提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法与流程

1.本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种提高乌菜的子叶形胚的形成率以及一步成苗率的方法。


背景技术：

2.乌菜(brassica campestris l.ssp.chinensis)是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种，异花授粉作物，杂种优势明显，但优势杂交育种周期长。采用游离小孢子培养，能缩短育种周期、改良育种性状、增加不定遗传的获得，丰富乌菜种质资源。
3.近几十年国内外一些研究者关于十字花科蔬菜游离小孢子培养做了大量工作，致力于优化小孢子成胚和胚状体成苗体系，但目前尚有许多基因型小孢子的胚胎发生率低以及胚状体成苗率低，限制了这一技术在实际育种工作中的应用范围。
4.特异性抗氧化剂能抑制细胞程序性死亡并降低活性氧水平，近年来在诱导培养基中添加抗氧化剂来提高小孢子成胚和胚状体成苗。目前常用的抗氧化剂有抗坏血酸、谷胱甘肽、茶多酚等。
5.茶多酚，又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中所含的一类多羟基类化合物，简称tp，具有较强的抗氧化作用。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法，以解决现有技术存在的问题，该方法能够适用于乌菜的多个基因型，可显著提高乌菜子叶形胚的形成率以及一次成苗率，具有良好的经济价值。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.一种提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法，该方法包括以下步骤：
9.步骤一、于抽薹开花期，挑选处于单核靠边期的乌菜花蕾样本，并获取其纯化小孢子；
10.步骤二、利用nln培养基重悬步骤一所得纯化小孢子；
11.步骤三、将步骤二所得产物置于33℃下热激处理24h后转入25℃下暗培养；待出现肉眼可见的胚状体，统计出胚情况，并向nln培养基中加入0～2.0mg/l茶多酚(tp)，置于25℃摇床上振荡培养5～10天，转移至固体ms培养基中培养，25天后统计其成苗情况。
12.进一步，步骤三中震荡培养转速为50rnp/min。
13.进一步，步骤1具体为：于抽薹开花期，采集乌菜花蕾样本，并置于4℃环境下预冷处理1d，之后选取花蕾样本中处于单核靠边期的放入烧杯中，并依次进行70％酒精消毒30s、0.1％的hgcl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min，接着加入b5培养基，用玻璃棒研磨烧杯内的花蕾样本释放出小孢子；然后，用300目钢丝网筛将烧杯中的小孢子溶液过滤到新的无菌烧杯中，再用40μm细胞网筛二次过滤到离心管，于1000r/min转速下离心处理；最后，用b5培养基重悬离心沉淀，并再次离心，离心转速1000r/min，最终获得
纯化小孢子。
14.进一步，步骤二中nln培养基重悬纯化小孢子后，用细胞计数器调整小孢子的密度为1
×
105～5
×
105个/ml。
15.本发明相比现有技术具有以下优点：
16.(1)本发明提供了一种可以显著提高乌菜的子叶形胚的形成率以及一步成苗率的方法，该方法在乌菜小孢子胚培养过程中，通过添加一定浓度的茶多酚(tp)于nln培养基上，并置于摇床震荡培养5～10天后转移至ms固体培养基上，可以显著地提高乌菜小孢子子叶形胚的形成率以及一次成苗率，加快育种进程，为育种事业做贡献。
17.(2)本发明提供的方法具有操作简单、生产高效等优点，并且茶多酚对环境无毒无害，安全性高。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1
20.本实施例的一种提高乌菜子叶形胚形成率及一步成苗率的方法，包括如下具体步骤：
21.(1)于抽薹开花期，采摘相应的花蕾样本，用于后续小孢子培养。
22.(2)将采摘的花蕾样本置于4℃环境下预冷处理1d。
23.(3)预冷处理后，挑选单核靠边期的花蕾样本，并先后采用70％酒精消毒30s、0.1％的hgcl2摇晃消毒6min，最后再采用无菌水冲洗3次，每次5min；在b5培养基中用玻璃棒研碎花蕾释放出小孢子；然后，依次用300目钢丝网筛和40μm细胞网筛将小孢子溶液过滤到离心管中，于1000r/min转速下离心处理；最后，用b5培养基重悬离心沉淀，并再次离心，离心转速1000r/min，最终获得的沉淀即为目标所需的纯化小孢子。
24.(4)向nln培养基中添加0～2.0mg/l的茶多酚(tp)并重悬、稀释步骤(3)得到的纯化小孢子，用细胞计数器调整其密度为1
×
105～5
×
105个/ml。
25.(5)将步骤(4)的培养物于33℃温度下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养；待出现肉眼可见的胚状体，统计出胚情况，并将其置于25℃摇床上振荡培养(转速50rnp/min)。
26.(6)将步骤(5)的培养物置于摇床震荡培养5～10天后，转移到固体ms培养基中，25天后统计一次成苗率。
27.实施例2
28.本实施例以验证不同浓度茶多酚(tp)对不同基因型乌菜子叶形胚的形成率的影响：
29.方法：选取乌菜基因型为w16、w23、w27、hw、w15、nh进行游离小孢子培养。在游离小孢子过程中，配制好浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0mg/l的茶多酚(tp)，分别加入nln培养基中，15天后统计各基因型的总胚产量和子叶形胚的占比，然后选取各基因型中的子叶形胚进行一次成苗试验，进而研究不同浓度tp对乌菜子叶形胚的形成率及其一步
成苗率的影响。(其他步骤相同，参照实施例1)。
30.实施结果如表1所示：
31.不同浓度tp对乌菜出胚和成苗情况的影响
[0032][0033][0034]
表1
[0035]
从表1可以看出，在添加0～2.0mg/l的茶多酚的nln诱导培养基中，不同基因型乌菜的小孢子出胚率无显著性差异，但子叶形胚的形成率提高了1.14～1.54倍，子叶形胚的成苗率提高了1.10～1.44倍。因而，我们可以推测，茶多酚可能
[0036]
通过促进乌菜游离小孢子子叶形胚的形成，进而提高了一次成苗率。
[0037]
实施例3
[0038]
本实施例选用210个淮南黄心乌菜(nh)的小孢子胚为实验材料，将210份实验材料平均分为7大组，每组30份材料，每组均按照实施例1中提供的培养方法进行培养，培养过程中进行到实施例1步骤(5)中“向培养基中加入茶多酚”的步骤时，每个大组采用的茶多酚浓度不同，具体如下：
[0039]
大组1：不向培养基中加入茶多酚(tp)，作为对照；
[0040]
大组2：向培养基中加入0.25mg/l茶多酚(tp)；
[0041]
大组3：向培养基中加入0.5mg/l茶多酚(tp)；
[0042]
大组4：向培养基中加入0.75mg/l茶多酚(tp)；
[0043]
大组5：向培养基中加入1.0mg/l茶多酚(tp)；
[0044]
大组6：向培养基中加入1.5mg/l茶多酚(tp)；
[0045]
大组7：向培养基中加入2.0mg/l茶多酚(tp)。
[0046]
其次，将每个大组平均分为三个小组，每个小组10份材料，每个小组在进行到实施例1步骤(6)中“将步骤(5)的培养物置于摇床震荡培养5～10天后”时，每个小组采用的震荡培养时常均不同，具体的：
[0047]
小组1：将步骤(5)的培养物置于摇床震荡培养5天；
[0048]
小组2：将步骤(5)的培养物置于摇床震荡培养8天；
[0049]
小组3：将步骤(5)的培养物置于摇床震荡培养10天；
[0050]
每个小组完成实施例1中步骤(6)后，统计各组数据，如表2：
[0051][0052]
[0053]
表2
[0054]
由表2可知，与不添加tp的对照组相比，在nln培养基中添加浓度不同的tp震荡培养5～10天，均能有效提高乌菜小孢子胚的一步成苗率；尤其是在“0.5mg/l tp 8d”的组合下，乌菜小孢子的成苗率高达62.53％。从培养时间来看，同一浓度处理下，培养8天效果较好；不同浓度之间，培养8天均比培养5天和10天的效果更好。
[0055]
实施例4
[0056]
本实施例中以基因型为w16(一步成苗率为80％)、w23(一步成苗率为72％)、w27(一步成苗率为70％)、hw(一步成苗率为62％)、w15(一步成苗率为38.8％)、nh(一步成苗率为35.7％)的乌菜品种按照实施例1提供的培养方法进行培养，每个品种取20份，并分为两组，即组a和组b，每个品种对应的两组均采用实施例1提供的培养方法进行培养；其中：
[0057]
组a：步骤(5)中添加tp的浓度为0mg/l，步骤(6)中振荡培养时长为8d；
[0058]
组b：步骤(5)中添加tp的浓度为0.5mg/l，步骤(6)中振荡培养时长为8d；
[0059]
培养完成后，统计结果如表3；
[0060][0061]
表3
[0062]
从表3可知，对于乌菜不同基因型而言，“0.5mg/l tp 8d”均可显著提高其一步成苗率。
[0063]
综上我们可以得出，茶多酚可能通过促进乌菜游离小孢子子叶形胚的形成进而促进其一步成苗；此外，浓度为0.5mg/l tp与8d摇床振荡培养对于乌菜小孢子一步成苗具有显著的作用，可能是茶多酚增强了小孢子的抗氧化作用，提高了呼吸速率，减少次级代谢物的产生，从而提高了一次成苗率。
[0064]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。