用于在微流控装置中通过免疫测定来测量总蛋白含量和检测蛋白的方法1.相关申请的交叉引用2.本技术要求在2020年4月15日提交的美国临时专利申请号63/010,436以及各自在2020年7月17日提交的美国非临时专利申请号16/932,441和16/932,445的优先权和权益。前述专利申请各自的整个公开内容特此通过引用整体并入。
技术领域：
：3.本文描述的实施方案一般涉及用于对样品进行免疫测定和/或蛋白量测定的毛细管电泳方法。公开了汽提试剂，其可操作以除去与免疫测定相关的抗体，从而可以对同一样品进行额外的测定。
背景技术：
：：4.蛋白研究的一个重要部分包括表征异质样品中的蛋白，诸如可以包括数千种蛋白的细胞裂解物。蛋白质印迹是一种常用的基于免疫测定的方法，其用于分析这些复杂样品中的特定蛋白，其使用抗体的特异性来识别感兴趣的蛋白。当以蛋白质印迹形式进行免疫测定时，定量得到的免疫测定信号变得越来越重要。一种用于定量方法是将免疫测定信号归一化为样品中的总蛋白含量。在发布蛋白质印迹结果时，期刊越来越多地要求这样做以确保数据准确度和精确度。5.现有系统可操作以提供全自动的基于微流体的(例如，基于毛细管的)免疫测定，诸如simple仪器。一些这样的系统能够在毛细管中将免疫测定与类似于传统的基于凝胶的蛋白质印迹的尺寸分离相组合。可以自动加载样品、分离基质、堆叠基质、抗体和试剂。所述仪器可操作以将分离基质和堆叠基质先后抽吸入每个毛细管中。接下来，可以加载可包含异质蛋白混合物的样品，并且可以使毛细管与运行缓冲液接触。可以施加电压以使得能够通过分子量或其它合适的特征进行分离。一旦分离完成，紫外线可以将蛋白固定化至毛细管壁。例如，可以用固定化的蛋白和从毛细管中清除的基质进行蛋白的免疫探测。此外，一些现有系统可操作以提供“总蛋白”测定，所述测定可以通过固定化至毛细管内表面的蛋白的生物素化进行，随后检测辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗生蛋白链菌素和化学发光反应。6.但是，需要一种方法，所述方法允许在同一毛细管或其它微流控装置中进行免疫测定和总蛋白读出的化学发光检测。另外，合乎需要的是，增加超过检测模式/通道数目的复用能力。技术实现要素：7.本文描述的某些实施方案涉及可操作以在单个样品运行中组合免疫测定和总蛋白技术的系统和方法。具有化学发光和荧光检测能力的仪器，诸如的可以提供一种“蛋白归一化”方法，通过这种方法，荧光染料通过例如nhs-酯胺偶联共价连接到所有分离的和固定化的蛋白分子上。以这种方式，可以测量特定靶标，例如，使用与免疫测定相关的化学发光，同时从荧光信号确定加载的总蛋白的测量。用于蛋白归一化的已知技术通常具有与典型的蛋白质印迹式免疫测定类似的动态范围，并且不能在使用化学发光检测进行免疫测定的同一毛细管中进行复用。相反，本文所述的蛋白归一化的实施方案可以与化学发光免疫测定在同一毛细管中复用，并且可以具有与免疫测定信号相比减小的或不同的动态范围。8.除了在同一毛细管或其它微流控装置中进行总蛋白和免疫测定外，本文描述的某些实施方案允许在同一毛细血管中进行多个相继免疫测定。具有化学发光和荧光检测能力的仪器(例如，)允许“复用”检测，即，使用与用于化学发光或荧光检测的部分缀合的抗体的单个混合物检测毛细管内的多种靶标。但是，在单个混合物中组合抗体限制了哪些抗体可以混合，例如，由于用于免疫测定的抗体的交叉反应性所产生的非特异性信号或当在同一毛细管中使用时抗体的不相容动态范围(例如，化学发光相对于荧光的不同动态范围)。9.本文所述的实施方案涉及总蛋白测定和/或第二免疫测定在与蛋白质印迹式免疫测定相同的毛细管中的应用，使得能够进行高灵敏度总蛋白测量和免疫测定，并结合先前用简单的蛋白质印迹技术证明的低样品需求和高通量能力。附图说明10.图1a-1h解释了根据一个实施方案在汽提和免疫测定重探测方法中发生的事件。11.图2a-2h解释了根据一个实施方案在汽提和总蛋白重探测方法中发生的事件。12.图3解释了对于三种不同靶标汽提效率与ph的关系。13.图4解释了汽提效率与较宽ph范围的关系，表明在ph》4.5时汽提效率的显著降低。14.图5a和5b解释了说明在引入汽提试剂之后探测分析物的再现性的实验数据。具体实施方式15.本文描述的某些实施方案涉及适合于对通过毛细管或其它合适的微流控装置中进行的电泳分离的样品进行多个免疫测定的方法。可以分离样品，使得至少第一分析物和第二分析物被分离到不同的带中。第一分析物和第二分析物可以固定化在毛细管中。可以将构造成选择性地结合第一分析物(且任选地，不结合第二分析物)的第一初级抗体引入毛细管中。可以将构造成选择性地结合第一初级抗体的第一次级抗体引入毛细管中。可以基于与第一次级抗体相关的光学特征来检测第一分析物。例如，第一次级抗体可以缀合至辣根过氧化物酶(hrp)，并且可以基于与hrp相关的化学发光反应来检测第一分析物。可以将构造成从第一分析物除去第一初级抗体的汽提试剂引入毛细管中。在引入汽提试剂并且除去第一初级抗体(连同第一次级抗体和/或hrp)之后，第一分析物和第二分析物可以保持固定化在毛细管中。然后可以引入构造成结合第二分析物的第二初级抗体，例如，在引入汽提试剂之后。可以引入构造成结合第二初级抗体的第二次级抗体，并且可以基于与第二次级抗体相关的光学特征(例如，化学发光反应和/或荧光标签)来检测第二分析物。16.本文描述的某些实施方案涉及适合于对通过毛细管或其它合适的微流控装置中进行的电泳分离的样品进行免疫测定和总蛋白测定的方法。来自样品的分析物可以在毛细管中分离并固定化。可以将具有被构造成非特异性地结合蛋白(诸如生物素)的反应性部分的分子引入毛细管中。类似地讲，并且例如，可以将蛋白生物素化。可以将构造成结合至少一个分析物子集的初级抗体引入毛细管中。可以引入被构造成结合初级抗体的次级抗体。可以基于与次级抗体相关的光学特征来检测分析物的子集。可以引入被构造成从分析物子集中除去初级抗体的汽提试剂。在引入汽提试剂并除去初级抗体(连同次级抗体)之后，固定化的分析物可以保留在毛细管中。可以将构造成结合分子的光学可检测试剂引入毛细管中。在分子为生物素的实施例中，可以引入抗生蛋白链菌素。抗生蛋白链菌素可以缀合至hrp或以其它方式使其光学上可检测到。基于与光学可检测试剂相关的光学信号，可以检测毛细管中的所有生物素化的分析物(例如，所有蛋白)。基于与光学可检测试剂相关的光学信号(例如，总蛋白信号)，可以归一化与次级抗体相关的光学特征(例如，免疫测定信号)。在某些实施方案中，重要的是，按照描述它们的顺序执行该段的事件。17.通过消除非研究对象的样品之间的某些不受控差异的影响，归一化免疫测定信号(或其它合适的信号)会提高仪器和/或分析员准确地对比来自不同样品的测量量的能力。对于免疫测定，归一化至每个样品中的总蛋白含量可以消除由于样品组成(例如细胞计数、裂解物稀释)或吸量误差引起的变异性的影响。此外，由于持家蛋白的表达水平可以受实验处理影响或者其免疫测定信号可能不在与靶蛋白相同的线性动态范围内，因此归一化至总蛋白含量有利于归一化至特定持家蛋白(例如β肌动蛋白或β微管蛋白)。在一个实施方案中，如下执行归一化：将通过毛细管中的免疫测定确定的特定蛋白的量除以毛细管中的总蛋白与参考毛细管中总蛋白的比率。18.本文描述的某些实施方案涉及汽提试剂的制剂。汽提试剂可以包括缓冲液、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)和去污剂。汽提试剂可以具有低于5的ph。19.本文描述的某些实施方案涉及用于使用汽提试剂的方法，所述汽提试剂包括tecp且具有在3.0至4.5之间的ph。汽提试剂可以用于从分析物中除去与免疫测定相关的第一初级抗体。分析物可以在毛细管中电泳分离并固定化。可以将与免疫测定相关的第一初级抗体和第一次级抗体引入毛细管中。在使用汽提试剂从毛细管中除去第一初级抗体之后，可以将抗生蛋白链菌素或构造成结合生物素化的蛋白的另一合适试剂和/或构造成结合样品中的分析物的第二初级抗体引入毛细管中。20.汽提和重探测方法21.汽提和重探测可以允许用户在同一毛细管(或其它微流控装置)和同一运行中分析相同的固定化蛋白，从而节省时间、金钱和宝贵的样品。22.图1a-1h解释了根据一个实施方案在汽提和重探测方法中发生的事件。汽提和重探测可以用于按顺序对单个样品执行两种或更多种免疫测定(例如，重复使用分离的和固定化的样品和/或无需为每个免疫测定(重新)加载和/或(重新)分离额外的样品)。图1a是已分离并固定化至毛细管110的表面的样品的示意图。可以将分析物共价地结合至毛细管110的表面，例如，使用美国专利号7,846,676和/或美国专利申请公开号2008/0017512中所示和描述的装置和/或方法，其各自的整个公开内容特此通过引用整体并入。如显示的，样品已被分离到两个带112和114中。每个带代表独特的分析物物种，并存在于毛细管110的独特部分中。应当理解，样品可以含有任意数目的分析物物种和/或被分离成任意数目的带。23.本文中使用的术语“分析物”表示要通过电泳技术分离和/或用本文提供的方法、设备和系统检测的任何分子或化合物。合适的分析物包括、但不限于小化学分子，诸如、例如环境分子、临床分子、化学物质、污染物质和/或生物分子。更具体地，这样的化学分子可以包括、但不限于杀虫剂、杀昆虫剂、毒素、治疗和/或滥用药物、抗生素、有机材料、激素、抗体、抗体片段、抗体-分子缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、抗原、细胞膜抗原、蛋白(例如，酶、免疫球蛋白和/或糖蛋白)、核酸(例如，dna和/或rna)、脂质、凝集素、碳水化合物、全细胞(例如，原核细胞诸如病原性细菌和/或真核细胞诸如哺乳动物肿瘤细胞)、病毒、孢子、多糖、糖蛋白、代谢物、辅因子、核苷酸、多核苷酸(包含核糖核酸和/或脱氧核糖核酸)、过渡态类似物、抑制剂、受体、受体配体(例如，神经受体或其配体、激素受体或其配体、营养物受体或其配体和/或细胞表面受体或其配体)、受体-配体复合物、营养物、电解质、生长因子和其它生物分子和/或非生物分子、以及它们的片段和组合。在某些实施方案中，所述分析物是蛋白或蛋白复合物，并且所述样品是细胞的裂解物或纯化的蛋白。其它合适的分析物可以包括胶体和/或乳剂的聚集体、附聚物、絮状物和/或分散相微滴或颗粒。一旦分离，分析物的“带”在本文中被称作“分析物物种”。24.本文中使用的术语“样品”表示含有待检测的一种或多种分析物的组合物。在某些实施方案中，样品是异质的，即含有多种组分(例如，不同的蛋白)，或同质的，即含有一种组分(例如，一种蛋白的群体)。在某些情况下，样品可以是天然存在的、生物材料和/或人造材料。此外，样品可以处于天然(例如，细胞悬浮液)或变性形式(例如，裂解物)。在某些情况下，样品可以是单个细胞(或单个细胞的内容物，例如，作为来自单个细胞的细胞裂解物，或纯化的蛋白)或多个细胞(或多个细胞的内容物，例如，作为来自多个细胞的细胞裂解物，或来自多个细胞的纯化的蛋白)、血液样品、组织样品、皮肤样品、尿样品、水样品和/或土壤样品。在某些情况下，样品可以来自活生物体，诸如真核生物、原核生物、哺乳动物、人、酵母和/或细菌，或者样品可以来自病毒。25.通过任何合适的迁移率参数，诸如电荷、分子量、电泳迁移率(例如，受分子量、特征长度、面积或体积、寡核苷酸长度或其它合适特征影响)、等电点等，可以分离样品。例如，在某些实施方案中，基于迁移率参数诸如分子量等，在包含分离基质的毛细管中对样品进行电泳分离。毛细管可以包括分离基质，其可以以自动方式添加。在某些实施方案中，分离基质是等电分离基质，并且具有与常规电泳实验中使用的聚合物凝胶类似或基本相同的性质，诸如ph梯度。分离基质中的毛细管电泳类似于聚合物凝胶(诸如聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶)中的分离，其中通过提供分子可以在其中移动的多孔通道，基于样品中分子的迁移率参数而分离分子。26.如在图1b中所示，可以将第一初级抗体120引入毛细管110中，例如，在分析物的分离和固定化之后。在某些情况下，在开始分析之后，仪器可操作以自动分离、固定化和/或引入第一初级抗体120，而无需任何进一步的用户干预。第一初级抗体120可以被构造成选择性地结合毛细管120内的一种或更多种分析物物种。也就是说，在某些情况下，第一初级抗体120可以被构造成结合样品/毛细管120内的某些目标分析物，而不结合其它(例如，非目标)分析物。在某些情况下，可以在洗涤步骤中除去未结合的第一初级抗体，例如，在温育时段以后。27.可以将第一次级抗体122引入毛细管110中，如在图1c中所示。第一次级抗体122可以被构造成结合第一初级抗体120。在某些情况下，可以在洗涤步骤中除去未结合的第一次级抗体122，例如，在温育时段以后。如在图1c和1d中所示，在引入毛细管110中之前，给次级抗体122缀合hrp。如在图1d中所示，将化学发光底物124，诸如3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(tab)、3,3'-二氨基联苯胺(dab)、鲁米诺、过氧化物或任何其它合适的产色和/或(增强)化学发光底物引入毛细管中。缀合至次级抗体122的hrp可以催化化学发光底物124，从而产生光学信号。28.基于与第一次级抗体122相关的光学特征，可以检测用第一初级抗体120标记的第一分析物112/分析物物种。例如，与缀合至第一次级抗体122的hrp相关的化学发光反应可以通过ccd照相机或另一种合适的检测器检测和/或记录在一幅图像或随时间拍摄的一系列图像中。在检测用第一初级抗体120标记的分析物/分析物物种之后，可以将汽提试剂引入毛细管110中，如在图1e中所示。汽提试剂可操作以除去第一初级抗体120、第一次级抗体122和/或光学可检测试剂124，同时保留固定化的样品用于另一轮免疫测定。29.图1f-1h然后用第二初级抗体130、第二次级抗体(用hrp标记)132和随后的第二检测步骤重复上述步骤。第二初级抗体130被构造成选择性地结合第二分析物114，并且第二次级抗体132被构造成结合第二初级抗体130。通常，第二初级抗体130被构造成选择性地结合与第一初级抗体120不同的分析物，但在某些情况下，第二初级抗体130可以与第一初级抗体120相同，例如，以评估测定的可重复性、稳定性或特征。第二次级抗体132可以是与第一次级抗体122相同的抗体，或者可以是不同的次级抗体。任选地，可以在汽提试剂已经除去第一初级抗体110之后引入第二初级抗体130和/或第二次级抗体132，其可以允许对单个样品进行相继和不同的免疫测定。例如，第一次级抗体和第二次级抗体都可以被hrp标记，并被构造成在有化学发光底物存在下产生光学上不可区分的信号。通过在检测第一分析物112之后和在引入第二次级抗体132之前汽提第一初级抗体120和第一次级抗体122，可以使用相同的光学可检测试剂检测不同的分析物。30.尽管图1a-1h描绘了选择性地结合不同的(分离的)分析物物种的第一初级抗体120和第二初级抗体130，在其它实施方案中，第一初级抗体120和第二初级抗体130可以被构造成选择性地结合电泳未区分的分析物物种的不同表位。31.可以将化学发光底物134引入毛细管110中，使得可以基于与hrp/化学发光底物相互作用相关的光学信号来检测hrp-标记的次级抗体132，并因此检测第二分析物114/分析物物种。32.如本领域技术人员容易理解的，额外的汽提和重探测步骤是可能的，并且除了化学发光检测之外或代替化学发光检测，可以使用替代性的检测模式(颜色检测、荧光检测等)。尽管图1a-1h描述了通过化学发光检测两种不同蛋白物种的两种相继免疫测定，本领域技术人员将容易理解，替代性实施方案可以为同一靶标采用两种不同的抗体或采用同一蛋白的两种不同表位。此外，可以采用荧光检测、吸光度或任何其它合适的检测方法，包括多种检测模式的组合。33.另外，尽管图1a-1h描绘了被构造成选择性地结合某些目标分析物的初级抗体、被构造成结合初级抗体的hrp-标记的次级抗体和化学发光底物的应用，熟练的技术人员会理解，其它检测技术是可能的。例如，如下面参考图2d所讨论的，次级抗体可以被荧光标记，而不是hrp标记。在这样的一个实施方案中，单独的化学发光底物可能不是必要的。在这样的一个实施方案中，荧光标记的次级抗体可以被仪器激发并检测其发射。在再其它实施方案中，初级抗体可以用hrp、荧光标签标记，或者以其它方式是光学可检测的(例如，通过天然荧光或吸光度技术)。在这样的一个实施方案中，单独的次级抗体可能不是必要的。在再其它实施方案中，可以采用第三、第四等试剂。例如，次级抗体可以是生物素化的，且与光学可检测试剂(例如hrp或荧光标签)缀合的第三抗生蛋白链菌素可以增加与分析物相关的可检测信号。熟练的技术人员将进一步理解，不同的检测技术可以用于评价不同的分析物物种。例如，可以如参考图1b-1d所示和描述的那样检测第一分析物物种112(例如，通过使用初级抗体、hrp-缀合的次级抗体和化学发光底物)，而第二分析物物种114可以通过引入荧光标记的初级抗体而不使用hrp或次级抗体来检测。34.在某些实施方案中，除了启动免疫测定的指示之外，可以自动地和/或在没有额外用户干预的情况下进行参考图1a-1h所示和描述的一些或所有事件。此外，虽然其它顺序是可能的并且在本公开内容的范围内，但是参考图1a-1h描述的事件可以按所述顺序执行。35.图2a-2h解释了根据一个实施方案在汽提和重探测方法中发生的事件。在图2a-2h中解释的实施方案可以用于将一种或更多种免疫测定与总蛋白测定组合。如图所示，总蛋白测定可以在与蛋白质印迹式免疫测定相同的毛细管中和/或相同的样品上进行。虽然其它顺序是可能的并且在本公开内容的范围内，在某些情况下可能优选的是，执行在图2a-2h中所示并在下面以所示顺序描述的事件，这会减少试剂劣化。36.图2a是已分离并固定化至毛细管210的表面的样品的示意图。例如，分析物可以共价地结合至毛细管210的表面。如图所示，样品已分离为三个带212、214和216。每个带代表不同的分析物物种。应当理解，样品可以含有任意数目的分析物物种和/或被分离成任意数目的带。例如，在某些情况下，样品可以是单一分析物物种的均质混合物。37.在样品已经被分离和/或固定化之后，可以将生物素化试剂220引入毛细管210中，如在图2b中所示。生物素化试剂220可以被构造成结合所有的蛋白，使得可以进行总蛋白测定(如下文进一步详细讨论的)，也就是说，使得可以确定样品/毛细管210中的蛋白总量。可以优选在进行任何免疫测定之前将生物素化试剂220添加到毛细管210中，因为生物素化试剂可能不够稳定不能引入免疫测定后的毛细管中。例如，在某些情况下，用户可以在即将开始运行之前(例如，在将样品引入毛细管之前不到20分钟)加载生物素化试剂(例如，加载到样品板上)，因为在某些情况下，生物素化试剂可能在加载后马上开始降解。在某些情况下，在样品已经被分离和/或固定化以后立即将生物素化试剂引入毛细管中(例如，在固定化的5分钟内和/或在将样品引入毛细管中的90分钟内)。任选地，过量的(例如，未结合的)生物素可以在引入后从毛细管洗涤。如本文进一步详细讨论的，仪器可操作以在平行泳道中运行参考样品。类似地讲，仪器可操作以将相同或不同的样品加载到多个毛细管中，包括毛细管210和至少一个参考毛细管(未显示)。在将生物素化试剂引入毛细管210的同时或例如在将生物素化试剂引入毛细管210的5分钟内，可以将生物素化试剂220引入参考毛细管中。通常，在给定生物素化试剂的稳定性谱的情况下，在对毛细管210中的样品进行任何免疫测定之前，将其引入参考毛细管和毛细管210中。38.通过引入一种或更多种初级抗体，可以对固定化在毛细管210中的样品进行免疫测定。如在图2c中所示，引入被构造成选择性地结合第一分析物物种212的第一初级抗体222和被构造成选择性地结合第二分析物物种214的第二初级抗体224。但是，应当理解，可以引入具有任何合适的选择性结合特征的任何数目的初级抗体。此外，可以将第一初级抗体222、第二初级抗体224和/或任意其它初级抗体依次或基本上同时地引入(例如，混合在一起和/或从公共试剂蓄池中抽取)。任选地，可以从毛细管210洗涤过量的(例如，未结合的)初级抗体。39.图2d解释了将第一次级抗体226和第二次级抗体228引入毛细管210。第一次级抗体226被构造成选择性地结合第一初级抗体222，且第二次级抗体228被构造成选择性地结合第二初级抗体224。第一次级抗体226和/或第二次级抗体228可以具有或被修饰成具有光学可检测的特征。例如，次级抗体可以在引入毛细管中之前或之后用光学可检测试剂标记。在某些情况下，可能合乎需要的是，不同的次级抗体具有不同的光学特征，所述次级抗体被构造成与特定初级抗体相关以及因此与特定分析物物种相关。例如，图2d解释了在引入毛细管210中之前用光学可检测的标志物(例如，荧光染料)标记的第一次级抗体226。任选地，可以从毛细管210洗涤未结合的次级抗体和/或光学可检测试剂。在引入毛细管210中之前，第二次级抗体228可以例如用hrp标记。图2e解释了化学发光底物的引入，所述化学发光底物被构造成与hrp-标记的第二次级抗体228相互作用以产生光学可检测信号。与次级抗体相关的光学特征，例如，化学发光和荧光信号，可以由ccd照相机或另一种适当的检测器瞬时和/或随时间收集。这样的光学信号可以用于鉴定在样品中存在的一些或所有分析物物种。例如，如在图2e中所示，分析物物种212和214将在免疫测定期间可检测到。在其中一种分析物物种与hrp关联并且另一种分析物物种与荧光染料关联的情况下(例如，如在图2c-2e中所示)，可以同时或依次检测化学发光信号和荧光信号。例如，荧光标记的第一次级抗体226可以在引入化学发光底物之前、期间或之后被激发。40.如在图2f中所示，一旦检测到次级抗体的光学特征，就可以将构造成从分析物除去初级和/或次级抗体的汽提试剂引入毛细管210中。汽提试剂被构造成使生物素220与分析物结合。图2g解释了向毛细管中引入抗生蛋白链菌素232、抗生物素蛋白和/或被构造成特异性地结合生物素的其它合适试剂。抗生蛋白链菌素可以是hrp-缀合的(在引入毛细管210中之前或之后)和/或以其它方式标记或光学可检测的。例如，通过加载化学发光底物和检测化学发光信号，可以进行总蛋白检测(例如，可以确定用生物素标记的每种蛋白的量)，如在图2h中所示。在某些情况下，可以单独确定每个带中的蛋白的量。41.确定蛋白的总量可以允许将免疫测定信号归一化为总蛋白含量。类似地讲，基于指示蛋白量的光学信号(例如，与通过生物素结合到蛋白的抗生蛋白链菌素相关的光学信号)，可以校正或归一化与免疫测定相关的光学信号(例如，与通过初级抗体结合到分析物物种的次级抗体相关的信号)。在某些情况下，可以给参考毛细管(未显示)加载适合于校正免疫测定信号的参考样品。例如，可以给包含多个毛细管(例如，毛细管210和参考毛细管)的筒依次或并行加载样品。每个毛细管中的蛋白可以被生物素化(依次或并行)。可以将hrp-缀合的抗生蛋白链菌素或其它合适的试剂引入毛细管中(依次或并行)。还可以将化学发光底物引入毛细管中(依次或并行)，使得可以确定每个毛细管中的总蛋白量。在某些实施方案中，基于参考毛细管中的总蛋白含量，可以归一化毛细管210中通过免疫测定检测到的分析物。例如，可以确定参考毛细管中的总蛋白与毛细管210中的总蛋白的比率。该比率可以用于校正与单个蛋白物种的免疫测定相关的信号。这样的技术可以用于校正免疫测定信号以补偿加载异质性。类似地讲，强免疫测定信号可能是与相对于样品中其它蛋白的感兴趣蛋白的高浓度相关的“真”信号的结果，或者它可能与蛋白的大总量相关，例如，如果将比预期更多的细胞内容物加载到毛细管中。42.通常，在启动免疫测定和/或总蛋白测量之前，分析员将制备样品和/或合适的试剂并加载试剂/样品板。在某些实施方案中，在启动免疫测定和/或总蛋白测量之后，一些或所有后续事件(例如，样品加载、分离、免疫测定和/或总蛋白、检测)可以自动地和/或在没有分析员进一步交互的情况下执行。如本领域技术人员容易明白的，额外的汽提和重探测步骤是可能的，可以执行额外的中间洗涤步骤以从毛细管冲洗未结合的试剂，可以使用检测模式的不同组合，和/或可以使用替代性检测模式(颜色检测、荧光检测等)代替上述实施方案中描述的精确组合。尽管图2a-2h描述了通过化学发光和荧光来检测两种不同的蛋白物种，然后进行总蛋白测量，但是本领域技术人员将容易理解，替代性实施方案可以采用相同靶标的两种不同抗体或相同蛋白的两个不同表位。此外，可以采用荧光检测、吸光度或任何合适的众所周知的检测方法，包括多种检测模式的组合。43.图2c和2d解释了基本上同时(例如作为混合物)引入多种初级抗体222、224，并且解释了基本上同时引入多种次级抗体226、228。相反，图1b-1g解释了依次引入不同的初级和次级抗体，其中在引入第一次级抗体122和引入第二初级抗体130之间发生汽提事件。但是，应当理解，关于图1a-h所示和描述的方法可以包括初级抗体和/或次级抗体的混合物的引入。类似地，关于图2a-2h所示和描述的方法可以包括相继免疫测定，例如，在免疫测定之间具有额外的汽提事件。44.根据某些实施方案，本文所述的方法可以在适合于在同一毛细管中和/或以自动化方式进行蛋白含量测量和/或进行免疫测定的仪器上进行，诸如的simple平台。与其它已知的仪器和技术不同，本文描述的实施方案通常比用于传统蛋白质印迹的总蛋白测量的传统方法更简单。使用化学发光或荧光方法或本领域已知的其它方法，可以进行免疫测定和总蛋白测量。此外，用于从免疫测定中除去抗体的汽提试剂提高了固定化至毛细管上的总蛋白含量的检测的准确度。45.如上面参考图1a-1h讨论的，熟练的技术人员会理解，参考图2a-2h所示和描述的实施方案作为示例且不作为限制。具体地，熟练的技术人员会理解，通过化学发光、荧光和/或吸光度技术的任何组合，可以检测分析物物种。熟练的技术人员会理解，可以使用比初级和次级抗体更多或更少的抗体。熟练的技术人员会理解，可以用光学可检测试剂预先标记抗体，可以将光学可检测试剂引入毛细管以选择性地结合抗体和/或分析物物种，和/或分析物物种和/或抗体可以是先天性地可检测的(例如，可以例如基于其吸光度特征而检测未标记的抗体)。46.操作顺序47.如前所述，当在毛细管中测量总蛋白和免疫测定信号时，为了提高性能，试剂添加的特定顺序是优选的。实验证据表明，在免疫测定完成后生物素化试剂的添加导致的信号比在免疫测定之前添加生物素化试剂时获得的信号低70％。重要的是，在该测定中保持更高的信号和相应灵敏度，以获得所述测定的优选检测水平。人们可以尝试在免疫测定之前进行完整的总蛋白检测(例如，生物素化和使用hrp缀合的抗生蛋白链菌素与鲁米诺/过氧化物的检测)，但是，这是一种不太理想的测定构型，可能是由于难以除去hrp缀合的抗生蛋白链菌素，其与生物素具有极高的结合亲和力。hrp缀合的抗生蛋白链菌素的不完全除去可能会对免疫测定性能产生负面影响，例如，通过与生物素化蛋白结合的残余hrp缀合的抗生蛋白链菌素阻止抗体与靶蛋白结合。48.汽提试剂制剂49.本领域已知多种用于从蛋白质印迹膜除去抗体的制剂。这些制剂通常包含缓冲组分、去污剂、变性剂、酸性的或碱性的ph和/或还原剂。本领域已知的大多数汽提缓冲液使用β-巯基乙醇作为还原剂，但是，β-巯基乙醇是有毒的，在溶液中不稳定，具有令人厌恶的气味，并且其使用现在在一些国家受到限制或禁止。因此，需要用于从毛细管除去结合到分析物的抗体的汽提试剂。50.已开发出使用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)作为膦还原剂代替β-巯基乙醇的汽提试剂制剂，并显示在表1中。虽然试验的大多数表1制剂在某种程度上起到除去抗体的作用，但希望始终除去至少95％的免疫测定的残留信号，例如，如使用simple仪器所进行的。优选地，汽提试剂在溶液中也应是稳定的，即在储存一段时间(例如，1天、1周、1个月、6个月、1年或任何其它合适的时间范围)的过程中不应发生沉淀或分解。如表1所示，仅用tcep代替β-巯基乙醇在没有沉淀的情况下无法始终达到》95％汽提效率。在许多抗体上实现高汽提效率是重要的，因为保留的抗体将产生噪音并降低后续免疫测定步骤的检测限度。51.通过更广泛的滴定和表1的组分与另外组分(诸如不同的去污剂和还原剂)的新组合进行进一步优化。已经确定，影响汽提效率的关键因素包括trizma(tris碱；cas:77-86-1)浓度、tcep浓度和ph，而汽提效率对sds浓度相对不敏感。如表2所示，与多种免疫测定(不同的抗体、不同的靶蛋白)组合，在simple上分析了制剂的抗体除去效率。进一步试验了制剂对多种抗体的沉淀、分解和≥95％的除去效率。表2中的几种候选物符合这些标准。具有中性或碱性ph的制剂的表现明显差于具有酸性ph的制剂。该观察是令人惊讶的，因为tcep是优选制剂中的还原剂，并且根据常规观点，tcep被认为在1.5至8.5的宽ph范围内有效，在接近中性ph(即接近7的ph)具有最佳还原性能(参见han,j.c.和han,y.h.,aprocedureforquantitativedeterminationoftris(2-carboxyethyl)phosphine,anodorlessreducingagentmorestableandeffectivethandithiothreitol,analbiochem.1994年7月；220(1):5-10，其特此通过引用整体并入)。另外，如图3所示，确定优选的制剂在窄ph范围内以最高的抗体除去效率运行，这表明，能够产生大于97％的汽提效率的优选制剂具有4.05±0.3的ph。图3解释了针对三种不同靶标park7、β-肌动蛋白和hsp60的汽提效率。52.通过以规定的摩尔浓度或百分比(按重量计)将规定的组分与水混合,制备表1和表2的汽提试剂。如果报告了缓冲物种或tcep储备物的ph，则这些ph指示在组合以形成汽提试剂之前该组分的ph。然后，在将所有组分混合后，将汽提试剂调节至指示的最终ph(例如，通过添加盐酸、氢氧化钠或其它合适的酸或碱)。在某些情况下，不进行ph调节，且最终的ph只是组合组分后测得的ph。用星号指示的最终ph值是估计的最终ph(即，未进行测量)。应当理解，组分的浓度可以变化1％、5％或10％，并且仍然在发明人考虑的汽提缓冲液试剂组合物的范围内。缓冲物种、tcep储备物的指示ph或最终ph可以变化0.1、0.3、0.5或1，并且仍然在发明人考虑的汽提缓冲液试剂组合物的范围内。通过实验观察到报告的汽提效率信息。应当理解，如所示配制的缓冲液可能不会严格复制观察到的汽提效率。53.54.55.56.57.[0058][0059]图4解释了表3中所示制剂的性能，并显示了当ph大于4.5时汽提效率的甚至更大下降。当ph小于3时，汽提效率下降不太严重，但明显下降(数据未显示在图4中，但从表2的8.1(2018):1-6”，其整个公开内容特此通过引用并入。[0064]在上述示意图和/或实施方案指示以某些取向或位置布置的某些部件的情况下，可以修改部件的布置。尽管已经特别地显示和描述了实施方案，但是应该理解，可以做出形式和细节的多种变化。尽管已经将各种实施方案描述为具有特定特征和/或部件的组合，但是其它实施方案可能具有来自如上面讨论的任何实施方案的任何特征和/或部件的组合。[0065]在上述方法和/或事件指示以某种顺序发生的某些事件和/或程序的情况下，可以修改某些事件和/或程序的顺序。此外，某些事件和/或程序在可能时可以在平行过程中同时执行，以及如上所述依次执行。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：3.本文描述的实施方案一般涉及用于对样品进行免疫测定和/或蛋白量测定的毛细管电泳方法。公开了汽提试剂，其可操作以除去与免疫测定相关的抗体，从而可以对同一样品进行额外的测定。
背景技术：
：：4.蛋白研究的一个重要部分包括表征异质样品中的蛋白，诸如可以包括数千种蛋白的细胞裂解物。蛋白质印迹是一种常用的基于免疫测定的方法，其用于分析这些复杂样品中的特定蛋白，其使用抗体的特异性来识别感兴趣的蛋白。当以蛋白质印迹形式进行免疫测定时，定量得到的免疫测定信号变得越来越重要。一种用于定量方法是将免疫测定信号归一化为样品中的总蛋白含量。在发布蛋白质印迹结果时，期刊越来越多地要求这样做以确保数据准确度和精确度。5.现有系统可操作以提供全自动的基于微流体的(例如，基于毛细管的)免疫测定，诸如simple仪器。一些这样的系统能够在毛细管中将免疫测定与类似于传统的基于凝胶的蛋白质印迹的尺寸分离相组合。可以自动加载样品、分离基质、堆叠基质、抗体和试剂。所述仪器可操作以将分离基质和堆叠基质先后抽吸入每个毛细管中。接下来，可以加载可包含异质蛋白混合物的样品，并且可以使毛细管与运行缓冲液接触。可以施加电压以使得能够通过分子量或其它合适的特征进行分离。一旦分离完成，紫外线可以将蛋白固定化至毛细管壁。例如，可以用固定化的蛋白和从毛细管中清除的基质进行蛋白的免疫探测。此外，一些现有系统可操作以提供“总蛋白”测定，所述测定可以通过固定化至毛细管内表面的蛋白的生物素化进行，随后检测辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗生蛋白链菌素和化学发光反应。6.但是，需要一种方法，所述方法允许在同一毛细管或其它微流控装置中进行免疫测定和总蛋白读出的化学发光检测。另外，合乎需要的是，增加超过检测模式/通道数目的复用能力。技术实现要素：7.本文描述的某些实施方案涉及可操作以在单个样品运行中组合免疫测定和总蛋白技术的系统和方法。具有化学发光和荧光检测能力的仪器，诸如的可以提供一种“蛋白归一化”方法，通过这种方法，荧光染料通过例如nhs-酯胺偶联共价连接到所有分离的和固定化的蛋白分子上。以这种方式，可以测量特定靶标，例如，使用与免疫测定相关的化学发光，同时从荧光信号确定加载的总蛋白的测量。用于蛋白归一化的已知技术通常具有与典型的蛋白质印迹式免疫测定类似的动态范围，并且不能在使用化学发光检测进行免疫测定的同一毛细管中进行复用。相反，本文所述的蛋白归一化的实施方案可以与化学发光免疫测定在同一毛细管中复用，并且可以具有与免疫测定信号相比减小的或不同的动态范围。8.除了在同一毛细管或其它微流控装置中进行总蛋白和免疫测定外，本文描述的某些实施方案允许在同一毛细血管中进行多个相继免疫测定。具有化学发光和荧光检测能力的仪器(例如，)允许“复用”检测，即，使用与用于化学发光或荧光检测的部分缀合的抗体的单个混合物检测毛细管内的多种靶标。但是，在单个混合物中组合抗体限制了哪些抗体可以混合，例如，由于用于免疫测定的抗体的交叉反应性所产生的非特异性信号或当在同一毛细管中使用时抗体的不相容动态范围(例如，化学发光相对于荧光的不同动态范围)。9.本文所述的实施方案涉及总蛋白测定和/或第二免疫测定在与蛋白质印迹式免疫测定相同的毛细管中的应用，使得能够进行高灵敏度总蛋白测量和免疫测定，并结合先前用简单的蛋白质印迹技术证明的低样品需求和高通量能力。附图说明10.图1a-1h解释了根据一个实施方案在汽提和免疫测定重探测方法中发生的事件。11.图2a-2h解释了根据一个实施方案在汽提和总蛋白重探测方法中发生的事件。12.图3解释了对于三种不同靶标汽提效率与ph的关系。13.图4解释了汽提效率与较宽ph范围的关系，表明在ph》4.5时汽提效率的显著降低。14.图5a和5b解释了说明在引入汽提试剂之后探测分析物的再现性的实验数据。具体实施方式15.本文描述的某些实施方案涉及适合于对通过毛细管或其它合适的微流控装置中进行的电泳分离的样品进行多个免疫测定的方法。可以分离样品，使得至少第一分析物和第二分析物被分离到不同的带中。第一分析物和第二分析物可以固定化在毛细管中。可以将构造成选择性地结合第一分析物(且任选地，不结合第二分析物)的第一初级抗体引入毛细管中。可以将构造成选择性地结合第一初级抗体的第一次级抗体引入毛细管中。可以基于与第一次级抗体相关的光学特征来检测第一分析物。例如，第一次级抗体可以缀合至辣根过氧化物酶(hrp)，并且可以基于与hrp相关的化学发光反应来检测第一分析物。可以将构造成从第一分析物除去第一初级抗体的汽提试剂引入毛细管中。在引入汽提试剂并且除去第一初级抗体(连同第一次级抗体和/或hrp)之后，第一分析物和第二分析物可以保持固定化在毛细管中。然后可以引入构造成结合第二分析物的第二初级抗体，例如，在引入汽提试剂之后。可以引入构造成结合第二初级抗体的第二次级抗体，并且可以基于与第二次级抗体相关的光学特征(例如，化学发光反应和/或荧光标签)来检测第二分析物。16.本文描述的某些实施方案涉及适合于对通过毛细管或其它合适的微流控装置中进行的电泳分离的样品进行免疫测定和总蛋白测定的方法。来自样品的分析物可以在毛细管中分离并固定化。可以将具有被构造成非特异性地结合蛋白(诸如生物素)的反应性部分的分子引入毛细管中。类似地讲，并且例如，可以将蛋白生物素化。可以将构造成结合至少一个分析物子集的初级抗体引入毛细管中。可以引入被构造成结合初级抗体的次级抗体。可以基于与次级抗体相关的光学特征来检测分析物的子集。可以引入被构造成从分析物子集中除去初级抗体的汽提试剂。在引入汽提试剂并除去初级抗体(连同次级抗体)之后，固定化的分析物可以保留在毛细管中。可以将构造成结合分子的光学可检测试剂引入毛细管中。在分子为生物素的实施例中，可以引入抗生蛋白链菌素。抗生蛋白链菌素可以缀合至hrp或以其它方式使其光学上可检测到。基于与光学可检测试剂相关的光学信号，可以检测毛细管中的所有生物素化的分析物(例如，所有蛋白)。基于与光学可检测试剂相关的光学信号(例如，总蛋白信号)，可以归一化与次级抗体相关的光学特征(例如，免疫测定信号)。在某些实施方案中，重要的是，按照描述它们的顺序执行该段的事件。17.通过消除非研究对象的样品之间的某些不受控差异的影响，归一化免疫测定信号(或其它合适的信号)会提高仪器和/或分析员准确地对比来自不同样品的测量量的能力。对于免疫测定，归一化至每个样品中的总蛋白含量可以消除由于样品组成(例如细胞计数、裂解物稀释)或吸量误差引起的变异性的影响。此外，由于持家蛋白的表达水平可以受实验处理影响或者其免疫测定信号可能不在与靶蛋白相同的线性动态范围内，因此归一化至总蛋白含量有利于归一化至特定持家蛋白(例如β肌动蛋白或β微管蛋白)。在一个实施方案中，如下执行归一化：将通过毛细管中的免疫测定确定的特定蛋白的量除以毛细管中的总蛋白与参考毛细管中总蛋白的比率。18.本文描述的某些实施方案涉及汽提试剂的制剂。汽提试剂可以包括缓冲液、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)和去污剂。汽提试剂可以具有低于5的ph。19.本文描述的某些实施方案涉及用于使用汽提试剂的方法，所述汽提试剂包括tecp且具有在3.0至4.5之间的ph。汽提试剂可以用于从分析物中除去与免疫测定相关的第一初级抗体。分析物可以在毛细管中电泳分离并固定化。可以将与免疫测定相关的第一初级抗体和第一次级抗体引入毛细管中。在使用汽提试剂从毛细管中除去第一初级抗体之后，可以将抗生蛋白链菌素或构造成结合生物素化的蛋白的另一合适试剂和/或构造成结合样品中的分析物的第二初级抗体引入毛细管中。20.汽提和重探测方法21.汽提和重探测可以允许用户在同一毛细管(或其它微流控装置)和同一运行中分析相同的固定化蛋白，从而节省时间、金钱和宝贵的样品。22.图1a-1h解释了根据一个实施方案在汽提和重探测方法中发生的事件。汽提和重探测可以用于按顺序对单个样品执行两种或更多种免疫测定(例如，重复使用分离的和固定化的样品和/或无需为每个免疫测定(重新)加载和/或(重新)分离额外的样品)。图1a是已分离并固定化至毛细管110的表面的样品的示意图。可以将分析物共价地结合至毛细管110的表面，例如，使用美国专利号7,846,676和/或美国专利申请公开号2008/0017512中所示和描述的装置和/或方法，其各自的整个公开内容特此通过引用整体并入。如显示的，样品已被分离到两个带112和114中。每个带代表独特的分析物物种，并存在于毛细管110的独特部分中。应当理解，样品可以含有任意数目的分析物物种和/或被分离成任意数目的带。23.本文中使用的术语“分析物”表示要通过电泳技术分离和/或用本文提供的方法、设备和系统检测的任何分子或化合物。合适的分析物包括、但不限于小化学分子，诸如、例如环境分子、临床分子、化学物质、污染物质和/或生物分子。更具体地，这样的化学分子可以包括、但不限于杀虫剂、杀昆虫剂、毒素、治疗和/或滥用药物、抗生素、有机材料、激素、抗体、抗体片段、抗体-分子缀合物(例如，抗体-药物缀合物)、抗原、细胞膜抗原、蛋白(例如，酶、免疫球蛋白和/或糖蛋白)、核酸(例如，dna和/或rna)、脂质、凝集素、碳水化合物、全细胞(例如，原核细胞诸如病原性细菌和/或真核细胞诸如哺乳动物肿瘤细胞)、病毒、孢子、多糖、糖蛋白、代谢物、辅因子、核苷酸、多核苷酸(包含核糖核酸和/或脱氧核糖核酸)、过渡态类似物、抑制剂、受体、受体配体(例如，神经受体或其配体、激素受体或其配体、营养物受体或其配体和/或细胞表面受体或其配体)、受体-配体复合物、营养物、电解质、生长因子和其它生物分子和/或非生物分子、以及它们的片段和组合。在某些实施方案中，所述分析物是蛋白或蛋白复合物，并且所述样品是细胞的裂解物或纯化的蛋白。其它合适的分析物可以包括胶体和/或乳剂的聚集体、附聚物、絮状物和/或分散相微滴或颗粒。一旦分离，分析物的“带”在本文中被称作“分析物物种”。24.本文中使用的术语“样品”表示含有待检测的一种或多种分析物的组合物。在某些实施方案中，样品是异质的，即含有多种组分(例如，不同的蛋白)，或同质的，即含有一种组分(例如，一种蛋白的群体)。在某些情况下，样品可以是天然存在的、生物材料和/或人造材料。此外，样品可以处于天然(例如，细胞悬浮液)或变性形式(例如，裂解物)。在某些情况下，样品可以是单个细胞(或单个细胞的内容物，例如，作为来自单个细胞的细胞裂解物，或纯化的蛋白)或多个细胞(或多个细胞的内容物，例如，作为来自多个细胞的细胞裂解物，或来自多个细胞的纯化的蛋白)、血液样品、组织样品、皮肤样品、尿样品、水样品和/或土壤样品。在某些情况下，样品可以来自活生物体，诸如真核生物、原核生物、哺乳动物、人、酵母和/或细菌，或者样品可以来自病毒。25.通过任何合适的迁移率参数，诸如电荷、分子量、电泳迁移率(例如，受分子量、特征长度、面积或体积、寡核苷酸长度或其它合适特征影响)、等电点等，可以分离样品。例如，在某些实施方案中，基于迁移率参数诸如分子量等，在包含分离基质的毛细管中对样品进行电泳分离。毛细管可以包括分离基质，其可以以自动方式添加。在某些实施方案中，分离基质是等电分离基质，并且具有与常规电泳实验中使用的聚合物凝胶类似或基本相同的性质，诸如ph梯度。分离基质中的毛细管电泳类似于聚合物凝胶(诸如聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶)中的分离，其中通过提供分子可以在其中移动的多孔通道，基于样品中分子的迁移率参数而分离分子。26.如在图1b中所示，可以将第一初级抗体120引入毛细管110中，例如，在分析物的分离和固定化之后。在某些情况下，在开始分析之后，仪器可操作以自动分离、固定化和/或引入第一初级抗体120，而无需任何进一步的用户干预。第一初级抗体120可以被构造成选择性地结合毛细管120内的一种或更多种分析物物种。也就是说，在某些情况下，第一初级抗体120可以被构造成结合样品/毛细管120内的某些目标分析物，而不结合其它(例如，非目标)分析物。在某些情况下，可以在洗涤步骤中除去未结合的第一初级抗体，例如，在温育时段以后。27.可以将第一次级抗体122引入毛细管110中，如在图1c中所示。第一次级抗体122可以被构造成结合第一初级抗体120。在某些情况下，可以在洗涤步骤中除去未结合的第一次级抗体122，例如，在温育时段以后。如在图1c和1d中所示，在引入毛细管110中之前，给次级抗体122缀合hrp。如在图1d中所示，将化学发光底物124，诸如3,3′,5,5′‑四甲基联苯胺(tab)、3,3'-二氨基联苯胺(dab)、鲁米诺、过氧化物或任何其它合适的产色和/或(增强)化学发光底物引入毛细管中。缀合至次级抗体122的hrp可以催化化学发光底物124，从而产生光学信号。28.基于与第一次级抗体122相关的光学特征，可以检测用第一初级抗体120标记的第一分析物112/分析物物种。例如，与缀合至第一次级抗体122的hrp相关的化学发光反应可以通过ccd照相机或另一种合适的检测器检测和/或记录在一幅图像或随时间拍摄的一系列图像中。在检测用第一初级抗体120标记的分析物/分析物物种之后，可以将汽提试剂引入毛细管110中，如在图1e中所示。汽提试剂可操作以除去第一初级抗体120、第一次级抗体122和/或光学可检测试剂124，同时保留固定化的样品用于另一轮免疫测定。29.图1f-1h然后用第二初级抗体130、第二次级抗体(用hrp标记)132和随后的第二检测步骤重复上述步骤。第二初级抗体130被构造成选择性地结合第二分析物114，并且第二次级抗体132被构造成结合第二初级抗体130。通常，第二初级抗体130被构造成选择性地结合与第一初级抗体120不同的分析物，但在某些情况下，第二初级抗体130可以与第一初级抗体120相同，例如，以评估测定的可重复性、稳定性或特征。第二次级抗体132可以是与第一次级抗体122相同的抗体，或者可以是不同的次级抗体。任选地，可以在汽提试剂已经除去第一初级抗体110之后引入第二初级抗体130和/或第二次级抗体132，其可以允许对单个样品进行相继和不同的免疫测定。例如，第一次级抗体和第二次级抗体都可以被hrp标记，并被构造成在有化学发光底物存在下产生光学上不可区分的信号。通过在检测第一分析物112之后和在引入第二次级抗体132之前汽提第一初级抗体120和第一次级抗体122，可以使用相同的光学可检测试剂检测不同的分析物。30.尽管图1a-1h描绘了选择性地结合不同的(分离的)分析物物种的第一初级抗体120和第二初级抗体130，在其它实施方案中，第一初级抗体120和第二初级抗体130可以被构造成选择性地结合电泳未区分的分析物物种的不同表位。31.可以将化学发光底物134引入毛细管110中，使得可以基于与hrp/化学发光底物相互作用相关的光学信号来检测hrp-标记的次级抗体132，并因此检测第二分析物114/分析物物种。32.如本领域技术人员容易理解的，额外的汽提和重探测步骤是可能的，并且除了化学发光检测之外或代替化学发光检测，可以使用替代性的检测模式(颜色检测、荧光检测等)。尽管图1a-1h描述了通过化学发光检测两种不同蛋白物种的两种相继免疫测定，本领域技术人员将容易理解，替代性实施方案可以为同一靶标采用两种不同的抗体或采用同一蛋白的两种不同表位。此外，可以采用荧光检测、吸光度或任何其它合适的检测方法，包括多种检测模式的组合。33.另外，尽管图1a-1h描绘了被构造成选择性地结合某些目标分析物的初级抗体、被构造成结合初级抗体的hrp-标记的次级抗体和化学发光底物的应用，熟练的技术人员会理解，其它检测技术是可能的。例如，如下面参考图2d所讨论的，次级抗体可以被荧光标记，而不是hrp标记。在这样的一个实施方案中，单独的化学发光底物可能不是必要的。在这样的一个实施方案中，荧光标记的次级抗体可以被仪器激发并检测其发射。在再其它实施方案中，初级抗体可以用hrp、荧光标签标记，或者以其它方式是光学可检测的(例如，通过天然荧光或吸光度技术)。在这样的一个实施方案中，单独的次级抗体可能不是必要的。在再其它实施方案中，可以采用第三、第四等试剂。例如，次级抗体可以是生物素化的，且与光学可检测试剂(例如hrp或荧光标签)缀合的第三抗生蛋白链菌素可以增加与分析物相关的可检测信号。熟练的技术人员将进一步理解，不同的检测技术可以用于评价不同的分析物物种。例如，可以如参考图1b-1d所示和描述的那样检测第一分析物物种112(例如，通过使用初级抗体、hrp-缀合的次级抗体和化学发光底物)，而第二分析物物种114可以通过引入荧光标记的初级抗体而不使用hrp或次级抗体来检测。34.在某些实施方案中，除了启动免疫测定的指示之外，可以自动地和/或在没有额外用户干预的情况下进行参考图1a-1h所示和描述的一些或所有事件。此外，虽然其它顺序是可能的并且在本公开内容的范围内，但是参考图1a-1h描述的事件可以按所述顺序执行。35.图2a-2h解释了根据一个实施方案在汽提和重探测方法中发生的事件。在图2a-2h中解释的实施方案可以用于将一种或更多种免疫测定与总蛋白测定组合。如图所示，总蛋白测定可以在与蛋白质印迹式免疫测定相同的毛细管中和/或相同的样品上进行。虽然其它顺序是可能的并且在本公开内容的范围内，在某些情况下可能优选的是，执行在图2a-2h中所示并在下面以所示顺序描述的事件，这会减少试剂劣化。36.图2a是已分离并固定化至毛细管210的表面的样品的示意图。例如，分析物可以共价地结合至毛细管210的表面。如图所示，样品已分离为三个带212、214和216。每个带代表不同的分析物物种。应当理解，样品可以含有任意数目的分析物物种和/或被分离成任意数目的带。例如，在某些情况下，样品可以是单一分析物物种的均质混合物。37.在样品已经被分离和/或固定化之后，可以将生物素化试剂220引入毛细管210中，如在图2b中所示。生物素化试剂220可以被构造成结合所有的蛋白，使得可以进行总蛋白测定(如下文进一步详细讨论的)，也就是说，使得可以确定样品/毛细管210中的蛋白总量。可以优选在进行任何免疫测定之前将生物素化试剂220添加到毛细管210中，因为生物素化试剂可能不够稳定不能引入免疫测定后的毛细管中。例如，在某些情况下，用户可以在即将开始运行之前(例如，在将样品引入毛细管之前不到20分钟)加载生物素化试剂(例如，加载到样品板上)，因为在某些情况下，生物素化试剂可能在加载后马上开始降解。在某些情况下，在样品已经被分离和/或固定化以后立即将生物素化试剂引入毛细管中(例如，在固定化的5分钟内和/或在将样品引入毛细管中的90分钟内)。任选地，过量的(例如，未结合的)生物素可以在引入后从毛细管洗涤。如本文进一步详细讨论的，仪器可操作以在平行泳道中运行参考样品。类似地讲，仪器可操作以将相同或不同的样品加载到多个毛细管中，包括毛细管210和至少一个参考毛细管(未显示)。在将生物素化试剂引入毛细管210的同时或例如在将生物素化试剂引入毛细管210的5分钟内，可以将生物素化试剂220引入参考毛细管中。通常，在给定生物素化试剂的稳定性谱的情况下，在对毛细管210中的样品进行任何免疫测定之前，将其引入参考毛细管和毛细管210中。38.通过引入一种或更多种初级抗体，可以对固定化在毛细管210中的样品进行免疫测定。如在图2c中所示，引入被构造成选择性地结合第一分析物物种212的第一初级抗体222和被构造成选择性地结合第二分析物物种214的第二初级抗体224。但是，应当理解，可以引入具有任何合适的选择性结合特征的任何数目的初级抗体。此外，可以将第一初级抗体222、第二初级抗体224和/或任意其它初级抗体依次或基本上同时地引入(例如，混合在一起和/或从公共试剂蓄池中抽取)。任选地，可以从毛细管210洗涤过量的(例如，未结合的)初级抗体。39.图2d解释了将第一次级抗体226和第二次级抗体228引入毛细管210。第一次级抗体226被构造成选择性地结合第一初级抗体222，且第二次级抗体228被构造成选择性地结合第二初级抗体224。第一次级抗体226和/或第二次级抗体228可以具有或被修饰成具有光学可检测的特征。例如，次级抗体可以在引入毛细管中之前或之后用光学可检测试剂标记。在某些情况下，可能合乎需要的是，不同的次级抗体具有不同的光学特征，所述次级抗体被构造成与特定初级抗体相关以及因此与特定分析物物种相关。例如，图2d解释了在引入毛细管210中之前用光学可检测的标志物(例如，荧光染料)标记的第一次级抗体226。任选地，可以从毛细管210洗涤未结合的次级抗体和/或光学可检测试剂。在引入毛细管210中之前，第二次级抗体228可以例如用hrp标记。图2e解释了化学发光底物的引入，所述化学发光底物被构造成与hrp-标记的第二次级抗体228相互作用以产生光学可检测信号。与次级抗体相关的光学特征，例如，化学发光和荧光信号，可以由ccd照相机或另一种适当的检测器瞬时和/或随时间收集。这样的光学信号可以用于鉴定在样品中存在的一些或所有分析物物种。例如，如在图2e中所示，分析物物种212和214将在免疫测定期间可检测到。在其中一种分析物物种与hrp关联并且另一种分析物物种与荧光染料关联的情况下(例如，如在图2c-2e中所示)，可以同时或依次检测化学发光信号和荧光信号。例如，荧光标记的第一次级抗体226可以在引入化学发光底物之前、期间或之后被激发。40.如在图2f中所示，一旦检测到次级抗体的光学特征，就可以将构造成从分析物除去初级和/或次级抗体的汽提试剂引入毛细管210中。汽提试剂被构造成使生物素220与分析物结合。图2g解释了向毛细管中引入抗生蛋白链菌素232、抗生物素蛋白和/或被构造成特异性地结合生物素的其它合适试剂。抗生蛋白链菌素可以是hrp-缀合的(在引入毛细管210中之前或之后)和/或以其它方式标记或光学可检测的。例如，通过加载化学发光底物和检测化学发光信号，可以进行总蛋白检测(例如，可以确定用生物素标记的每种蛋白的量)，如在图2h中所示。在某些情况下，可以单独确定每个带中的蛋白的量。41.确定蛋白的总量可以允许将免疫测定信号归一化为总蛋白含量。类似地讲，基于指示蛋白量的光学信号(例如，与通过生物素结合到蛋白的抗生蛋白链菌素相关的光学信号)，可以校正或归一化与免疫测定相关的光学信号(例如，与通过初级抗体结合到分析物物种的次级抗体相关的信号)。在某些情况下，可以给参考毛细管(未显示)加载适合于校正免疫测定信号的参考样品。例如，可以给包含多个毛细管(例如，毛细管210和参考毛细管)的筒依次或并行加载样品。每个毛细管中的蛋白可以被生物素化(依次或并行)。可以将hrp-缀合的抗生蛋白链菌素或其它合适的试剂引入毛细管中(依次或并行)。还可以将化学发光底物引入毛细管中(依次或并行)，使得可以确定每个毛细管中的总蛋白量。在某些实施方案中，基于参考毛细管中的总蛋白含量，可以归一化毛细管210中通过免疫测定检测到的分析物。例如，可以确定参考毛细管中的总蛋白与毛细管210中的总蛋白的比率。该比率可以用于校正与单个蛋白物种的免疫测定相关的信号。这样的技术可以用于校正免疫测定信号以补偿加载异质性。类似地讲，强免疫测定信号可能是与相对于样品中其它蛋白的感兴趣蛋白的高浓度相关的“真”信号的结果，或者它可能与蛋白的大总量相关，例如，如果将比预期更多的细胞内容物加载到毛细管中。42.通常，在启动免疫测定和/或总蛋白测量之前，分析员将制备样品和/或合适的试剂并加载试剂/样品板。在某些实施方案中，在启动免疫测定和/或总蛋白测量之后，一些或所有后续事件(例如，样品加载、分离、免疫测定和/或总蛋白、检测)可以自动地和/或在没有分析员进一步交互的情况下执行。如本领域技术人员容易明白的，额外的汽提和重探测步骤是可能的，可以执行额外的中间洗涤步骤以从毛细管冲洗未结合的试剂，可以使用检测模式的不同组合，和/或可以使用替代性检测模式(颜色检测、荧光检测等)代替上述实施方案中描述的精确组合。尽管图2a-2h描述了通过化学发光和荧光来检测两种不同的蛋白物种，然后进行总蛋白测量，但是本领域技术人员将容易理解，替代性实施方案可以采用相同靶标的两种不同抗体或相同蛋白的两个不同表位。此外，可以采用荧光检测、吸光度或任何合适的众所周知的检测方法，包括多种检测模式的组合。43.图2c和2d解释了基本上同时(例如作为混合物)引入多种初级抗体222、224，并且解释了基本上同时引入多种次级抗体226、228。相反，图1b-1g解释了依次引入不同的初级和次级抗体，其中在引入第一次级抗体122和引入第二初级抗体130之间发生汽提事件。但是，应当理解，关于图1a-h所示和描述的方法可以包括初级抗体和/或次级抗体的混合物的引入。类似地，关于图2a-2h所示和描述的方法可以包括相继免疫测定，例如，在免疫测定之间具有额外的汽提事件。44.根据某些实施方案，本文所述的方法可以在适合于在同一毛细管中和/或以自动化方式进行蛋白含量测量和/或进行免疫测定的仪器上进行，诸如的simple平台。与其它已知的仪器和技术不同，本文描述的实施方案通常比用于传统蛋白质印迹的总蛋白测量的传统方法更简单。使用化学发光或荧光方法或本领域已知的其它方法，可以进行免疫测定和总蛋白测量。此外，用于从免疫测定中除去抗体的汽提试剂提高了固定化至毛细管上的总蛋白含量的检测的准确度。45.如上面参考图1a-1h讨论的，熟练的技术人员会理解，参考图2a-2h所示和描述的实施方案作为示例且不作为限制。具体地，熟练的技术人员会理解，通过化学发光、荧光和/或吸光度技术的任何组合，可以检测分析物物种。熟练的技术人员会理解，可以使用比初级和次级抗体更多或更少的抗体。熟练的技术人员会理解，可以用光学可检测试剂预先标记抗体，可以将光学可检测试剂引入毛细管以选择性地结合抗体和/或分析物物种，和/或分析物物种和/或抗体可以是先天性地可检测的(例如，可以例如基于其吸光度特征而检测未标记的抗体)。46.操作顺序47.如前所述，当在毛细管中测量总蛋白和免疫测定信号时，为了提高性能，试剂添加的特定顺序是优选的。实验证据表明，在免疫测定完成后生物素化试剂的添加导致的信号比在免疫测定之前添加生物素化试剂时获得的信号低70％。重要的是，在该测定中保持更高的信号和相应灵敏度，以获得所述测定的优选检测水平。人们可以尝试在免疫测定之前进行完整的总蛋白检测(例如，生物素化和使用hrp缀合的抗生蛋白链菌素与鲁米诺/过氧化物的检测)，但是，这是一种不太理想的测定构型，可能是由于难以除去hrp缀合的抗生蛋白链菌素，其与生物素具有极高的结合亲和力。hrp缀合的抗生蛋白链菌素的不完全除去可能会对免疫测定性能产生负面影响，例如，通过与生物素化蛋白结合的残余hrp缀合的抗生蛋白链菌素阻止抗体与靶蛋白结合。48.汽提试剂制剂49.本领域已知多种用于从蛋白质印迹膜除去抗体的制剂。这些制剂通常包含缓冲组分、去污剂、变性剂、酸性的或碱性的ph和/或还原剂。本领域已知的大多数汽提缓冲液使用β-巯基乙醇作为还原剂，但是，β-巯基乙醇是有毒的，在溶液中不稳定，具有令人厌恶的气味，并且其使用现在在一些国家受到限制或禁止。因此，需要用于从毛细管除去结合到分析物的抗体的汽提试剂。50.已开发出使用三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)作为膦还原剂代替β-巯基乙醇的汽提试剂制剂，并显示在表1中。虽然试验的大多数表1制剂在某种程度上起到除去抗体的作用，但希望始终除去至少95％的免疫测定的残留信号，例如，如使用simple仪器所进行的。优选地，汽提试剂在溶液中也应是稳定的，即在储存一段时间(例如，1天、1周、1个月、6个月、1年或任何其它合适的时间范围)的过程中不应发生沉淀或分解。如表1所示，仅用tcep代替β-巯基乙醇在没有沉淀的情况下无法始终达到》95％汽提效率。在许多抗体上实现高汽提效率是重要的，因为保留的抗体将产生噪音并降低后续免疫测定步骤的检测限度。51.通过更广泛的滴定和表1的组分与另外组分(诸如不同的去污剂和还原剂)的新组合进行进一步优化。已经确定，影响汽提效率的关键因素包括trizma(tris碱；cas:77-86-1)浓度、tcep浓度和ph，而汽提效率对sds浓度相对不敏感。如表2所示，与多种免疫测定(不同的抗体、不同的靶蛋白)组合，在simple上分析了制剂的抗体除去效率。进一步试验了制剂对多种抗体的沉淀、分解和≥95％的除去效率。表2中的几种候选物符合这些标准。具有中性或碱性ph的制剂的表现明显差于具有酸性ph的制剂。该观察是令人惊讶的，因为tcep是优选制剂中的还原剂，并且根据常规观点，tcep被认为在1.5至8.5的宽ph范围内有效，在接近中性ph(即接近7的ph)具有最佳还原性能(参见han,j.c.和han,y.h.,aprocedureforquantitativedeterminationoftris(2-carboxyethyl)phosphine,anodorlessreducingagentmorestableandeffectivethandithiothreitol,analbiochem.1994年7月；220(1):5-10，其特此通过引用整体并入)。另外，如图3所示，确定优选的制剂在窄ph范围内以最高的抗体除去效率运行，这表明，能够产生大于97％的汽提效率的优选制剂具有4.05±0.3的ph。图3解释了针对三种不同靶标park7、β-肌动蛋白和hsp60的汽提效率。52.通过以规定的摩尔浓度或百分比(按重量计)将规定的组分与水混合,制备表1和表2的汽提试剂。如果报告了缓冲物种或tcep储备物的ph，则这些ph指示在组合以形成汽提试剂之前该组分的ph。然后，在将所有组分混合后，将汽提试剂调节至指示的最终ph(例如，通过添加盐酸、氢氧化钠或其它合适的酸或碱)。在某些情况下，不进行ph调节，且最终的ph只是组合组分后测得的ph。用星号指示的最终ph值是估计的最终ph(即，未进行测量)。应当理解，组分的浓度可以变化1％、5％或10％，并且仍然在发明人考虑的汽提缓冲液试剂组合物的范围内。缓冲物种、tcep储备物的指示ph或最终ph可以变化0.1、0.3、0.5或1，并且仍然在发明人考虑的汽提缓冲液试剂组合物的范围内。通过实验观察到报告的汽提效率信息。应当理解，如所示配制的缓冲液可能不会严格复制观察到的汽提效率。53.54.55.56.57.[0058][0059]图4解释了表3中所示制剂的性能，并显示了当ph大于4.5时汽提效率的甚至更大下降。当ph小于3时，汽提效率下降不太严重，但明显下降(数据未显示在图4中，但从表2的8.1(2018):1-6”，其整个公开内容特此通过引用并入。[0064]在上述示意图和/或实施方案指示以某些取向或位置布置的某些部件的情况下，可以修改部件的布置。尽管已经特别地显示和描述了实施方案，但是应该理解，可以做出形式和细节的多种变化。尽管已经将各种实施方案描述为具有特定特征和/或部件的组合，但是其它实施方案可能具有来自如上面讨论的任何实施方案的任何特征和/或部件的组合。[0065]在上述方法和/或事件指示以某种顺序发生的某些事件和/或程序的情况下，可以修改某些事件和/或程序的顺序。此外，某些事件和/或程序在可能时可以在平行过程中同时执行，以及如上所述依次执行。当前第1页12当前第1页12
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