，20个蔗芽直接沙床培养。
35.3、芽分生组织培养将温汤处理后的实验材料用75%乙醇进行表面消毒，于无菌超净工作台中将芽点直接掰除，暴露出分生组织（图2），用无菌刀片取出0.3mm长度的分生组织（图3）接种到相应培养基上进行暗培养15天（图4），然后进行分化培养。
36.4、脱毒幼苗的scsmv的检测待分化小苗长到高4cm时取叶片提取rna，具体按试剂盒的操作步骤进行检测。
37.5、实验结果分析通过表1结果显示，温水处理后沙床培养的蔗芽，随着温汤处理温度的升高，出芽率逐渐降低，处理条件为54℃ 3h和58℃ 1h时，全部死亡（图5）。另外，在50℃ 3h、52℃ 3h条件下存活下来的苗，通过取分生组织组培分化出苗后，进行分子检测发现并未完全脱除scsmv，其获得脱毒苗的成功率分别为0和5%。
38.直接取蔗芽分生组织培养的出苗情况也随着温度的升高而下降，但并不显著。
39.在50℃ 3h、52℃ 3h条件下，出苗率为100%，但获得脱毒苗的成功率分别为0和75%；而在54℃3h的处理下，出苗率为85%，获得脱毒苗的成功率为90%（实际为1株为阳性，其余全部为阴性）；原因分析：可能是取分生组织时体积过大，导致脱毒不彻底；在58℃ 1h的处理条件下，其出苗率为80%，但获得脱毒苗的成功率为100%（幼苗全
部为阴性），图6。
40.结果说明，利用此技术，可以保证一定的温度下，提高脱毒成功率。
41.表1不同处理条件对出芽率和脱毒率的影响综上，与传统方法相比，本技术除去了蔗芽温汤处理后的沙床或培养箱催芽环节，温汤处理后直接取分生组织组培，这样避免培养过程中蔗茎内未彻底失活的病原菌再次侵染蔗芽，因此只需要保证蔗芽完全脱毒。由于蔗芽体积小且接触面大，从而蔗芽的脱毒也较为彻底，组培脱毒的成功率也明显提高。同时，温汤处理时，选择一定的温度和时间，会不同程度的损伤蔗芽，在沙床或培养箱等非无菌环境中蔗芽抵抗力低下，死亡率较高，但是直接取芽分生组织对组培的影响则不明显，因此存活率高。另外，此技术在取分生组织时，可以轻松的取出分生组织，保证成活率的同时，减少工作难度，提高脱毒效率。综上所述，本发明方法既增强了甘蔗种苗的脱毒效果，还提高了种苗的存活率，对甘蔗健康种苗生产具有重要应用价值。
42.以上所述的仅是本发明的部分具体实施例（由于本发明的配方包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围），方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。