用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的制作方法

1.本发明涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，更具体地，涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，其通过形成有纳米孔电极的诊断试剂盒执行电化学分析方法，由此量化血液中极少量的心血管靶物质，从而能够进行体外诊断。


背景技术：

2.最近，对用于诊断特定分子的生物传感器的研究十分活跃，但用于诊断血液中特定分子的生物传感器的技术开发不足。
3.血液中特定分子与其他血液中分子之间的干涉大，非特异性结合多，存在的浓度极低，因此存在难以开发用于诊断血液中特定分子的生物传感器。
4.另一方面，最近由于饮食和生活习惯等的改变，心血管疾病的风险正在迅速增加，但因为用于测量心血管疾病的靶物质在血液中的量极少，因此测量起来有困难。
5.已知存在用于测量由心血管疾病引起的发病程度的心血管诊断标志物，例如肌钙蛋白和c-反应蛋白(c-reactive protein，crp)等，但为了测量所述心血管诊断标志物，必须在医院使用特殊设备对其进行分析。
6.然而，由于心血管疾病患者是潜在的高危人群，需要时刻监测，因此需要快速简单的测量，并且需要开发一种能够快速简单地测量的心血管诊断试剂盒。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本发明旨在解决上述问题，更具体地，涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，其通过形成有纳米孔电极的诊断试剂盒执行电化学分析方法，由此量化血液中极少量的心血管靶物质，从而能够进行体外诊断。
9.技术方案
10.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，其特征在于，包括：电极，其中形成有复数个纳米孔，以容纳所述靶物质；标志物，其固定在所述电极的所述纳米孔上，并且与所述靶物质反应，其中，对所述电极施加电流以进行电化学分析方法，从而确定所述靶物质。
11.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述靶物质是能够确定心血管疾病的心血管靶物质，并且所述标志物可以是与所述心血管靶物质反应的心血管标志物。
12.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述电化学分析方法在将所述心血管靶物质与所述心血管标志物反应之后，将与所述心血管靶物质结合的探针和在与所述探针结合的同时通过引起氧化和还原反应产生电流的电子转移活性物质插入到所述纳米孔中，并且通过对所述电极施加预定电压以读取电流
值的方法，从而能够确定所述心血管靶物质。
13.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述电子转移活性物质可以由二茂铁(ferrocene)、亚甲蓝(methylene blue)和高铁酸盐(ferrate)中的任意一种组成。
14.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的形成有所述纳米孔的电极由8通道电极组成，并且不同的标志物可以固定在每个通道电极上。
15.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述电极由工作电极(working electrode)、对电极(counter electrode)和参比电极(reference electrode)组成，所述工作电极形成为矩形，所述对电极形成为矩形带状，并且设置为从所述工作电极的一侧通过下侧包裹另一侧，并且所述参比电极形成为矩形的同时可以设置于所述工作电极的一侧。
16.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述纳米孔的尺寸可以是50nm至500nm。
17.为了解决上述问题，在本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述纳米孔中，可以将荧光体处理的颗粒插入到其中。
18.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述颗粒的尺寸可以大于所述纳米孔直径的1/2且小于所述纳米孔直径。
19.为了解决上述问题，本发明的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的一个所述颗粒可以在插入到一个纳米孔中的同时以1：1反应。
20.技术效果
21.本发明涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，并且优点在于，通过形成有纳米孔电极的诊断试剂盒执行电化学分析方法，由此量化血液中极少量的心血管靶物质，从而能够进行体外诊断。
22.此外，本发明的优点在于，由于在使用纳米孔电极、探针以及电子转移活性物质的同时执行电化学分析方法，能够快速简单地诊断血液中心血管疾病物质。
23.此外，本发明的优点在于，由于将荧光体处理的颗粒与纳米孔以1：1反应，可以在一个电极上同时实现电化学分析方法和光学方法。
附图说明
24.图1a是示出根据本发明实施例的8通道电极的图，图1b是示出根据本发明实施例的形成有纳米孔结构的电极的图。
25.图2是示出制造根据本发明实施例的形成有纳米孔结构的电极的工艺的图。
26.图3a至图3c是示出通过使用根据本发明实施例的诊断试剂盒来执行电化学分析方法以测量心血管靶物质的图。
27.图4a是示出无标记(label-free)方式的电化学分析方法的图，图4b是示出使用根据本发明实施例的探针和电子转移活性物质的电化学分析方法的图。
28.图5是示出根据本发明实施例的工作电极、对电极和参比电极的图。
29.图6a是示出将荧光体处理的颗粒插入到未形成纳米孔结构的电极中的图，图6b是
示出将荧光体处理的颗粒插入到根据本发明实施例的纳米孔结构中的图。
具体实施方式
30.本说明书阐明了本发明的权利范围，为了使本发明所属领域的普通技术人员能够实施本发明，描述了本发明的原理并公开了实施例。所公开的实施例可以实现为各种形式。
31.可以在本发明的各种实施例中使用的“包括”或“可以包括”等表述是指所公开(disclosure)的该功能、动作或构成要素等的存在，并且不限制添加的一个或多个功能、动作或构成要素等。此外，应当理解，在本发明的各种实施例中，术语“包括”或“具有”是指在说明书中记载的特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或其组合存在，并且不预先排除存在或添加一个或多个另一个特征、数字、步骤、动作、构成要素、部件或其组合的可能性。
32.应当理解，当某个构成要素被提及为“连接于、结合于”另一个构成要素时，所述某个构成要素可以直接连接于或结合于所述另一个构成要素，但在所述某个构成要素和所述另一个构成要素之间可以存在其他新的构成要素。另一方面，应当理解，当某个构成要素“直接连接于”或“直接结合于”另一个构成要素时，所述某个构成要素和所述另一个构成要素之间不存在其他新的构成要素。
33.在本说明书中使用的第一、第二等术语可以用于描述各种构成要素，但构成要素不应受到术语的限制。术语仅用于将一个构成要素与其他构成要素区别。
34.本发明涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，涉及一种用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒，其通过形成有纳米孔电极的诊断试剂盒执行电化学分析方法，由此量化血液中极少量的心血管靶物质，从而能够进行体外诊断。在下文中，将参照附图详细描述本发明的优选实施例。
35.参照图1a和图1b，根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒包括形成有纳米孔的电极120和标志物。根据本发明实施例的诊断试剂盒可以通过纳米孔结构127确定血液中极少量的靶物质，并且对所述电极120施加电流以进行电化学分析方法，从而能够确定血液中的靶物质。
36.参照图1a，根据本发明实施例的诊断试剂盒的形成有所述纳米孔的电极120可以由8通道电极组成，并且不同的标志物可以固定在每个通道电极上。由于不同的标志物固定在每个通道电极上，根据本发明实施例的诊断试剂盒可以同时确定各种靶物质。
37.根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的所述靶物质可以是能够确定心血管疾病的心血管靶物质132，并且所述标志物可以是与所述心血管靶物质132反应的心血管标志物131。在下文中，将主要参照所述心血管靶物质132和所述心血管标志物131详细描述根据本发明实施例的诊断试剂盒。
38.参照图1b，根据本发明实施例的形成有纳米孔的电极120是形成有纳米孔结构127的。所述纳米孔结构127形成有复数个纳米孔，其中，所述复数个纳米孔由具有纳米尺寸的槽组成，并且所述纳米孔的尺寸(直径)可以是50nm至500nm。
39.所述纳米孔结构127可以形成在所述电极120的工作电极141上，并且所述工作电极141可以设置有形成有所述纳米孔结构127的氧化膜。由于在所述工作电极141上设置有形成有所述纳米孔结构127的氧化膜，可以提高分辨率，并且由此能够确定血液中极少量的心血管靶物质132。
40.所述纳米孔结构127是在设置在所述工作电极141上方的氧化膜(sio2)中形成有具有纳米尺寸的复数个槽的结构，可以通过以下方法来制造。
41.参照图2，形成有所述纳米孔结构127的所述工作电极141通过沉积步骤、去除步骤和蚀刻步骤来制造。所述沉积步骤是在金属层121上方形成氧化膜122，并且在所述氧化膜122上方旋涂光刻胶(photores ist，pr)123的步骤。
42.这里，所述金属层121可以由用作所述工作电极141的金(au)组成，并且所述氧化膜可以由sio2组成。此外，可以在所述金属层121下方设置玻璃125，并且可以设置有由钛(ti)组成的牺牲层124，以在所述玻璃125上沉积所述金属层121。然而，用于所述工作电极141的物质不限于此，并且可以根据需要使用其他物质。
43.参照图2，所述去除步骤是通过使用光掩膜来将所述光刻胶(pr)123去除为纳米孔结构形状的步骤。所述去除步骤在通过使用光掩膜来仅留下光刻胶的必要部分的同时进行显影工艺，并且是用于在氧化膜122中形成纳米孔结构127的预处理过程。
44.参照图2，所述蚀刻步骤是通过干法蚀刻来蚀刻氧化膜122以在所述氧化膜122中形成纳米孔结构127的步骤。由于在所述去除步骤中将所述光刻胶(pr)123去除为纳米孔结构，因此当在所述蚀刻步骤中通过干法蚀刻来蚀刻氧化膜时，纳米孔结构127形成在所述氧化膜122中。
45.经过所述蚀刻步骤的所述工作电极141可以经过在去除所述光刻胶(pr)123的同时涂覆所述工作电极141以形成涂层126的涂覆步骤，并且由此可以制造形成有纳米孔结构127的所述工作电极141。
46.根据本发明实施例的诊断试剂盒可以通过纳米孔结构127来确定血液中极少量的靶物质，并且对所述电极120施加电流以进行电化学分析方法，从而能够确定血液中的靶物质。
47.根据本发明实施例的诊断试剂盒可以通过使用电化学分析方法来确定血液中心血管疾病的靶物质，并且可以使用各种电化学分析方法，其中，所述电化学分析方法基于蛋白质聚集反应测量多种抗原-抗体反应，或根据dna和rna互补结合测量电流和阻抗的变化量。
48.图3a、图3b和图3c示出通过电化学分析方法来测量心血管靶物质，根据本发明实施例的诊断试剂盒可以通过循环伏安法(cyclic voltammetry)和方波极谱法(square wave voltammetry，swq)等各种电化学分析方法来确定血液中心血管疾病的靶物质。
49.然而，在根据本发明实施例的诊断试剂盒中使用的电化学分析方法可以使用以下方法，以进行快速简单的诊断。
50.参照图4b，在根据本发明实施例的电化学分析方法中，首先将所述心血管靶物质132与所述心血管标志物131反应。然后，将与所述心血管靶物质132结合的探针133和在与所述探针133结合的同时通过引起氧化和还原反应产生电流的电子转移活性物质134插入到所述纳米孔中。
51.接着，可以通过对所述电极120施加预定电压以读取电流值的方法来确定所述心血管靶物质132。这里，所述心血管靶物质132可以是抗原，并且固定在所述电极120上的所述心血管标志物131可以是与所述抗原反应的抗体。
52.所述探针133可以是能够与所述抗原反应的二抗，并且所述电子转移活性物质134
可以是通过与所述探针133引起氧化和还原反应产生电流的物质。具体地，所述电子转移活性物质134可以是二茂铁(ferrocene)、亚甲蓝(methylene blue)、高铁酸盐(ferrate)等。然而，所述电子转移活性物质134不限于此，并且只要是通过与所述探针133引起氧化和还原反应产生电流的物质，可以是各种物质。
53.如图4a所示的传统电化学分析方法是无标记(label-free)方法，是一种将由抗体组成的标志物131固定在电极120上并插入由抗原组成的靶物质132，然后在施加交流电压的同时测量阻抗的方法。
54.在这种方法中，样品处理方法简单，但存在以下问题，由于必须解析阻抗，通过复杂的解析方法进行分析需要很长时间，并且由于必须施加交流电压，需要昂贵的设备。
55.然而，在根据本发明实施例的电化学分析方法中，由于在使用所述探针133和所述电子转移活性物质134的同时对所述电极120施加预定电压之后读取电流值以确定靶物质，因此具有能够制造成分析时间较短且廉价的便携式设备的优点。
56.根据本发明实施例的诊断试剂盒的所述电极120可以由工作电极(working electrode,we)141、对电极(counter electrode,ce)142和参比电极(reference electrode,re)143组成。
57.参照图5，所述工作电极141可以形成为矩形，所述对电极142形成为矩形带状，并且可以设置为从所述工作电极141的一侧通过下侧包裹另一侧。所述参比电极143形成为矩形的同时可以设置于所述工作电极141的一侧，并且所述参比电极143可以布置于所述对电极142的上侧。
58.这里，所述工作电极141的一侧可以是图5的右侧，并且所述工作电极141的另一侧可以是图5的左侧。此外，所述工作电极141的下侧可以是图5的向下方向，并且所述工作电极141的上侧可以是图5的向上方向。
59.传统电极的问题在于，由于对电极的面积比工作电极小，因此在测量过程中电极被破坏或绝缘层剥落，并且由于对电极仅测量工作电极的右侧和下侧部分，因此发生电流损失。
60.然而，如图5所示，在根据本发明实施例的所述工作电极141、所述对电极142和所述参比电极143中，所述工作电极141为矩形电极的同时所述对电极142从所述工作电极141的一侧通过下侧包裹另一侧。
61.由此，在增大所述对电极142的面积的同时，所述对电极142包裹所述工作电极141的左侧、下侧和右侧，从而能够解决电极被破坏或绝缘层剥落的问题或电流损失的问题。
62.可以将荧光体处理的颗粒150插入到根据本发明实施例的诊断试剂盒的所述纳米孔中。根据本发明实施例的诊断试剂盒可以在一个电极上同时实现电化学分析方法和光学分析方法，并且为此，将荧光体处理的颗粒150插入到所述纳米孔中。
63.参照图6b，优选地，一个所述颗粒150在一个所述纳米孔中反应。即，优选地，所述纳米孔与所述颗粒150以1：1反应。
64.参照图6a，当将荧光体处理的颗粒20插入到传统的未形成纳米孔结构的电极10中时，存在因蛋白质的聚集反应而灵敏度降低的问题。然而，根据本发明实施例的诊断试剂盒的优点在于，在形成所述纳米孔结构127的同时将荧光体处理的所述颗粒150插入，从而在减少蛋白质的聚集反应的同时提高灵敏度。
65.特别地，在根据本发明实施例的诊断试剂盒中，由于一个所述颗粒150插入到一个所述纳米孔中的同时以1：1反应，可以在减少蛋白质的聚集反应的同时提高灵敏度。
66.为了使一个所述颗粒150在插入到一个所述纳米孔中的同时以1：1反应，优选地，所述颗粒150的尺寸大于所述纳米孔直径的1/2且小于所述纳米孔直径。
67.具体地，优选地，所述纳米孔的尺寸(直径)可以是50nm至500nm，并且所述颗粒150的尺寸等于或大于所述纳米孔尺寸的1/2至等于或小于所述纳米孔尺寸。
68.当所述颗粒150的尺寸小于所述纳米孔尺寸的1/2时，由于当两个或更多个所述颗粒150插入到一个所述纳米孔时可能不会以1：1反应，因此优选地，所述颗粒150的尺寸大于所述纳米孔尺寸的1/2。
69.此外，当所述颗粒150的尺寸大于所述纳米孔尺寸时，由于所述颗粒150不能插入到所述纳米孔中，因此优选地，所述颗粒150的尺寸小于所述纳米孔尺寸。如上所述，通过调整所述颗粒150的尺寸，所述纳米孔与所述颗粒150可以以1：1反应。
70.上述根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒具有以下效果。
71.根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的优点在于，通过形成有纳米孔电极的诊断试剂盒执行电化学分析方法，由此量化血液中极少量的心血管靶物质，从而能够进行体外诊断。
72.此外，根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的优点在于，由于在使用形成有纳米孔结构127的电极120、探针133以及电子转移活性物质134的同时执行电化学分析方法，可以快速简单地诊断血液中心血管疾病物质。
73.在根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒中，工作电极141为矩形电极的同时对电极142从工作电极141的一侧通过下侧包裹另一侧。
74.根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的优点在于，由此在增大对电极142的面积的同时，对电极142包裹所述工作电极141的左侧、下侧和右侧，从而能够解决电极被破坏或绝缘层剥落的问题或电流损失的问题。
75.此外，根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的优点在于，由于将荧光体处理的颗粒150与纳米孔以1：1反应，可以在一个电极上同时实现电化学分析方法和光学方法。
76.此外，根据本发明实施例的用于诊断血液中心血管疾病物质的纳米孔诊断试剂盒的优点在于，由于将荧光体处理的颗粒150与纳米孔以1：1反应，可以在减少蛋白质的聚集反应的同时提高灵敏度。
77.如上所述，虽然参考附图中示出的一实施例描述了本发明，该描述仅是示例性的，本领域普通技术人员应当理解，可以实施各种变形和实施例的变形。因此，本发明的真正技术保护范围应取决于附加的权利要求书的技术思想。
78.110...8通道电极
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
120...电极
79.121...金属层
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
122...氧化膜
80.123...光刻胶
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
124...牺牲层
81.125...玻璃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
126...涂层
82.127...纳米孔结构
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
131...标志物
83.132...靶物质
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
133...探针
84.134...电子转移活性物质
ꢀꢀ
141...工作电极
85.142...对电极
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
143...参比电极
86.150...颗粒