一种光动力抑菌剂及其制备方法和应用

1.本发明属于医学治疗药剂领域，具体地说，涉及一种新型安全高效的含叔胺氮光敏剂化学结合的光动力抑菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.自从1928年青霉素被发现之后，抗生素就一直是治疗细菌感染最好的药物之一，但随着抗生素的滥用，大量的超级细菌，也被称为多重耐药性细菌出现。这类细菌对抗生素有强大的抵抗作用，能逃避被其杀灭。目前引起特别关注的超级细菌主要有：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）、耐多药肺炎链球菌（mdrsp）、万古霉素肠球菌（vre）、多重耐药性结核杆菌（mdr-tb）、多重耐药鲍曼不动杆菌（mrab）以及最新发现的携带有ndm-1基因的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等等。由于他们能够抵抗大多数抗生素，所以非常难以消灭，对人类的健康造成了非常大的威胁。
3.为了对抗超级细菌，人类必须寻找到一种可以高效抗菌的方法。光动力抗菌疗法（antibacterial photodynamic therapy，apdt）是一种利用荧光染料产生单线态氧的抑菌手段。荧光染料，通常称为光敏剂，在可见光的照射下会产生单线态氧，单线态氧可以有效的杀死细菌。在整个治疗过程中，无需造成任何其他伤口，只需要用可见光照射原伤口处即可抑制细菌生长，同时也不会对人体造成伤害，残留的光敏剂也会被光解，不会在人体内积累。如今临床上大多数使用的是亲水性光敏剂，亲水型光敏剂由于其良好的水溶性避免了使用有机试剂，但是因为疏水性细胞膜的高扩散力无法在细菌表面高效积累，从而导致抑菌效果的下降。同时，光敏剂的自聚集也是导致apdt效果不佳的另一个重要因素。光敏剂的单体拥有很强的光活性，但是一旦由于出现浓度过大等问题就会导致光敏剂自聚集形成低聚体，低聚体的光活性非常差。因此，研究开发高积累低聚集的光敏剂且用于光动力治疗在对抗多重耐药菌方面有巨大潜力，同时apdt有望成为继抗生素之后的另一大抗菌武器。


技术实现要素：

4.针对现有技术的上述问题，本发明提出一种光动力抑菌剂及其制备方法和应用，该光动力抑菌剂利用含叔胺氮的光敏剂与卤代长链脂肪烃结合形成阳离子季铵盐两亲性结构，其长链烷基烃插入细胞膜能够破坏整体的平堆面积，阳离子则增加了单体之间的分子斥力，从而能够有效地抑制光敏剂的自聚集，提高具有高荧光量子效率的光敏剂单体的百分含量，进而在提高在细菌表面积累的同时增强光动力抑菌性能。
5.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种光动力抑菌剂，其是由含叔胺氮的光敏剂和卤代长链脂肪烃形成的季铵盐。
6.优选的，所述光敏剂为亚胺类光敏剂、罗丹明类光敏剂、喹啉类光敏剂、吡罗红类光敏剂或吩噻嗪类光敏剂中的一种或多种。
7.优选的，所述亚胺类光敏剂为金胺或甲基紫；所述罗丹明类光敏剂为罗丹明b、丽丝胺罗丹明b或罗丹明101；所述喹啉类光敏剂为噻唑橙、氯喹或5-溴-n,n-二甲基-8-喹啉；
所述吡罗红类光敏剂为派洛宁b或派洛宁y；所述吩噻嗪类光敏剂为亚甲基蓝、蔚蓝a、次甲基绿或亚甲基绿。
8.优选的，所述的卤代长链脂肪烃含有十二个以上碳原子。
9.本发明第二个目的在于提供上述光动力抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：（1）在120~150℃条件下，于乙醇溶剂中，将含叔胺氮的光敏剂和卤代长链脂肪烃反应即得。
10.优选的，所述制备方法还包括如下步骤：（0）将含叔胺氮的光敏剂和卤代长链脂肪烃置于乙醇溶剂中超声溶解完全。
11.优选的，所述制备方法还包括后处理的步骤，所述后处理包括：（2）将得到的反应混合物采用有机溶剂共沉淀，之后去除所述有机溶剂。
12.优选的，步骤（2）中所述有机溶剂为乙醚。更优选的，乙醚和步骤（1）得到的反应混合物的体积比为5:1~10:1。
13.优选的，步骤（2）所述的去除有机溶剂的方法为真空干燥法。
14.优选的，步骤（1）中，所述的卤代长链脂肪烃与所述含叔胺氮的光敏剂的摩尔比为1~3:1。
15.优选的，步骤（1）所述反应的时间为10~12h。
16.优选的，步骤（1）所述反应在高压密闭条件下进行，压力为300~1000kpa。
17.本发明还提供上述光动力抑菌剂在制备光动力灭菌治疗药物中的应用。
18.所述光动力灭菌治疗药物为临床医学领域中使用的光动力灭菌治疗药物。
19.本发明所述的光动力抑菌剂的积累浓度和单体含量与游离光敏剂相比分别提高了20~40%和30~50%。
20.本发明所述的基于含叔胺氮光敏剂的光动力抑菌剂对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的cfu减少量（log10）为4~5。
21.本发明的有益效果在于：由于光敏剂浓度过高容易形成二聚体、三聚体及其他高聚体，而这些聚集体的荧光效率和单线态氧产率被抑制，是低活性态的光敏剂。本发明所制备的光动力抑菌剂通过叔胺氮和卤代长链脂肪烃的卤素原子结合，形成了两亲性季铵型结构，不仅提高了光敏剂在细菌表面的积累，提高了光敏剂的富集浓度，更重要的是，本发明制备的光动力抑菌剂，成功结合的光敏剂的长链烷基链插入细胞膜破坏光敏剂的平面堆积，阳离子增强了光敏剂单体之间的分子斥力，降低了光敏剂在细菌表面的自聚集，从而提高了具有高活性态的光敏剂所占的比例，进而在提高在细菌表面积累的同时增强光动力抑菌性能。
22.因此，本发明所制备的基于含叔胺氮光敏剂的光动力抑菌剂，其长链烷基链不仅可以插入细菌细胞膜加强吸附，而且可以破坏光敏剂的平堆面积，同时阳离子增强了分子间斥力，抑制光敏剂自聚集，提高光动力疗法的效果，细菌的减少量证明了这一点，可应用于制备临床医学领域中光动力灭菌治疗药物中。
附图说明
23.图1是实施例1所制备的十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）的1h nmr图。
24.图2是实施例1所制备的十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）和游离亚甲基蓝(mb)的紫外
吸收图。
25.图3是实施例1所制备的十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）与游离亚甲基蓝对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌荧光显色结果。
26.图4实施例1所制备的十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）与游离亚甲基蓝对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的光动力灭菌平板。
27.图5是实施例1游离亚甲基蓝与十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）两亲光敏剂灭菌柱状图。
28.图6是实施例1游离亚甲基蓝与十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）两亲光敏剂在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌上自聚集情况的柱状图。
29.图7是实施例2所制备的十二烷基-罗丹明b光动力抑菌剂与游离的罗丹明b光敏剂细胞摄取定量结果。
30.图8是实施例2所制备的十二烷基-罗丹明b光动力抑菌剂与游离的罗丹明b光敏剂的灭菌柱状图。
31.图9是实施例3游离噻唑橙与十二烷基-噻唑橙光动力抑菌剂灭菌柱状图。
32.图10是实施例4游离金胺与十二烷基-金胺光动力抑菌剂灭菌柱状图。
33.图11是实施例5游离次甲基绿与十二烷基-次甲基绿光动力抑菌剂灭菌柱状图。
34.图12是实施例6游离派洛宁b与十二烷基-派洛宁b光动力抑菌剂灭菌柱状图。
35.图13是对比例1游离亚甲基蓝与丁烷-甲苯胺蓝光动力抑菌剂灭菌柱状图。
36.图14是对比例2中亚甲基蓝、溴代十二烷、亚甲基蓝与溴代十二烷物理混合的光反应与暗反应灭菌柱状图。
37.图15是对比例3中亚甲基蓝、十二烷基三甲基溴化铵、亚甲基蓝与十二烷基三甲基溴化铵物理混合与十二烷基-亚甲基蓝的光动力灭菌柱状图。
具体实施方式
38.测试方法：（1）细菌培养方法：使用铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌作为研究菌体，培养方法如下。将菌体从-80 ℃里取出，接种1 ml到液体培养基中活化，有氧条件下放入振荡培养箱培养12 h，振荡培养箱温度设置为37 ℃，转速为200 rpm。活化两次，用接种环在固体培养基上划线，放入恒温培养箱，37 ℃培养24 h，收取单菌落，放入4 ℃冰箱保存。抑菌实验时，用接种环将单菌落接种到液体培养基中，放入振荡培养箱，条件同上，培养12 h。铜绿假单胞菌生长12 h后，每毫升菌液的菌落形成单位（cfu）≈108，金黄色葡萄球菌生长12小时，每毫升菌液的cfu≈10
10
。
39.（2）光敏剂细胞摄取实验方法：在所有的实验中，细菌浓度固定在每毫升菌液cfu≈108。分别将菌悬液与待测试剂（如光敏剂）等体积混合，混合后的体积为10 ml，待测试剂与菌液混合后浓度保持在200 μmol/l。室温暗箱孵育30 min，然后使用离心机8000 rpm离心10 min收集菌体，获得的细菌用pbs多次洗涤，使上清颜色洗脱，最终制备10 ml菌悬液。每个样用超声波细胞粉碎机（工作2 s，间隔3 s，功率为300 w）超声10分钟，将裂解的细菌溶液再次离心，得到上清液。用荧
光光谱仪测定不同菌株样品的荧光强度。测定荧光光谱的标准曲线，根据标准曲线计算各种样品的浓度。
40.（3）细菌荧光显色实验方法：将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌接种到培养基黑暗孵育12h和10h备用，使得细菌浓度固定在每毫升菌液cfu≈108，分别将菌悬液与待测试剂等体积混合，混合后的体积为10ml，待测试剂与菌液混合后浓度保持在200μmol/l。室温暗箱孵育30min，然后使用离心机8000rpm离心10min收集菌体，获得的细菌用pbs多次洗涤，使上清颜色洗脱，最终制备10ml菌悬液。取少量滴加到载玻片上，使用荧光显微镜调至红色光板，观察并拍摄菌落的荧光强度。
41.（4）灭菌平板计数实验方法：配制不同浓度的待测试剂溶液，在超净台里用0.22μm的滤菌膜过滤上述溶液。分别取100μl待测试剂溶液与100μl不同梯度的菌液于灭过菌的离心管中，标记。将离心管放入金属浴中混合，金属浴设置温度25℃，100rpm，避光混合30min。将待测试剂与菌液充分混匀后，放入660nm（30mw/cm2）光源下光照30min，各取100μl涂平板，标记，放入恒温培养箱培养24h，记录平板剩余菌落数，比较各个浓度的灭菌效果。每个实验均进行三次。
42.（5）多聚体含量测定实验方法配制相同浓度的光敏剂溶液，分别将待测溶液和菌液等体积混合于离心管中，标记，在25℃和200rpm的条件下混匀30min，保证待测试剂与菌液充分混合。最后记录混合溶液在400~600nm的紫外吸收数据，处理后得到不同光敏剂在不同菌液中的单体与多聚体的占比。
43.实施例1十二烷基-亚甲基蓝光动力抑菌剂的制备称取0.5g（1.6mmol）亚甲基蓝（mb）和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷（dtab）溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-亚甲基蓝光动力抑菌剂（c
12-mb）。其化学结构分析如图1所示。
44.图2是游离亚甲基蓝和十二烷基-亚甲基蓝的紫外吸收对比图，显示出十二烷基-亚甲基蓝和游离亚甲基蓝之间光谱学上的差异，从侧面证明成功制备了十二烷基-亚甲基蓝。
45.光敏剂对细菌的吸附程度用细菌荧光显色方法进行测定。取5ml金黄色葡萄球菌（s.a）和铜绿假单胞菌（p.a）的悬菌液分别和等体积的游离mb、制备得到的c
12-mb混合，在25℃下200rpm的条件下孵育30min使光敏剂和菌体充分混合，后离心去除上清液，菌体用pbs多次洗涤，直至洗涤液澄清，最后用pbs重悬得到10ml悬菌液。在荧光显微镜下观察光敏剂在菌体上的吸附情况，结果如图3所示，可见与c
12-mb混合的菌液在荧光显微镜下可以观察到大量荧光，相反和游离mb混合的菌液无法观察到荧光，证明c
12-mb在细菌上的吸附量更大吸附力更强，即使经过了多次的洗涤离心依旧保留了大量c
12-mb于菌体上。
46.光动力灭菌效果以平板计数法测定。游离mb、制备得到的c
12-mb、pbs缓冲液、抗生
素（头孢克肟和万古霉素）、dtab与相对应稀释程度的菌液充分孵育之后，取100μl混合液均匀涂布在lb琼脂平板，后置于660nm（30mw/cm2）光源下光照30min，对照组无需光照，最后静置于37℃恒温培养箱培养24h，记录菌落数量。平板菌落结果照片如图4所示。灭菌结果柱状图如图5所示。从图上可以看出，在光照的条件下，对于金黄色葡萄球菌(s.a)和铜绿假单胞菌(p.a)c
12-mb都表现出了最强的抑菌效果，平板上无菌落出现，log10（cfu减少量）分别达到了4.8和4.27。
47.图6为游离亚甲基蓝（mb）与十二烷基-亚甲基蓝（c
12-mb）两亲光敏剂在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌上自聚集情况的柱状图。从图上可以看出，游离亚甲基蓝在菌体上主要以低光活性的二聚体形式存在，但是c
12-mb依旧可以保持以单体形式存在，体现了更好的抗自聚集效果，从而得到更强了光动力效果。
48.实施例2十二烷基-罗丹明b光动力抑菌剂的制备称取0.84g（1.76mmol）罗丹明b和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-罗丹明b光动力抑菌剂。光敏剂细胞摄取实验和光动力灭菌实验按上述实验方法进行，用荧光光谱仪进行定量测定，结果如图7、8所示。
49.实施例3十二烷基-噻唑橙光动力抑菌剂的制备称取0.84g（1.76mmol）噻唑橙和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-噻唑橙光动力抑菌剂。灭菌效果测试采用平板计数法进行，灭菌结果如附图9所示。
50.实施例4十二烷基-金胺光动力抑菌剂的制备称取0.534g（1.76mmol）金胺和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-金胺光动力抑菌剂。灭菌效果测试采用平板计数法进行，灭菌结果如附图10所示。
51.实施例5十二烷基-次甲基绿光动力抑菌剂的制备称取0.72g（2mmol）次甲基绿和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-次甲基绿光动力抑菌剂。灭菌效果测试采用平板计数法进行，灭菌结果如附图11所示。
52.实施例6十二烷基-派洛宁b光动力抑菌剂的制备称取0.917g（1.76mmol）派洛宁b和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-派洛宁b光动力抑菌剂。灭菌效果测试采用平板计数法进行，灭菌结果如附图12所示。
53.实施例7十二烷基-甲基紫光动力抑菌剂的制备称取0.6g（1.47mmol）甲基紫和1.1g（4.4mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为120℃，反应时间为10h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:5，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-甲基紫光动力抑菌剂。
54.实施例8十二烷基-氯喹光动力抑菌剂的制备称取0.64g（2mmol）氯喹和0.5g（2mmol）溴代十二烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为130℃，反应时间为11h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:7，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为十二烷基-氯喹光动力抑菌剂。
55.对比例1：丁烷基-亚甲基蓝光动力抑菌剂的制备及灭菌效果称取0.5g（1.6mmol）亚甲基蓝和0.6g（4.4mmol）溴代丁烷溶解在30ml无水乙醇中，超声30min保证溶解完全，然后置于四氟乙烯内胆的高温反应釜中，反应温度为150℃，反应时间为12h。反应结束后，室温下静置反应釜直至冷却。使用乙醚共沉淀产物，反应液与乙醚体积比为1:10，离心去除上清液保留固体，转速设置为8000rpm。将少量未完全除去的有机溶剂于真空干燥箱烘干，温度设置为50℃，所得固体为丁烷基-亚甲基蓝光动力抑菌剂。灭菌效果测试采用平板计数法进行，灭菌结果如附图13所示。
56.对比例2：亚甲基蓝、溴代十二烷、亚甲基蓝与溴代十二烷物理混合的光反应与暗反应灭菌性能对照亚甲基蓝、溴代十二烷、亚甲基蓝与溴代十二烷物理混合的光反应与暗反应灭菌性能进行测定，结果如图14所示。
57.对比例3：亚甲基蓝、十二烷基三甲基溴化铵、亚甲基蓝与十二烷基三甲基溴化铵物理混合光反应灭菌性对照亚甲基蓝、十二烷基三甲基溴化铵、亚甲基蓝与十二烷基三甲基溴化铵物理混合光反应灭菌性能进行测定，结果如图15所示。