一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.饲料添加剂是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质，在饲料中用量很少但作用显著。饲料添加剂是现代饲料工业必然使用的原料，对强化基础饲料营养价值，提高动物生产性能，保证动物健康，节省饲料成本，改善畜产品品质等方面有明显的效果。
3.畜禽呼吸道病是养殖生产过程中非常常见的一种疾病，该病一年四季发生，尤其以秋冬和来年的春季多发，以养殖猪为例，猪呼吸道综合症(prdc) 已成为危害猪场养殖的主要因素之一，该病主要由胸膜肺炎放线杆菌 (actinobacillus pleuropneumoniae，app)和其他病原等混合感染引起。在兽药市场中，针对畜禽呼吸道病的抗菌药物多种多样，但是对呼吸系统具有较好作用的药物十分有限，比如大环内酯类药物、酰胺醇类药物、四环素类药物、氟喹诺酮类药物、磺胺药的抗菌增效剂、氨基糖苷类药物和林可胺类药物等，但上述药物均不可避免的具有价格高昂、有一定的副作用、使用不方面等问题，进而制约其应用。
4.猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae，app)引起的猪呼吸系统传染病，急性发病时死亡率高、传染性强，给全世界养猪业造成了重大经济损失。该病于冬季和春季多发，不同年龄各性别的猪都可感染，其中以1-3月龄仔猪最为易感，急性型发病率和死亡率均为50％左右。目前的主要治疗措施是应用庆大霉素、大观霉素、氟苯尼考等抗生素治疗。但抗生素治疗效果不佳，并且随着抗生素的滥用，导致细菌耐药性不断增强，甚至出现的超级耐药菌，给人们的生产生活带来安全隐患。
5.中药具有药效持久、毒副作用小、不易使病原产生耐药性和价格低廉等优点，能够解决上述问题，但中草药单独添加至饲料往往作用时间较长、不能满足产业需求；含有各类活性成分的中草药还可能会打破禽畜的体内平衡，最终导致体内各环节特别是神经、内分泌、免疫调度的失调。中草药在饲料中添加既要考虑畜禽在患病时能起到治疗作用，又要考虑到未患病时具有的预防和营养保健作用，目前尚未见到效果显著的中药复方饲料添加剂。
6.表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，egcg)是茶多酚中最有效的活性成分，具有多种保健功能，在饲料添加剂领域报道较少，集中在禽畜产品品质改善方面，例如cn104920868a中egcg应用于制备饲料添加剂，能够降低猪骨骼肌i型肌纤维比例或降低猪骨骼肌中红肉的比例，也即改善猪肉品质。但是现有技术中并未记载如何使其在饲料中实现疾病治疗或预防的功能。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂及其制备方法和应用，用以解决现有技术中表没食子儿茶素没食子酸酯饲料添加剂不能治疗猪呼吸道综合症和猪传染性胸膜肺炎的问题。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：
10.表没食子儿茶素没食子酸酯1～10份、精氨酸50～60份和甘露寡糖40～50 份。
11.优选的，所述表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂在饲料中的添加量为30～40g/kg，所述添加量以表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂的原料重量计算。
12.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：
13.将表没食子儿茶素没食子酸酯、精氨酸和甘露寡糖与溶剂混合，即得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂。
14.优选的，所述溶剂为生理盐水。
15.优选的，所述生理盐水与原料的料液比为1l:50～70g。
16.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂在制备治疗和/或预防猪呼吸道综合症的药物中的应用。
17.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂在制备治疗和/或预防猪传染性胸膜肺炎的药物中的应用。
18.本发明的技术效果和优点：
19.本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂，可减轻 app感染小鼠的临床症状，且并不会对小鼠正常代谢产生副作用，可增加 app感染小鼠的体重，能够在感染早期加快小鼠对app的清除，起效较快、减轻感染小鼠肺脏充血水肿等病理变化、减少小鼠肺泡腔内炎性物质浸润，保持肺泡的完整性。拌于猪饲料中饲喂，可预防感染，减轻呼吸道感染猪临床症状、改善肺脏病理损伤。说明本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂能够用于治疗以及预防猪呼吸道综合症和猪传染性胸膜肺炎，实现良好效果。
附图说明
20.图1为呼吸道感染小鼠临床症状结果；
21.图2为呼吸道感染小鼠体重变化结果；
22.图3为呼吸道感染早期小鼠肺脏菌载量变化结果；
23.图4为呼吸道感染小鼠肺脏眼观病理变化结果；
24.图5为呼吸道感染小鼠肺脏病理损伤变化结果；
25.图6为呼吸道感染仔猪临床症状结果；
26.图7为呼吸道感染仔猪肺脏病理损伤变化结果
①
；
27.图8为呼吸道感染仔猪肺脏病理损伤变化结果
②
。
具体实施方式
28.本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂，由包含如下质量份数的原料制备得到：
29.表没食子儿茶素没食子酸酯1～10份、精氨酸50～60份和甘露寡糖40～50 份。
30.在本发明中，所述原料中包含1～10份的表没食子儿茶素没食子酸酯，所述表没食子儿茶素没食子酸酯的质量份数优选为2～8份，进一步优选为4～6份。所述原料中包含50～60份的精氨酸，所述精氨酸的质量份数优选为 52～58份，进一步优选为53～57份，还优选为54～56份。所述原料中包含40～50 份的甘露寡糖，所述甘露寡糖的质量份数优选为41～48份，进一步优选为 43～47份，还优选为45～46份。在本发明中，所述精氨酸和甘露寡糖能够提高动物机体抗病能力，促进表没食子儿茶素没食子酸酯发挥功效。
31.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂的制备方法，包含如下步骤：
32.将表没食子儿茶素没食子酸酯、精氨酸和甘露寡糖与溶剂混合，即得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂。
33.在本发明中，所述溶剂优选为生理盐水，所述生理盐水与原料的料液比优选为1l:50～70g；所述表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂的状态可以是溶液，也可以是混浊液。
34.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂在制备治疗和/或预防猪呼吸道综合症的药物中的应用；所述猪呼吸道综合症优选为胸膜肺炎放线杆菌和其他病原等混合感染引起的猪呼吸道综合症；在本发明中，所述药物优选的以本发明表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂作为唯一活性成分；所述药物优选的还包括其他饲料辅料，本发明对所述饲料辅料的种类没有特殊限定，采用本领域常规的饲料辅料即可，如氨基酸、维生素、微量元素等等。
35.本发明还提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂在制备治疗和/或预防猪传染性胸膜肺炎的药物中的应用；在本发明中，所述药物优选的以本发明表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂作为唯一活性成分；所述药物优选的还包括其他饲料辅料，本发明对所述饲料辅料的种类没有特殊限定，采用本领域常规的饲料辅料即可，如氨基酸、维生素、微量元素等等。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.实施例1
38.称取1g表没食子儿茶素没食子酸酯、4g精氨酸和1.5g甘露寡糖，用100ml生理盐水溶解，即得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂。
39.实施例2
40.称取8g表没食子儿茶素没食子酸酯、32g精氨酸和12g甘露寡糖，用 800ml生理盐水溶解，即得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂。
41.实施例3
42.称取5g表没食子儿茶素没食子酸酯、20g精氨酸和7.5g甘露寡糖，用 500ml生理盐水溶解，即得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂。
43.实验例1实验小鼠准备与分组情况
44.app菌培养：
45.将app菌种(购自中国兽医药品监察所)室温自然融化后，取30μl菌液加入到3ml bhi液体培养基(含20μg/ml nadh和5％马血清)中，置于37℃摇床中培养6小时。培养结束后用接种环接种细菌于bhi固体培养基中37℃培养24小时。挑取单个菌落，加入bhi液体培养基，测定菌液 od600值，根据细菌标准生长曲线计算细菌数。
46.小鼠攻毒实验
①
47.将20只雌性icr小鼠(购自辽宁长生生物技术股份有限公司)平均分为正常组、app感染组、实验组和对照组；
48.实验组：实施例1所得表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂 app；
49.对照组：(精氨酸4g 甘露寡糖1.5g)溶于100ml生理盐水 app；
50.实验组和对照组小鼠经灌胃给药1.125g/kg，间隔12小时灌胃给药一次，连续给药7天；正常组和感染组小鼠分别灌胃给予相同体积的无菌生理盐水。随后感染组和实验组小鼠经滴鼻感染20μl含3
×
107cfu的app，正常组小鼠滴鼻20μl无菌生理盐水。
51.小鼠攻毒实验
②
52.将20只，体重20g左右，雌雄各半icr小鼠，平均分为正常组、呼吸道感染组、实验组和对照组；
53.实验组：表没食子儿茶素没食子酸酯单体药物溶液灌胃 呼吸道感染；
54.对照组：精氨酸 甘露寡糖药物溶液灌胃 呼吸道感染；
55.实验组和对照组小鼠每日经灌胃给药1.125g/kg，正常组和感染组小鼠分别灌胃给予无菌生理盐水，连续给药7天。随后感染组、对照组实验组小鼠经滴鼻感染20μl含3
×
107cfu的呼吸道病原菌，正常组小鼠滴鼻20μl 无菌生理盐水。
56.实验例2临床症状
57.于app感染小鼠后12、24、48、72小时，观察记录各组小鼠的临床症状，测定临床评分。临床评分指标包括各组小鼠的精神状态、活动性、饮食欲、被毛状态、眼分泌物和粪便性状，并根据其与正常组小鼠的临床表现比较分别给每只小鼠进行评分，最后计算每只小鼠的平均分(0-3分：0分表示指标完全正常，1分表示症状稍严重，2分表示症状较严重，3分表示症状特别严重)；观察app感染后0、6、24、48、72小时各组小鼠的临床症状，如图1所示。
58.结果显示在72小时内，与感染组相比，实验组的小鼠临床评分显著降低，说明表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂可减轻app感染小鼠的临床症状，且与药物单体相比较，本发明的添加剂预防效果更加明显，说明精氨酸和甘露寡糖能够促进表没食子儿茶素没食子酸酯发挥功效。
59.实验例3体重变化
60.于app感染小鼠后0、6、24、48、72小时，分别记录各组小鼠的体重数据，并计算各组小鼠体重变化情况，如图2所示。
61.结果显示在72小时内，与感染组相比，实验组显著改善了app感染引起的小鼠体重丢失，说明表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂并不会对小鼠正常代谢产生副作用，能够增加app感染小鼠的体重，本发明添加剂相较与中药单体可更明显的改善体重丢失情况。
62.实验例4肺脏菌载量变化
63.于呼吸道感染小鼠后6和24小时，小鼠安乐死后无菌采集肺脏并在低温条件下研磨呈匀浆状；用冷无菌pbs稀释后，取100μl均匀涂布在bhi 固体平板上，置于37℃恒温培养箱培养18～24小时，统计菌落数，如图3 所示。
64.结果显示，app感染6小时和24小时后，实验组小鼠肺脏菌载量均显著低于app单独感染组，说明表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂可在感染早期加快小鼠对app的清除，起效较快。
65.实验例5肺脏病理变化
66.于感染后72小时后，小鼠安乐死后取出肺脏，观察小鼠肺脏眼观病理变化，如图4所示；取部分肺组织于固定液中，用于石蜡切片he染色观察肺脏病理损伤，如图5所示。
67.眼观病理变化结果显示，感染组小鼠肺脏充血水肿，呈暗红色，质地较硬。与感染组相比，实验组可减轻感染小鼠肺脏充血水肿等病理变化；
68.肺脏病理切片结果显示，与感染组相比，实验组可减少小鼠肺泡腔内炎性物质浸润，保持肺泡的完整性，且本发明添加剂对于肺脏病理损伤的改善优于药物单体，说明精氨酸和甘露寡糖能够促进表没食子儿茶素没食子酸酯发挥功效。
69.实验例6在仔猪抗病中的应用
70.将实施例1制备所得添加剂均匀拌于猪饲料中，在仔猪饲料中的添加量为30～40g/kg。将35日龄健康断奶仔猪(购自吉林大学原种猪场)分为感染组、试验组和对照组，感染组和对照组仔猪饲喂无抗病中药复方饲料添加剂饲料，试验组仔猪饲喂含有抗病中药饲料添加剂饲料，仔猪自由采食和饮水。
71.在饲喂仔猪14天后，试验组和感染组仔猪鼻腔给予呼吸道病原、对照组鼻腔给予仔猪等体积生理盐水。观察感染后第7天仔猪肺脏病理变化情况。
72.根据仔猪感染后168小时内各个时间点，观察各组仔猪临床症状的表现，包括：活动性、被毛、食欲、精神状态、眼分泌物、鼻腔分泌物、粪便形状、呼吸频率。根据仔猪临床症状进行评分，0分表示指标正常，0-1分表示症状稍严重，1-2分表示症状较严重，2-3分表示症状特严重，最后计算每只仔猪的平均分，并进行了分析。结果显示，与感染组相比较抗病中药复方添加剂可降低仔猪临床评分，如图6所示。
73.在呼吸道感染仔猪7天后，剖检仔猪肺脏，观察肺脏眼观病理变化如图 7所示，取部分肺脏于固定液中进行he染色，观察肺脏病理损伤情况如图 8所示，眼观结果显示感染组仔猪肺脏暗红，肺脏表面有明显严重病变坏死灶，he染色结果显示，与实验组相比较，感染组肺泡腔不完整，肺泡腔内充满炎性渗出物，而实验组能保持肺泡腔完整。
74.由以上实施例可知，本发明提供了一种表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂，可减轻app感染小鼠的临床症状，且并不会对小鼠正常代谢产生副作用，可增加app感染小鼠的体重，能够在感染早期加快小鼠对app 的清除，起效较快、减轻感染小鼠肺脏充血水肿等病理变化、减少小鼠肺泡腔内炎性物质浸润，保持肺泡的完整性，还可以改善呼吸道感染仔猪肺脏病理损伤。说明本发明提供的表没食子儿茶素没食子酸酯复方饲料添加剂能够用于治疗以及预防猪呼吸道综合症和猪传染性胸膜肺炎，实现良好效果。
75.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。