包含GLP-1和/或GLP-1类似物，以及胰岛素和/或胰岛素类似物的组合疗法的制作方法

包含glp-1和/或glp-1类似物，以及胰岛素和/或胰岛素类似物的组合疗法
1.背景
2.glp-1是一种作用于glp-1受体的促胰岛素肽，特别是在胰腺分泌胰岛素的β细胞和大脑神经元上表达。天然形式的glp-1在餐后由肠道l细胞分泌，是胰岛素分泌的强肽刺激剂。glp-1是2型糖尿病的潜在疗法。holst,physiol.rev.87:1409-1439(2007)。glp-1有两种活性形式，具有c端酰胺-nh2的glp-1(7-36)和具有c端游离羧基的glp-1(7-37)。进入循环后，glp-1被二肽基肽酶4(dpp4)迅速降解，导致半衰期短，约为2分钟。kieffer et al.,endocrinology 136:3585-3596(1995)。除了对控制血糖的作用外，还发现glp-1及其类似物对诱导体重减轻，减缓胃排空，和增加饱腹感有作用。monami et al.,exp.diabetes res.2012:672658(2012)。fda于2014年12月批准了saxenda(利拉鲁肽3mg)，这是glp-1类似物的第一个nda申请，是一种针对具有至少一种与超重相关的疾病或病症(例如2型糖尿病)的肥胖成年人的长期体重管理，辅以低热量饮食和增加的体力活动。进一步提高glp-1类似物的功效的努力一直在继续。本文提供了进一步改善glp-1类似物的治疗效果的组合疗法。
发明概要
3.在一个方面，提供了一种治疗与受试者的血糖升高相关的病症的方法。该方法需要向受试者施用第一有效量的一种或多种选自glp-1和glp-1类似物的第一活性成分和第二有效量的一种或多种选自胰岛素和胰岛素类似物的第二活性成分。在一些实施例中，受试者患有例如1型和2型糖尿病的糖尿病，或具有升高的患血糖升高和/或如1型和2型糖尿病的糖尿病的风险。在一些实施例中，glp-1类似物选自glp-1(7-37)，glp-1(7-36)，和glp-1(7-35)。在一些实施例中，glp-1类似物是glp-1(7-36)(例如，贝那鲁肽)。在一些实施例中，胰岛素类似物选自速效胰岛素(例如，赖脯胰岛素，门冬胰岛素，谷赖胰岛素)和长效胰岛素(例如，甘精胰岛素，德谷胰岛素，和地特胰岛素)。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物的第二有效量(u)和glp-1和/或glp-1类似物的第一有效量(mg)可以按以下比例施用：约10:1至约800:1，约30:1至约500:1，约50:1至约250:1，约70:1至约220:1，或约100:1至约200:1，例如，约10:1，约20:1，约30:1，约40:1，约50:1，约60:1，约60:1，约70:1，约80:1，约90:1，约100:1，约150:1，约200:1，约250:1，约300:1，约350:1，约400:1，约450:1，约500:1，约550:1，约600:1，约650:1，约700:1，约750:1，或约800:1。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)：约0.00070mg/kg至约0.0197mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0178mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0159mg/kg体重，约0.00072mg/kg mg/kg至约0.014mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.0121mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.01115mg/kg体重，约0.00073mg/kg至约0.0102mg/kg体重，约0.00076mg/kg至约0.00925mg/kg体重，约0.00080mg/kg至约0.0083mg/kg体重，约0.00089mg/kg至约0.00792mg/kg体重，约0.00108mg/kg至约0.00735mg/kg体重，约0.00127mg/kg至约0.00678mg/kg体重，约0.00165mg/kg至约0.0064mg/kg体重，约0.00184mg/kg至约0.00602mg/kg体重，约
0.00203mg/kg至约0.00564mg/kg体重，约0.00222mg/kg至约0.00545mg/kg体重，约0.0026mg/kg至约0.00583mg/kg体重，约0.00279mg/kg至约0.00564mg/kg体重，或约0.00298mg/kg至约0.00526mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)例如贝那鲁肽)可以按以下范围施用：约0.001mg/kg至约10.0mg/kg体重，约0.003mg/kg至约9.0mg/kg体重，约0.005mg/kg至约8.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约7.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约6.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约5.5mg/kg体重，约0.015mg/kg至约5.0mg/kg体重，约0.03mg/kg至约4.5mg/kg体重，约0.05mg/kg至约4.0mg/kg体重，约0.1mg/kg至约3.8mg/kg体重，约0.2mg/kg至约3.5mg/kg体重，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg体重，约0.5mg/kg至约3.0mg/kg体重，约0.6mg/kg至约2.8mg/kg体重，约0.7mg/kg至约2.6mg/kg体重，约0.8mg/kg至约2.5mg/kg体重，约1.0mg/kg至约2.7mg/kg体重，约1.1mg/kg至约2.6mg/kg体重，或约1.2mg/kg至约2.4mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下的每日剂量施用：约0.01mg/d至约1mg/d，约0.06mg/d至0.6mg/d，或约0.12mg/d至约0.4mg/d。
4.在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)可以每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次施用。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)可以按约2u/d至约100u/d，约6u/d至约60u/d，约12u/d至约40u/d，约20u/d至约30u/d，或约15u/d的范围施用给受试者(例如，人)。
5.在一些实施例中，第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)和/或第二有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次施用。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)可以在施用胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)之前，期间，或之后施用。
6.在另一个方面，提供了一种组合疗法，包含第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)和有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)。联合疗法用于治疗与受试者的血糖升高相关的病症。在一些实施例中，受试者患有诸如1型和2型糖尿病的糖尿病，或具有升高的患血糖升高和/或如1型和2型糖尿病的糖尿病的风险。在一些实施例中，glp-1类似物选自glp-1(7-37)，glp-1(7-36)，和glp-1(7-35)。在一些实施例中，glp-1类似物是glp-1(7-36)(例如，贝那鲁肽)。在一些实施例中，胰岛素类似物选自速效胰岛素(例如，赖脯胰岛素，门冬胰岛素，谷赖胰岛素)和长效胰岛素(例如，甘精胰岛素，德谷胰岛素，和地特胰岛素)。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物的第二有效量(u)和glp-1和/或glp-1类似物的第一有效量(mg)可以按以下比例施用：约10:1至约800:1，约30:1至约500:1，约50:1至约250:1，约70:1至约220:1，或约100:1至约200:1，例如，约10:1，约20:1，约30:1，约40:1，约50:1，约60:1，约60:1，约70:1，约80:1，约90:1，约100:1，约150:1，约200:1，约250:1，约300:1，约350:1，约400:1，约450:1，约500:1，约550:1，约600:1，约650:1，约700:1，约750:1或约800:1。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)约0.00070mg/kg至约0.0197mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0178mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0159mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.014mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.0121mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.01115mg/kg体重，约0.00073mg/kg至约
0.0102mg/kg体重，约0.00076mg/kg至约0.00925mg/kg体重，约0.00080mg/kg至约0.0083mg/kg体重，约0.00089mg/kg至约0.00792mg/kg体重，约0.00108mg/kg至约0.00735mg/kg体重，约0.00127mg/kg至约0.00678mg/kg体重，约0.00165mg/kg至约0.0064mg/kg体重，约0.00184mg/kg至约0.00602mg/kg体重，约0.00203mg/kg至约0.00564mg/kg体重，约0.00222mg/kg至约0.00545mg/kg体重，约0.0026mg/kg至约0.00583mg/kg体重，约0.00279mg/kg至约0.00564mg/kg体重，或约0.00298mg/kg至约0.00526mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下范围施用：约0.001mg/kg至约10.0mg/kg体重，约0.003mg/kg至约9.0mg/kg体重，约0.005mg/kg至约8.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约7.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约6.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约5.5mg/kg体重，约0.015mg/kg至约5.0mg/kg体重，约0.03mg/kg至约4.5mg/kg体重，约0.05mg/kg至约4.0mg/kg体重，约0.1mg/kg至约3.8mg/kg体重，约0.2mg/kg至约3.5mg/kg体重，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg体重，约0.5mg/kg至约3.0mg/kg体重，约0.6mg/kg至约2.8mg/kg体重，约0.7mg/kg至约2.6mg/kg体重，约0.8mg/kg至约2.5mg/kg体重，约1.0mg/kg至约2.7mg/kg体重，约1.1mg/kg至约2.6mg/kg体重，或约1.2mg/kg至约2.4mg/kg体重。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)约2u/d至约100u/d，约6u/d至约60u/d，约12u/d至约40u/d，约20u/d至约30u/d，或约15u/d。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)可以按约0.01mg/d至约1mg/d，约0.06mg/d至0.6mg/d，或约0.12mg/d至约0.4mg/d的每日剂量施用。
7.在一些实施例中，第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和第二有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)配制成单一组合物。在一些实施例中，第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和第二有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)配制成两种分开的组合物，并在治疗期间联合。
8.在另一个方面，提供了一种试剂盒，包含第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和第二有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)。该试剂盒用于治疗与受试者的血糖升高相关的病症。在一些实施例中，受试者患有如1型和2型糖尿病的糖尿病，或具有升高的患血糖升高和/或如1型和2型糖尿病的糖尿病的风险。在一些实施例中，1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)配制成单一组合物。在一些实施例中，1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)配制成两种分开的组合物。在一些实施例中，该试剂盒还包括使用该试剂盒的说明书。
9.附图的简要说明
10.图1显示了在0.2mg/kg至2mg/kg的不同剂量的贝那鲁肽(bei)与60u/kg的甘精胰岛素(igla)的组合下，受测db/db小鼠(n＝5)在贝那鲁肽注射后4小时的时间段的血糖水平。
11.图2显示了在0.1mg/kg至1.2mg/kg的不同剂量的贝那鲁肽(bei)与60u/kg的甘精胰岛素(igla)的联合下，受测db/db小鼠(n＝5)在贝那鲁肽注射后4小时的时间段的血糖水
平。
12.图3显示了单次注射贝那鲁肽(bei)，甘精胰岛素(igla)，或bei和igla的联合后受测stz诱导的糖尿病小鼠(n＝6)的血糖水平。bei的剂量分别为0.1mg/kg和2.4mg/kg，igla的剂量分别为5u/kg和10u/kg。联合组的剂量分别为0.05mg/kg bei和5u/kg igla，以及0.1mg/kg bei和10u/kg igla。
13.图4显示了单次注射贝那鲁肽(bei)，甘精胰岛素(igla)，或bei和igla的联合后受测stz诱导的糖尿病小鼠(n＝6)的血糖水平的曲线下面积(auc)。bei的剂量分别为0.1mg/kg和2.4mg/kg，igla的剂量分别为5u/kg和10u/kg。联合组的剂量分别为0.05mg/kg bei和5u/kg igla，以及0.1mg/kg bei和10u/kg igla。
14.图5显示了单次注射贝那鲁肽(bei)，甘精胰岛素(igla)，或bei和igla的联合后每组(ag)的个体小鼠的血糖水平。bei的剂量分别为0.1mg/kg和2.4mg/kg，igla的剂量分别为5u/kg和10u/kg。联合组的剂量分别为0.05mg/kg bei和5u/kg igla，以及0.1mg/kg bei和10u/kg igla。
15.图6显示了多次注射贝那鲁肽(bei，0.1mg/kg)，甘精胰岛素(igla，5u/kg)，或bei和igla的联合(分别为0.05mg/kg bei和5u/kg igla)持续4周后受测stz诱导的糖尿病小鼠(n＝6)的体重变化。每组每天对小鼠进行两次治疗，共28天。通过与第1天的初始体重比较来计算体重变化。
16.图7显示了与第1天的初始体重相比第28天的体重变化。小鼠每天接受两次治疗，共28天。剂量分别为0.1mg/kg贝那鲁肽(bei)，5u/kg甘精胰岛素(igla)，联合组为0.05mg/kg bei和5u/kg igla。
17.图8显示了第28天在禁食6小时后受测stz诱导的糖尿病小鼠(n＝6)的禁食血糖。
18.图9显示了受测stz诱导的糖尿病小鼠(n＝6)在第28天的口服葡萄糖耐量试验(ogtt)的血糖水平。禁食约6小时的小鼠口服葡萄糖溶液(1g/kg)。在指定的时间点测量血糖。
19.图10显示了ogtt期间120分钟的血糖水平的曲线下面积(auc)。
20.详细说明
21.将血糖水平控制在最佳范围是糖尿病治疗的一个重要目标。显著高于(高血糖)或低于(低血糖)最佳范围的血糖水平可能是有问题和危险的。糖尿病患者，尤其是接受胰岛素治疗的患者，有发生低血糖的风险。如本文公开的实例1所示，用贝那鲁肽和甘精胰岛素联合疗法的各种实施例治疗的受试者均未发生低血糖症。此外，实例1显示在用恒定剂量甘精胰岛素(60u/kg)治疗的受试者中，贝那鲁肽剂量依赖性协同改善血糖控制，参见图1，贝那鲁肽以0.2mg/kg，0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg/kg，和2mg/kg施用；和图2，贝那鲁肽以0.1mg/kg，0.24mg/kg，0.3mg/kg，0.6mg/kg，和1.2mg/kg施用。实例2表明，与单独施用甘精胰岛素相比，贝那鲁肽和甘精胰岛素联合疗法在血糖控制方面的功效更稳定，更持久，更快速(图3和4)；尽管单独施用甘精胰岛素引起的体重增加显著高于贝那鲁肽和甘精胰岛素的联合疗法(图6和7)；与载体组相比，贝那鲁肽和甘精胰岛素的联合疗法显著降低了空腹血糖(图8)；与单独使用贝那鲁肽和单独使用甘精胰岛素相比，贝那鲁肽和甘精胰岛素联合疗法在降低血糖水平方面具有协同作用(图9和10)。预期1)本文公开的glp-1和/或glp-1类似物和2)胰岛素和/或胰岛素类似物的联合疗法可以在需要血液控制的受试者(例如糖尿病
受试者)中实现想要的治疗效果。
22.本文公开了一种联合疗法，包含第一有效量的一种或多种选自glp-1和glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)的第一活性成分和第二有效量的一种或多种选自胰岛素和胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)的第二活性成分，其中一种或多种第一活性成分和一种或多种第二活性成分可以不同剂量和/或比例联合。联合疗法可用于治疗与升高的血糖水平相关的各种病症，例如糖尿病，包括1型和2型糖尿病。与1)glp-1和/或glp-1类似物或2)胰岛素和/或胰岛素类似物的单一疗法相比，联合疗法改善了治疗效果。例如，如本文公开的实例1中所提供的，与单独用甘精胰岛素或贝那鲁肽治疗的受试者相比，贝那鲁肽和甘精胰岛素的联合疗法的一个实施例改善了受试者的血糖控制。
23.在本公开的上下文中，短语“治疗有效量”或“有效量”的药物组合物包含本文使用的1)glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽))和/或2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)，是在受试者中产生想要的治疗效果(例如治疗糖尿病)的药物组合物的量。在某些实施例中，治疗有效量是产生最大治疗效果的药物组合物的量。在其他实施例中，治疗有效量产生小于最大治疗效果的治疗效果。例如，治疗有效量可以是产生治疗效果同时避免与产生最大治疗效果的剂量相关的一种或多种副作用的量。在一些实施例中，治疗有效量是产生治疗效果的最小量。特定组合物的治疗有效量将基于多种因素而变化，包括但不限于治疗组合物的特征(例如，活性，药代动力学，药效学，和生物利用度)，受试者的生理状况(例如，年龄，体重，性别，疾病类型和阶段，病史，总体身体状况，对给定剂量的反应性，和其他现有药物)，组合物中任何药学上可接受的载体，赋形剂，和防腐剂的性质，以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对药物组合物施用的反应并相应地调整剂量。如需其他指导，请参见例如remington:the science and practice of pharmacy,22nd edition,pharmaceutical press,london,2012，和goodman&gilman’s the pharmacological basis of therapeutics,12th edition,mcgraw-hill,new york,ny,2011，其全部公开内容通过引用并入本文。
24.如本文所用的关于病症的术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指部分或完全缓解病症，降低病症发生或复发的可能性，减缓病症的进展或发展，或消除，减少，或减缓与病症相关的一种或多种症状的发展。
25.如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物受试者，优选人类。在某些实施例中，受试者患有如1型和2型糖尿病的糖尿病，或具有升高的患血糖升高和/或如1型和2型糖尿病的糖尿病的风险。短语“受试者”和“患者”在本文中可以互换使用。
26.联合疗法及其用途
27.在某些实施例中，本文公开的组合物包含1)glp-1和/或glp-1类似物和2)胰岛素和/或胰岛素类似物之一或这两者。
28.在一些实施例中，glp-1类似物选自glp-1(7-37)，glp-1(7-36)，和glp-1(7-35)。除非另有说明，glp-1和glp-1类似物可以具有c-末端游离羧基或c-末端酰胺基团。例如，glp-1类似物可以是重组人glp-1(7-36)肽，其序列为：his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg(seq id no:1)，其可称为本公开中的贝那鲁肽。贝那鲁肽的分子式为c149h225n39o46
，分子量为3,298.7。贝那鲁肽与循环glp-1的活性形式基本相同，差别在于内源性酰胺化，其中天然形式的nh2在重组肽中被oh基团取代。贝那鲁肽包含一个c末端游离羧基。在其他实施例中，glp-1(7-35)或glp-1(7-37)可用于所公开的技术中。具有c末端游离羧基的glp-1(7-35)和具有c末端游离羧基的glp-1(7-37)的序列如下：his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly(seq id no:2)，和his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg-gly(seq id no:3)。
29.在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)：约0.00070mg/kg至约0.0197mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0178mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0159mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.014mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.0121mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.01115mg/kg体重，约0.00073mg/kg至约0.0102mg/kg体重，约0.00076mg/kg至约0.00925mg/kg体重，约0.00080mg/kg至约0.0083mg/kg体重，约0.00089mg/kg至约0.00792mg/kg体重，约0.00108mg/kg至约0.00735mg/kg体重，约0.00127mg/kg至约0.00678mg/kg体重，约0.00165mg/kg至约0.0064mg/kg体重，约0.00184mg/kg至约0.00602mg/kg体重，约0.00203mg/kg至约0.00564mg/kg体重，约0.00222mg/kg至约0.00545mg/kg体重，约0.0026mg/kg至约0.00583mg/kg体重，约0.00279mg/kg至约0.00564mg/kg体重，或约0.00298mg/kg至约0.00526mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下比例施用：约0.001mg/kg至约10.0mg/kg体重，约0.003mg/kg至约9.0mg/kg体重，约0.005mg/kg至约8.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约7.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约6.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约5.5mg/kg体重，约0.015mg/kg至约5.0mg/kg体重，约0.03mg/kg至约4.5mg/kg体重，约0.05mg/kg至约4.0mg/kg体重，约0.1mg/kg至约3.8mg/kg体重，约0.2mg/kg至约3.5mg/kg体重，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg体重，约0.5mg/kg至约3.0mg/kg体重，约0.6mg/kg至约2.8mg/kg体重，约0.7mg/kg至约2.6mg/kg体重，约0.8mg/kg至约2.5mg/kg体重，约1.0mg/kg至约2.7mg/kg体重，约1.1mg/kg至约2.6mg/kg体重，或约1.2mg/kg至约2.4mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按约0.01mg/d至约1mg/d，约0.06mg/d至0.6mg/d，或约0.12mg/d至约0.4mg/d的每日剂量施用。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次施用。
30.在一些实施例中，胰岛素类似物选自速效胰岛素(例如赖脯胰岛素，门冬胰岛素，谷赖胰岛素)和长效胰岛素(例如甘精胰岛素，德谷胰岛素，和地特胰岛素)。
31.在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物的第二有效量(u)和glp-1和/或glp-1类似物的第一有效量(mg)按以下比例施用：约10:1至约800:1，约30:1至约500:1，约50:1至约250:1，约70:1至约220:1，或约100:1至约200:1，例如，约10:1，约20:1，约30:1，约40:1，约50:1，约60:1，约60:1，约70:1，约80:1，约90:1，约100:1，约150:1，约200:1，约250:1，约300:1，约350:1，约400:1，约450:1，约500:1，约550:1，约600:1，约650:1，约700:1，约750:1，或约800:1。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那
鲁肽)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)约0.00070mg/kg至约0.0197mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0178mg/kg体重，约0.00071mg/kg至约0.0159mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.014mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.0121mg/kg体重，约0.00072mg/kg至约0.01115mg/kg体重，约0.00073mg/kg至约0.0102mg/kg体重，约0.00076mg/kg至约0.00925mg/kg体重，约0.00080mg/kg至约0.0083mg/kg体重，约0.00089mg/kg至约0.00792mg/kg体重，约0.00108mg/kg至约0.00735mg/kg体重，约0.00127mg/kg至约0.00678mg/kg体重，约0.00165mg/kg至约0.0064mg/kg体重，约0.00184mg/kg至约0.00602mg/kg体重，约0.00203mg/kg至约0.00564mg/kg体重，约0.00222mg/kg至约0.00545mg/kg体重，约0.0026mg/kg至约0.00583mg/kg体重，约0.00279mg/kg至约0.00564mg/kg体重，或约0.00298mg/kg至约0.00526mg/kg体重。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按以下范围施用：约0.001mg/kg至约10.0mg/kg体重，约0.003mg/kg至约9.0mg/kg体重，约0.005mg/kg至约8.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约7.0mg/kg体重，约0.01mg/kg至约6.0mg/kg体重、约0.01mg/kg至约5.5mg/kg体重、约0.015mg/kg至约5.0mg/kg体重、约0.03mg/kg至约4.5mg/kg体重体重，约0.05mg/kg至约4.0mg/kg体重，约0.1mg/kg至约3.8mg/kg体重，约0.2mg/kg至约3.5mg/kg体重，约0.3mg/kg至约3.2mg/kg体重，约0.5mg/kg至约3.0mg/kg体重，约0.6mg/kg至约2.8mg/kg体重，约0.7mg/kg至约2.6mg/kg体重，约0.8mg/kg至约2.5mg/kg体重，约1.0mg/kg至约2.7mg/kg体重，约1.1mg/kg至约2.6mg/kg体重，或约1.2mg/kg至约2.4mg/kg体重。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)可以按以下范围施用于受试者(例如，人)：约2u/d至约100u/d，约6u/d至约60u/d，约12u/d至约40u/d，约20u/d至约30u/d，或约15u/d。在一些实施例中，第一有效量的glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和/或第二有效量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)可以每天一次，每天两次，每天三次，或每天四次给药。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以在施用胰岛素和/或胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)之前，期间，或之后施用。在某些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以在施用胰岛素和/或胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)之前或之后约5分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟，或约15分钟施用。在一些实施例中，glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)可以按约0.01mg/d至约1mg/d，约0.06mg/d至0.6mg/d，或约0.12mg/d至约0.4mg/d的每日剂量施用。
32.在一些实施例中，本文公开的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如甘精胰岛素)的治疗有效量的范围可以是约2u/d至约100u/d，约6u/d至约60u/d，约12u/d至约40u/d，约20u/d至约30u/d，或约15u/d。在一些实施例中，胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素，u)和glp-1和/或glp-1类似物(例如，贝那鲁肽，mg)按以下比例联合：10:1至800:1，例如30:1，50:1，100:1，200:1，250:1，300:1，或600:1。
33.除了1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)的任一者或这两者之外)，本文公开的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，和/或缓冲剂(例如，组氨酸-盐酸(histidine-hcl)，柠檬酸钠-柠檬酸，磷酸氢二钠-柠檬酸，naoh-柠檬酸，乙酸钠-乙酸(naac-hac)，琥珀酸盐或酯-琥珀酸，乳酸盐或酯-乳酸，谷氨酸盐或酯-谷氨酸，苹果酸盐或酯-苹果酸，苯甲
酸盐或酯-苯甲酸，酒石酸盐或酯-酒石酸，或甘氨酸盐或酯-盐酸(gly-hcl)或其任何组合)盐以维持组合物的所需ph范围。药物组合物的其他成分可以包括一种或多种防腐剂(例如苯酚，苯甲醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸乙酯，对羟基苯甲酸丙酯，对羟基苯甲酸丁酯，氯丁醇，2-苯氧基乙醇，2-苯乙基醇，苯扎氯(溴)铵、硫柳汞，或其任意组合)，等渗剂(多元醇，氯化钠，糖，或其任意组合；其中，多元醇为甘露醇，山梨醇，肌醇，木糖醇，甘油，丙二醇，或其任意组合；并且糖是蔗糖，海藻糖，乳糖，果糖，葡萄糖，或其任何组合)，和溶解促进剂(例如，tween 20，tween 40，tween 80，span 20，span 40，span 80，poloxamer 188，pluronic f68，brij 35，dextran-20，peg 400，peg 1000，peg 1500，peg 2000，丙二醇，或其任何组合)。
34.将药物组合物配制成适合特定的施用途径。例如，药物组合物可以皮下或静脉内注射，或通过输注或口服施用。在一些实施例中，1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)被配制成单一组合物用于同时施用。在一些实施方案中，1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)被配制成两种分开的组合物，使得不同剂量或比例的1)glp-1和/或glp-1类似物和2)胰岛素和/或胰岛素类似物可以联用来同时或依次施用。例如，可以在施用胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)之前，期间，或之后施用glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)。在另一个实例中，1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)可以每天一次，每天两次，每天3次，或每天4次以多种组合递送。例如，一剂胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)之后可以是一剂或多剂glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)，反之亦然。当施用多剂量的胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)，或glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)时，不必每次对受试者施用相同的剂量。可以施用以下的第一剂：1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和/或2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)，然后将随后的剂量调高或调低，甚至跳过1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)和2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)的任一者或这两者，这取决于患者血糖水平对第一剂的响应。
35.还公开了一种试剂盒，包含1)glp-1和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽)，2)胰岛素和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素)，和任选的3)使用说明书。glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽))和胰岛素(和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素))可以包含在单个组合物中或包含在两个分开的组合物中。当glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，如贝那鲁肽))和胰岛素(和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素))以两种分开的组合物的方式提供，它们可以同时施用或以各种组合依次施用。例如，说明书将提供glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽))和胰岛素(和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素))将首先以何种剂量施用，每天施用多少剂，以及如果需要的一剂胰岛素(和/或胰岛素类似物(例如，甘精胰岛素))之后应追加的一剂或多剂glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽))，反之亦然，这样用户可以根据初始血糖水平和响应初始施用的血糖水平来选择递送剂量的最佳组合。为此目的，glp-1(和/或glp-1类似物(例如，glp-1(7-36)，例如贝那鲁肽))和胰岛素(和/或胰岛素类
似物(例如，甘精胰岛素))可以按小剂量提供，使得使用者可以将两个或多个各自组合以实现增加的，想要的施用剂量。
36.提供以下实例以更好地说明要求保护的发明和本文所述的实施例，而不应解释为限制本发明的范围。就提及的具体材料而言，其仅是为了说明的目的，并不旨在限制本发明。对本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明范围的情况下可以进行各种等效，改变，和修改，并且应当理解，这些等效实施例将被包括在本文中。此外，在本公开中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文，就如同在本文中完全阐述一样。
37.实例1：甘精胰岛素和贝那鲁肽对db/db小鼠血糖的作用
38.本实例显示了甘精胰岛素(igla)和贝那鲁肽(bei)在不同剂量和比例下对糖尿病db/db小鼠血糖的作用。
39.材料
40.动物：雄性db/db小鼠(n＝42，lot no.:db20190926)购自江苏集萃药康生物科技有限公司(gempharmatech co.,ltd.)。到达后，将小鼠安置在复旦大学动物设施中，恒定温度(20-24℃)和湿度(40-70％)。安置提供12:12小时的明暗循环。
41.有效成分：甘精胰岛素获自赛诺菲(sanofi)，储存温度为2-8℃。序列为his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg(seq id no:1)的贝那鲁肽获自仁会(benemae)(贝那鲁肽注射液，2mg/ml)，并储存于2-8℃。
42.在研究前，动物在动物设施中适应环境1周。将小鼠(n＝5)根据研究前一天在进食条件下的血糖水平和体重随机分入不同的组。每组小鼠在第一次给药前禁食2小时。禁食两小时后，在时间点-15分钟，通过血糖仪(onetouch)测量每只小鼠的血糖水平并记录，然后将阴性对照或一剂甘精胰岛素(igla)皮下注射到每只小鼠的第一部位。第一次注射后15分钟，在时间点0，再次测量并记录每只小鼠的血糖水平，然后立即在每只小鼠的不同部位第二次皮下注射阴性对照或一剂贝那鲁肽(bei)。在第二次注射后的不同时间间隔，分别在15分钟，30分钟，60分钟，120分钟，180分钟，和240分钟测量每只小鼠的血糖水平。
43.如下表1和表2所示，使用多个剂量的贝那鲁肽进行了两项研究。
[0044][0045]
备注：a.igla的赋形剂溶液用作载体对照；b.贝那鲁肽的赋形剂溶液用作载体对照。
[0046][0047][0048]
备注：a.igla的赋形剂溶液用作载体对照；b.贝那鲁肽的赋形剂溶液用作载体对照。
[0049]
图1和图2分别示出了研究1和研究2在注射贝那鲁肽后4小时后的时间段内小鼠的血糖水平。用更高剂量的胰岛素和/或胰岛素类似物治疗的受试者更有可能发生低血糖症，这可能是有问题的和危险的。在研究中观察到的受试者中没有观察到低血糖。对于接受甘
精胰岛素单一疗法(图1和2，空心方形，igia_60u/kg)或贝那鲁肽-甘精胰岛素联合疗法治疗的所有受试者的甘精胰岛素剂量相同(60u/kg)。联合疗法在降低受治疗的受试者的血糖水平方面显示出协同作用。例如，与仅接受甘精胰岛素治疗(图2，空心方形，igla_60u/kg)或仅贝那鲁肽(图2，实心三角形，bei_0.3mpk)的受试者相比，贝那鲁肽剂量低至0.1mg/kg(图2，空心倒三角形，bei_0.1mpk)的联合疗法降低血糖水平的速度更快。另见贝那鲁肽剂量为0.24mg/kg(图2，实心菱形，bei_0.24mpk)，贝那鲁肽剂量为0.3mg/kg(图2，空心圆圈，bei_0.3mpk)，贝那鲁肽剂量为0.6mg/kg(图2，实心方形，bei_0.6mpk)，贝那鲁肽剂量为1.2mg/kg(图2，空心三角形，bei_1.2mpk)的联合疗法结果。类似地，与仅接受甘精胰岛素(图1，空心方形，igla_60u/kg)或仅贝那鲁肽(图1，实心三角形，bei_2mpk)治疗的受试者相比，贝那鲁肽剂量低至0.2mg/kg(图1，空心倒三角形，bei_0.2mpk)的联合疗法降低血糖水平的速度更快。另见贝那鲁肽剂量为0.3mg/kg(图1，实心菱形，bei_0.3mpk)，贝那鲁肽剂量为0.6mg/kg(图1，空心圆圈，bei_0.6mpk)，贝那鲁肽剂量为1.2mg/kg(图1，实心方形，bei_1.2mpk)，贝那鲁肽剂量为2mg/kg(图1，空心三角形，bei_2mpk)的联合疗法结果。
[0050]
用贝那鲁肽单一疗法治疗的受试者的血糖水平在2mg/kg的贝那鲁肽治疗(图1，实心三角形，bei_2mpk)4小时后或更快恢复到与阴性对照组(图1，实心圆圈，载体)相同的水平。用贝那鲁肽单一疗法治疗的受试者的血糖水平在0.3mg/kg的贝那鲁肽治疗(图2，空心正方形，bei_0.3mpk)后1.5小时或更快恢复至与阴性对照组(图2，实心圆圈，载体)相同的水平。然而，接受贝那鲁肽和甘精胰岛素的几种联合疗法治疗的受试者的血糖水平低于单独接受甘精胰岛素治疗的受试者。参见，例如，与仅用甘精胰岛素治疗的受试者(图1，空心方形，igla_60u/kg)相比的贝那鲁肽剂量为0.6mg/kg(图1，空心圆圈，bei_0.6mpk)，贝那鲁肽剂量为1.2mg/kg(图1，实心方形，bei_1.2mpk)，贝那鲁肽剂量为2mg/kg(图1，空心三角形，bei_2mpk)的联合疗法；与仅使用甘精胰岛素治疗(图2，空心方形，igia_60u/kg)的受试者相比的贝那鲁肽剂量为0.6mg/kg(图2，实心方形，bei_0.6mpk)和贝那鲁肽剂量为1.2mg/kg(图2，空心三角形，bei_1.2mpk)的联合疗法。
[0051]
因此，与仅贝那鲁肽或甘精胰岛素治疗的受试者相比，贝那鲁肽和甘精胰岛素的各种联合疗法治疗的受试者显示出协同改善的血糖控制。
[0052]
实施例2：甘精胰岛素和贝那鲁肽对链脲菌素(stz)诱导的糖尿病c57bl/6小鼠血糖的效果
[0053]
本实例显示了甘精胰岛素(igla)和贝那鲁肽(bei)的联合对stz诱导的糖尿病c57bl/6小鼠在固定比例下的血糖的效果。
[0054]
动物：雄性c57bl/6小鼠(n＝70)购自上海吉辉实验动物护理有限公司(shanghai jihui laboratory animal care co.,ltd.)。到达后，将小鼠安置在上海健康医学院动物设施中，恒定温度(20-24℃)和湿度(40-70％)。以12:12小时的明暗周期提供安置。
[0055]
有效成分：甘精胰岛素购自赛诺菲，储存温度为2-8℃。序列为his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-lys-gly-arg(seq id no:1)的贝那鲁肽获自仁会(贝那鲁肽注射液，2mg/ml)，并存储于2-8℃。
[0056]
适应环境一周后，在stz之前，给小鼠喂食含有60kcal％脂肪的高脂肪饮食(d12492，research diets)3周。通过连续5天多次低剂量stz注射(50mg/kg，腹膜内；i.p.)
诱导糖尿病模型。建模期间，小鼠每天在stz治疗前禁食4小时。使用前在0.1m柠檬酸钠缓冲液(ph 4.5)中新制备stz溶液(5mg/ml)，并在制备后10分钟内注射。7天后，选择非空腹血糖在16.7mm和27.7mm之间的小鼠，按血糖水平和体重随机分入不同组。在第1天的上午9点(t＝0分钟)，给小鼠皮下施用载体，甘精胰岛素，贝那鲁肽，或甘精胰岛素和贝那鲁肽的混合物，在即将注射前混合(表3)。第一次注射后，分别在注射后的不同时间间隔，15分钟，30分钟，60分钟，120分钟，180分钟，和240分钟测量尾部血糖水平。随后，四组(no.1，no.2，no.4，no.6)小鼠继续接受多次给药，持续4周。每周测量体重两次。第28天，测完血糖后，小鼠从早上9点开始禁食6小时，然后进行口服葡萄糖耐量试验(葡萄糖溶液：1g/kg，10ml/kg)。在葡萄糖加载后0分钟(葡萄糖加载前)，15分钟，30分钟，60分钟，和120分钟监测血糖。
[0057][0058]
单次给药后的血糖：单次施用后，贝那鲁肽(bei)和甘精胰岛素(iglar)显著降低了stz诱导的高血糖小鼠的血糖。根据血糖曲线下面积(auc)，在bei_2.4mg/kg，iglar_5u/kg，iglar_10u/kg，和两个联合组中观察到血糖显著降低。尽管iglar与其联合组之间未观察到显著差异，但在某些时间点与单独iglar相比，联合组的方差系数(cv)更小。在30分钟时，iglar_5u/kg组的cv值为0.2573，iglar_5u/kg和bei_0.05mg/kg联合组的cv值为0.1475。在120分钟时，iglar_5u/kg组的cv值为0.4151，iglar_5u/kg和bei_0.05mg/kg联合组的cv值为0.3102。iglar_10u/kg组的cv值在30分钟时为0.5517，在60分钟时为0.4240，而iglar_10u/kg和bei_0.1mg/kg联合组的cv值在30分钟时为0.1023，在60分钟时为0.1319。iglar_5u/kg组以及iglar_5u/kg和bei_0.05mg/kg联合组在60分钟时的最低血糖分别为6.07
±
0.43mm和5.67
±
0.47mm。对于iglar_10u/kg组和iglar_10u/kg和bei_0.1mg/kg联合组，120分钟时的最低血糖分别为5.50
±
2.74mm和3.75
±
1.37mm。在180分钟时，iglar_10u/kg组的最低血糖为9.95
±
5.22mm，iglar_10u/kg和bei_0.1mg/kg联合组的最低血糖为7.50
±
9.04mm。总体而言，与单独施用iglar相比，联合组在血糖控制方面的功效更稳定，持久和快速。结果如图3-5所示并总结在下表4中。
[0059]
[0060]
[0061][0062]
多次给药后的血糖水平和体重变化：如图6和7所示，在4周的治疗期间，单独使用iglar在第28天诱导体重增加2.4
±
0.4g，而载体组为1.4
±
0.3g。相比之下，贝那鲁肽在第28天减少了1.0
±
0.3g的体重。对于联合组，第28天的体重增加为1.3
±
0.3g，显著低于iglar_5u/kg组的体重增加。结果总结在下表5中。
[0063]
[0064]
[0065][0066]
第28天，禁食6小时后测量空腹血糖。数据显示，与载体组20.5
±
1.50mm相比，iglar_5u/kg和联合组分别显著降低空腹血糖为14.0
±
2.43mm和11.7
±
0.92mm。结果显示在下图8和表6。
[0067][0068]
null表示动物死亡。
[0069]
在第28天的口服葡萄糖耐量试验(ogtt)期间，基于auc，所有测试组(包括单独的贝那鲁肽，单独的甘精胰岛素，和联合组)均显著降低了血糖。此外，与单独的贝那鲁肽和单独的甘精胰岛素相比，联合组在降低血糖水平方面具有协同作用。结果显示在下图9和10以及表7。
[0070]
[0071]