用于构建人源化菌群小鼠模型的试剂盒

1.本发明属于医学领域，具体涉及一种用于构建人源化菌群小鼠模型的试剂盒及其应用、以及所构建小鼠模型在免疫检查点抑制剂筛选或评价中的用途。


背景技术：

2.肿瘤治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和靶向疗法等，很多肿瘤的初始临床治疗效果良好，但随着药物治疗时间的延长，肿瘤往往会产生耐药性，且容易复发，为临床治疗带来严峻挑战。
3.人体肠道微生物组成复杂，具有多样性，其在人体健康与疾病过程中具有重要影响作用，被广泛认为是机体中一个被忽视的“重要器官”、“第二基因组”和“第二大脑”等。研究表明，特定肠道菌群作为促癌或抑癌因素，影响肿瘤的发生、发展和转移。同时其可从多个方面影响药物的药代动力学、抗癌活性和毒性，对抗肿瘤治疗产生重要影响。肠道菌群个体间的差异高达80％-90％，主要是菌种水平上的差异。另外，肠道菌群的结构会受到多种因素的影响，包括宿主遗传因素、地域情况、饮食习惯、健康状况及药物使用情况等等；这不仅增加了菌群研究的复杂性，同时也为肠道菌群研究在精准医疗和个性化医疗时代的发展带来了很好的机会。
4.近年来，随着肠道菌群与人类疾病相关性研究的进展，对肠道微生物移植小鼠模型建立及应用的需求也随之增加。目前，小鼠模型仍然肠道菌群研究的首选对象。肠道微生物移植小鼠模型已经成研究微生物与人相关疾病因果关系、以及可能有效干预治疗方法的临床前概念验证最为有效的选择。由于小鼠与人的肠道微生物组成存在明显不同，如何将小鼠模型的实验结果推论至人体，仍然是当前肠道菌群与人类相关疾病研究领域需要谨慎考虑的问题。目前，应用无菌小鼠建立人源肠道微生物移植小鼠模型，借以研究肠道菌群在人体健康及相关疾病中发挥的影响作用，已成为当前该领域的重要研究策略。然而，无菌动物模型的使用需要非常严格的无菌动物繁殖和饲养环境，不易获得，国内绝大多数研究机构无法达到繁殖和饲养无菌动物的条件。此外，粪菌移植实验的无菌小鼠模型不仅构建繁琐，而且模型效果差，难以真实反应情况。


技术实现要素：

5.鉴于人肠道微生物移植小鼠模型具有重要的临床研究价值，发明人为了克服现有技术存在的上述不足之处，提供一种构建人源化菌群小鼠模型、尤其是人源化菌群荷瘤小鼠模型的系统和方法，不仅使得实验小鼠模型的构建方法简单化，而且得到的小鼠模型能真实可靠地反映人体肠道微环境状态，为研究肠道菌群的作用机制及关键预后靶点的发现、制定个体化的精准用药方案奠定基础。具体地，本发明包括如下技术方案。
6.一种用于构建人源化菌群小鼠模型的试剂盒，其包括：广谱抗生素组合物，用于清除小鼠原有肠道菌群；人类肠道菌群，用于灌胃小鼠来植入新菌群，来源于预定疾病的患者粪便的肠道菌群即粪菌，所述预定疾病是指与预构建的小鼠模型的疾病；膳食纤维，用于促
进人源供体菌在小鼠肠道内定植和生长；灌胃器具。
7.在一种实施方式中，上述人类肠道菌群来源于癌症患者粪便。相应地，小鼠模型是癌症小鼠模型。
8.为此，上述试剂盒还包括：小鼠癌细胞，用于构建癌症小鼠模型。
9.例如，所述小鼠癌细胞是小鼠肿瘤细胞比如小鼠结肠癌细胞(mc38细胞)，用于构建肿瘤小鼠模型比如结肠癌小鼠模型。
10.优选地，上述试剂盒还包括：用于从粪便中分离肠道菌的工具。所述工具包括：取样勺、过滤器比如滤网、离心管、适合于保存活菌的缓冲剂/缓冲溶液。
11.所述缓冲溶液包括、但不限于磷酸盐缓冲液pbs、含有20％甘油的pbs、碳酸盐缓冲剂cbs、硼酸盐缓冲液、氨基酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、tris缓冲液。优选用于冻存粪便的缓冲溶液是含有20％甘油的pbs。
12.pbs缓冲液是溶剂介质，各组份浓度为：137mm氯化钠，2.7mm氯化钾，10mm磷酸二氢钠，2mm磷酸二氢钾。结合粪便标本的酸碱性，优选采用ph 7.0-7.5。
13.含有20％甘油的pbs是在pbs缓冲液中加入20％浓度甘油，减少冻存粪便样品时菌体因冰晶形成而死亡。
14.优选地，广谱抗生素组合物包括、但不限于：万古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑和氨苄青霉素。
15.其中，广谱抗生素组合物各成分给药量可以为：万古霉素50-200mg/kg小鼠体重，优选大约100mg/kg小鼠体重；硫酸新霉素100-300mg/kg小鼠体重，优选大约200mg/kg小鼠体重；甲硝唑100-300mg/kg小鼠体重，优选大约200mg/kg小鼠体重；氨苄青霉素100-300mg/kg小鼠体重，优选大约200mg/kg小鼠体重。每天给药1次，连续3天。这样的给药量对小鼠的生理状态无明显影响。广谱抗生素组合物各成分可溶解于无菌生理盐水中进行给药。
16.上述膳食纤维可以是果胶。果胶是存在于高等植物初生细胞壁和中胞层的一种可溶性纤维，其主要成分是d-半乳糖醛酸多聚物，分子质量在100kda以上。果胶进入消化道后能够保持其胶体活性而不被消化，提供了适合有益菌群生长的环境，因此能够促进供体菌群在受体肠道内的定植效率和生长速度。
17.发明人在研究中发现，果胶的灌胃对于外源粪菌在小鼠肠道内的定植和肠道内生长具有明显的促进作用，可以使外源肠道菌在小鼠肠道内的定植成功率提高至少50％以上，大大缩短了模型小鼠的构建速度并提高成功率，显著降低构建小鼠模型的成本。
18.上述膳食纤维果胶来源于水果，例如以柚子、柠檬、柑橘、苹果、香蕉等水果的果皮或果渣为原料，自行提取纯化获得；亦可通过商业化途径购买，例如是商品果胶，其半乳糖醛酸含量(干基计)≥74.0％(货号：p112756，厂家：阿拉丁试剂(上海)有限公司)。
19.果胶的灌胃量是5-20mg/kg小鼠体重，优选大约10mg/kg小鼠体重。每天2次，连续4天。
20.应理解，本文中在表述数值特征时，术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有
±
10％、
±
8％、
±
6％、
±
4％或
±
2％的误差范围或浮动范围。
21.在一种实施方式中，上述小鼠为无特定病原菌(specific pathogene free，spf)小鼠。
22.本发明第二个方面提供了一种构建上述人源化菌群小鼠模型的方法，采用上述的
试剂盒实施，其包括下述步骤：
23.1)分离人源肠道菌群：从人新鲜或者冻存粪便样品中分离出粪菌；
24.2)广谱抗生素组合物灌胃小鼠，清除小鼠的内源性菌群，且对小鼠的生理状态无明显影响，得到无菌动物模型；
25.3)将人源肠道菌群灌胃小鼠，通过灌胃的方式给无菌动物模型移植粪菌液大约200μl，每天1次，连续3天；
26.4)在小鼠皮毛上涂抹粪菌液(避免鼠源肠道菌滋生、或者小鼠通过习惯性抓挠交叉传染鼠源肠道菌，同时避免使用抗生素而造成小鼠发生皮肤过敏等病变。小鼠习惯性抓挠皮毛而通过口腔摄入的细菌也为人源肠道菌，从而确保小鼠肠道内定植的是人源肠道菌。)，每只小鼠皮毛上涂抹大约100μl粪菌液；
27.5)通过灌胃给粪菌移植小鼠饲喂果胶，灌胃量是大约10mg/kg小鼠体重。每天2次，连续4天；
28.6)移植效率的评估：采用高通量测序方法对小鼠的肠道菌群进行测序并进行生物信息学分析，检测粪便菌群结构与多样性，评估移植效率，得到人源化菌群小鼠模型。
29.优选地，上述方法进一步包括如下步骤：
30.7)构建肿瘤模型：体外培养足量的肿瘤细胞例如mc38细胞，对小鼠进行皮下注射，导致小鼠体内成瘤，得到人源化菌群荷瘤小鼠模型。
31.相对应地，上述试剂盒还包括细胞注射器具。
32.上述方法中，步骤1)的操作例如是：收集人新鲜粪便标本，称重后，在等体积(w/v)的含有20％的甘油的pbs中混匀，冷冻；粪菌移植前，将粪便样品解冻，悬浮在等体积的pbs中，混匀后，用100目的滤网比如100目的滤网过滤，用离心管收集滤液，记录滤液体积，离心弃上清，再加入生理盐水至原体积，混匀，重复此步骤数次，下层沉淀物用生理盐水稀释，混匀即得粪菌液，用于粪菌移植。
33.本发明第二个方面提供了上述肿瘤小鼠模型在筛选评价免疫检查点抑制剂中的用途。
34.例如，所述免疫检查点抑制剂可以是pd-1抑制剂。
35.本发明的实验小鼠模型构建方法简单，成本低，构建成功率显著提高，且得到的小鼠模型能真实可靠反应人体肠道微环境状态，为研究肠道菌群的作用机制及关键预后靶点的发现，制定个体化的精准用药方案奠定基础。
附图说明
36.图1显示了人源化菌群荷瘤小鼠的构建和验证的形状表征情况。其中，a：小鼠的盲肠照片；b：肠道菌群16s rdna基因测序显示的稀疏曲线；c、d、e：肠道菌群16s rdna基因测序的chao指数、shannon指数以及ace指数。图中control(对照)是不实施构建操作的原始小鼠，abx cocktail是饲喂广谱抗生素组合物小鼠。
37.图2显示了小鼠模型肠道菌群中的物种组成分析图。其中，a：肠道菌群中基于门水平的物种组成分析；b：基于属水平的物种组成分析。图中control(对照)是不实施构建操作的原始小鼠，abx cocktail是饲喂广谱抗生素组合物小鼠。
38.图3显示了人源化肠道菌群荷瘤小鼠的验证。其中，a：各个人类供体与受体小鼠的
肠道微生物进化的聚类分析，使用基于bray-curtis距离的相异系数构建肠道菌群的进化树。b：使用source tracker分析估算受体小鼠的肠道菌群来源于人类供体粪便的比例。
39.图4显示了人源化肠道菌群荷瘤小鼠模型对pd-1抑制剂(anti-pd-1)治疗效果的测试结果。其中，a：各组人源化肠道菌群荷瘤小鼠模型的肿瘤生长曲线，图中横坐标是肿瘤接种后的天数(days after tumor innoculation)，纵坐标是肿瘤体积；b：各组人源化肠道菌群荷瘤小鼠的生存曲线，生存时间的单位为天，图中横坐标是肿瘤接种后的天数(days after tumor innoculation)，纵坐标是小鼠存活率；c：各组人源化肠道菌群荷瘤小鼠的肿瘤质量汇总，图中横坐标是小鼠分组，纵坐标是肿瘤质量。control(对照)是不实施构建操作的原始小鼠，abx cocktail是饲喂广谱抗生素组合物小鼠，hv是接受了健康志愿者(healthy volunteer)粪菌的荷瘤小鼠，col是接受了结肠癌患者(colon cancer)粪菌的荷瘤小鼠。
40.图5显示了人源化肠道菌群荷瘤小鼠模型的肿瘤免疫微环境评估和分析。实验结束时，各组人源化肠道菌群荷瘤小鼠模型的肿瘤组织中cd4、cd8的免疫组化染色图像(a)和统计分析结果(b)。图b中，横坐标是小鼠分组，左图纵坐标是肿瘤中cd4的ihc评分，右图纵坐标是肿瘤中cd8的ihc评分，其中ihc是免疫组织化学染色。
具体实施方式
41.本发明采用广谱抗生素组合物对小鼠处理后，对小鼠进行粪菌移植，采用膳食纤维果胶处理，促进供体粪菌在受体肠道内定植和生长，得到人源化菌群小鼠模型，在此基础上构建肿瘤模型。
42.在临床领域，粪菌移植的动物模型常采用无菌小鼠。但是，无菌小鼠在构建模型时存在以下不足：1.无菌动物在自然界中并不存在，只能依靠人工养育。因此，饲养环境条件要求苛刻，饲养费用高；2.繁育率低，污染率高，成活率低，某些特殊基因型小鼠甚至无法繁殖与饲养；3.存在先天免疫与神经缺陷，生命力差，疾病建模后死亡率高，导致相关疾病研究结果不可靠。本发明用广谱抗生素组合物彻底清除spf级小鼠的内源性菌群后，可获得无菌小鼠，利用其构建粪菌移植的模型，可以大大简化实验步骤，减少实验动物样本，降低实验成本。更为重要的是，spf级小鼠近似健康正常的小鼠，相较于无菌小鼠，能够更真实反映所模仿机体的生理状态。
43.应理解，本发明构建的小鼠模型可以是模拟健康人的人源化菌群小鼠模型，即粪菌来源于健康人个体；也可以是模拟某种疾病的人源化菌群小鼠模型，即粪菌来源于某种疾病患者个体。为了保障人源化菌群小鼠模型的典型性，作为粪菌供体的个体应当满足下述条件：1)粪便样本采集前2个月内无合并感染性疾病；无心、肝、造血系统严重功能障碍，无腹泻或便秘及严重营养不良等；2)在粪便样本采集前至少3个月，未使用任何抗生素、益生菌或抗微生物制剂；3)无自身免疫性疾病及代谢性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬皮病、痛风、糖尿病、肥胖症等；4)无接受粪菌移植史；5)无节食或者严格素食；6)无严重心脑血管疾病史。
44.在一种优选的实施方式中，灌胃给小鼠的粪菌是来自多个同类型供体的粪便的混合粪菌，例如将若干例患者标本的粪便悬浮液取等量混合，消除了标本个体差异造成的粪菌差异，从而保障所构建人源化菌群小鼠模型的代表性和典型性，真实可靠反应人体肠道
微环境状态，为研究肠道菌群的作用机制及关键预后靶点的发现提供准确信息。
45.在一种示例性的实施方式中，人源化菌群荷瘤小鼠模型的构建方法可以包括下述步骤：
46.步骤1：使用无菌生理盐水将万古霉素(约100mg/kg小鼠体重)、硫酸新霉素(约200mg/kg小鼠体重)、甲硝唑(约200mg/kg小鼠体重)和氨苄青霉素(约200mg/kg小鼠体重)四种抗生素制备成溶液，然后按照小鼠体重进行灌胃，每天1次，连续3天，得到无菌动物模型。
47.步骤2：留取人类的新鲜粪便，称重后，在等体积(w/v)的含有20％甘油的pbs中混匀，并储存在-80℃冰箱。粪菌移植前，将人的粪便样品解冻，悬浮在等体积的pbs中，混匀后，再用100目的滤网过滤，用离心管收集滤液，记录滤液的体积，7000r/min离心5min，倒掉上清，再加入生理盐水至原体积，混匀，重复此步骤3次，下层沉淀物再用生理盐水溶解，涡旋混合均匀即为粪菌液，用于粪菌移植。
48.步骤3：通过灌胃的方式给无菌动物移植粪菌液约200μl，每天1次，连续3天。
49.每只小鼠皮毛上再涂抹约100μl粪菌液。每笼饲养5只小鼠。
50.步骤4：粪菌移植后第3天，小鼠皮下接种5.0
×
105个mc38细胞。5天后(肿瘤平均体积达到100～150mm3)，每隔3天腹腔注射pd-1抑制剂或同型对照igg抗体，共3次。
51.步骤5：通过灌胃的方式给粪菌移植动物饲喂约10mg/kg果胶，每天2次，连续4天。
52.步骤6：移植效率的评估：利用人的粪便进行粪菌移植3天(1次/天)。10天后采用高通量测序方法对小鼠的肠道菌群进行测序并进行生物信息学分析，以检测粪便菌群结构与多样性，评估移植效率。
53.本发明的优点在于下述几个方面；
54.1.与现有技术相比，本发明构建小鼠模型时无需复杂昂贵设备，对实验动物友好，构建方法效率高，从开始建模到模型建立仅需9天，简单易行，成功率高，可重复性好；用spf级小鼠代替无菌小鼠，不仅降低成本，而且构建出的实验小鼠模型相对稳定、效果良好，能真实可靠地反应人体肠道内环境，因此具有良好的实际应用价值。
55.2.本发明的建模方法无副作用，成本较低，建立的人源化菌群荷瘤小鼠模型是肠道菌群与人类相关疾病不可缺少的动物模型，用途较广。
56.在优选的实施方式中，该试剂盒除了广谱抗生素组合物、人类肠道菌群、膳食纤维果胶、灌胃器具、细胞注射器外，还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具箱，其空间划分为可以收容一种或多种容器、操作器具的限定空间，该容器例如是药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频app下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如u盘、网盘等。
57.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
58.实施例
59.本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量(wt％)或者体积/重量百分含量(w/v％)。
60.本文的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温
(10-40℃)。
61.材料及仪器：
62.spf级6-8周龄的雌性c57bl/6小鼠，体重18.0
±
2.9g(上海斯莱克实验动物技术有限公司)5只一组，共计20只，离心机(eppendorf 5810r)，sw-cj-2f超净工作台(苏州净化设备有限公司)，rpmi 1640/dmem培养基(solarbio公司)，ep管(axygen)，抗凝采血管，移液枪，无菌枪头，生理盐水，游标卡尺，无菌100mm培养皿，碘伏，75％酒精。
63.微生物基因组测序委托上海微基生物科技有限公司完成。
64.实施例1：建立人源化菌群荷瘤小鼠模型
65.1.构建无菌动物模型
66.使用无菌生理盐水将万古霉素(100mg/kg小鼠体重)、硫酸新霉素(200mg/kg小鼠体重)、甲硝唑(200mg/kg小鼠体重)和氨苄青霉素(200mg/kg小鼠体重)四种抗生素制备成溶液，然后按照小鼠体重进行灌胃，每天1次，连续3天；得到无菌动物模型。
67.2.患者标本采集
68.肿瘤患者入组标准：新发实体瘤患者、无传染病、病理学诊断明确、肿瘤大小合适、临床信息完整、签署知情同意书。
69.建立入组患者数据库，包括：姓名、性别、年龄、联系方式、术前资料(包括血常规、生化、胃镜、影像学检查等)、术后资料(血常规、生化、病理学诊断报告、tnm分期等)、治疗用药方案、治疗效果、生存期等。
70.从复旦大学附属中山医院收集4名新诊断为恶性实体瘤的患者的新鲜粪便标本，称重后，在等体积(w/v)的含有20％甘油的pbs中混匀，并储存在-80℃冰箱。粪菌移植前，将人的粪便样品解冻，悬浮在等体积的pbs中，混匀后，再用100目的滤网过滤，用离心管收集滤液，记录滤液的体积，7000r/min离心5min，倒掉上清，再加入生理盐水至原体积，混匀，重复此步骤3次，下层沉淀物再用生理盐水溶解，涡旋混合均匀即为粪菌液，用于粪菌移植。
71.患者标本的纳入标准：
72.1)入组前2个月内无合并感染性疾病，无心、肝、造血系统严重功能障碍，无腹泻或便秘及严重营养不良等；
73.2)在粪便样本采集前至少3个月，未使用任何抗生素、益生菌或抗微生物制剂；
74.3)无其他恶性肿瘤病史或接受抗肿瘤治疗；
75.4)无接受粪菌移植史；
76.5)无节食或者严格素食；
77.6)无严重心脑血管疾病史。
78.3.粪便采集与储存
79.1)将粪便直接排泄到干净的容器中，尽量避免尿液、马桶壁等对粪便样本的污染，取同时间段样本或将所有样本混匀后再取样；
80.2)用无菌勺对粪便样本进行挖取，将适量粪便样本放入无菌保存管中，分装样本200mg/管，迅速放入液氮中15min以上进行淬灭处理；
81.3)采集好的样本立刻放入-80℃冰箱保存待用。
82.4)若样本需要重复检测，可用无菌棒混匀后多管分装，以避免反复冻融，样本采集后立刻放入-80℃冰箱保存备用。
83.4.粪便处理及灌胃移植
84.粪菌移植前，将人的粪便样品解冻，悬浮在等体积的pbs中，混匀后，再用100目的滤网过滤，用离心管收集滤液，记录滤液的体积，7000r/min离心5min，倒掉上清，再加入生理盐水至原体积，混匀，重复此步骤3次，下层沉淀物再用生理盐水溶解，涡旋混合均匀即为粪菌液，用于粪菌移植。
85.每例患者的粪便悬浮液取等量混合，将300μl混合后的粪便悬浮液通过灌胃针注入小鼠胃内，每天1次，连续3天。
86.此外，每只小鼠皮毛上再涂抹100μl粪菌液。每笼饲养5只小鼠。
87.5.膳食纤维果胶的灌胃处理
88.在粪菌移植后的小鼠模型中，将10mg/kg果胶灌胃针注入小鼠胃内，每天2次，连续4天。
89.6.肿瘤模型的建立
90.1)培养足够数量的mc38细胞，保证细胞状态良好、无污染、无杂质。在细胞融合度达到70-80％时，用0.25％胰酶消化后收集在15ml离心管中，1000r/min离心5min，用pbs重悬单细胞悬液，细胞计数仪计数，用pbs配置成浓度为5.0
×
106个/ml。
91.2)将小鼠放在干燥、清洁的实验台上，无菌条件下，用l ml注射器抽取瘤细胞悬液200μl，于小鼠右侧腋部皮下注射，每只小鼠接种的细胞数为5.0
×
105个。
92.3)观察细胞成瘤情况，1周后，测量小鼠肿瘤体积及小鼠体重，并做好记录。
93.4)当小鼠肿瘤体积达100-150mm3时，开始用药。小鼠肿瘤体积计算公式：v＝0.5
×
长径
×
短径
×
短径。
94.5)第30天，收集各组小鼠粪便、血液等样本后，颈椎脱臼处死，然后将小鼠固定于小动物手术台上，全身酒精消毒后，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、结肠及肿瘤组织，并用预冷的pbs反复冲洗干净。对肿瘤组织进行称重测量，拍照记录。将取下的组织一分为二，一份置于福尔马林溶液中；一份放入液氮中速冻，随后放入-80℃冰箱保存。
95.以下为本实施例的实验结果：
96.1.无菌小鼠造模结果
97.在人源化菌群荷瘤小鼠的构建和验证中，广谱抗生素组合物灌胃处理spf级小鼠1周后，处死小鼠取出肠道，切离盲肠观察拍照，抗生素处理组小鼠盲肠发生代偿性膨大，肠腔直径增粗，盲肠内容物大量滞存，而这一特征符合无菌小鼠的盲肠外观(图1中a)。16srdna基因测序发现，抗生素组合处理后的小鼠，其肠道菌群的稀疏曲线远低于对照组(图1中b)，表明肠道菌群总体减少。同时，广谱抗生素组合物大大降低了小鼠的肠道菌群多样性，包括chao指数、shannon指数以及ace指数(图1中c-e)，严重破坏了肠道菌群的正常结构。基于门(phylum)水平的物种组成分析提示，对照组中肠道菌群中拟杆菌门和硬壁菌门占绝大多数，而饲喂广谱抗生素组合物后，原有的共生菌群被有效清除(图2中a)。基于属(genus)水平的物种组成分析同样提示拟杆菌属、阿克曼菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属等与饲喂抗生素组合物前相比均被清除(图2中b)。这些结果提示小鼠肠道内的菌群已基本被清除干净，成功获得无菌小鼠模型。
98.2.移植效率的评估
99.我们利用患者的粪便进行粪菌移植3天(1次/天)。10天后采用高通量测序方法对
小鼠的肠道菌群进行测序并进行生物信息学分析，以检测粪便菌群结构与多样性，基于bray-curtis距离的相异系数构建菌群进化树，结果显示各个人类供体与受体小鼠的菌群具有显著的聚集性，这提示人类供体与受体小鼠具有类似的群落结构(图3中a)。进一步地，source tracker分析显示受体小鼠的肠道中有超过70％的微生物来源于人类供体。这些结果提示人类供体的肠道微生物基本成功定植在受体小鼠的肠道中(图3中b)。
100.实施例2：人源化菌群荷瘤小鼠模型在免疫检查点抑制剂治疗中的应用
101.我们探索了人源化菌群荷瘤小鼠模型在免疫检查点抑制剂治疗中的应用，为制定个体化的精准用药方案奠定基础。
102.最近的研究表明，肿瘤免疫治疗的效果和并发症与患者肠道菌群组成有关，对治疗敏感或易发生不良反应的患者肠道菌群组成有一定特征。这些特征可能作为生物标志物来预测免疫治疗的预后。但是，肠道菌群的结构和组成会受到多种因素的影响，包括宿主遗传因素、地域情况、饮食习惯、健康状况及药物使用情况，因此肠道菌群个体间的差异高达80％-90％。这不仅增加了肠道菌群研究的复杂性，同时也为肠道菌群在精准医疗和个性化医疗中的应用带来了发展的机会。
103.鉴于肠道菌群对肿瘤免疫治疗的影响及高度异质性，本发明公开的利用患者治疗前的粪便作为供体，得到了具有人体生理特性的人源化菌群荷瘤小鼠模型，能够用于对多种免疫治疗药物和联合用药进行测试，并对恶性肿瘤药物进行有效筛选。
104.以实施例1中粪菌移植的实验小鼠模型为对象，收集1名新诊断为结肠癌的患者的新鲜粪便标本。同时收集1名体型、体重相仿且无基础病的健康人的粪便标本，以此作为人类粪便的供体，采用结肠癌细胞系mc38，构建人源化菌群荷瘤小鼠模型。免疫检查点抑制剂为pd-1抑制剂(invivomab anti-mouse pd-1，bio x cell co.ltd.usa，#be0146)。
105.以下为本实施例的实验结果：
106.1.人源化菌群荷瘤小鼠模型对pd-1抑制剂(invivomab anti-mouse pd-1)治疗效果的测试结果
107.在构建模型过程中，所有小鼠的耐受性良好。构建模型成功后，精神良好，毛发光滑，饮食、排便均正常。在各组小鼠中，pd-1抑制剂的治疗作用是不同的。参见图4，图a中显示，不实施构建操作的原始小鼠(control)的肿瘤体积最大，人源化肠道菌群群荷瘤小鼠模型(col)次之，饲喂广谱抗生素组合物小鼠(abx cocktail)再次之，接受健康人粪菌的荷瘤小鼠(hv)的肿瘤体积明显较低。图c中显示，不实施构建操作的原始小鼠(control)、人源化肠道菌群群荷瘤小鼠模型(col)、饲喂广谱抗生素组合物小鼠(abx cocktail)的肿瘤重量都较大，接受健康人粪菌的荷瘤小鼠(hv)的肿瘤重量明显减少。表明利用结肠癌患者菌群构建的小鼠模型(col)，pd-1抑制剂对肿瘤生长的抑制作用较差；而利用健康志愿者菌群构建的小鼠模型(hv)，pd-1抑制剂的治疗作用较优(图4中a、c)。两组的生存时间之间同样具有显著的统计学差异(图4中b)。这些结果提示该结肠癌患者在后续的pd-1抑制剂治疗中可能失败，而健康志愿者的肠道菌群可以挽救其对pd-1抑制剂治疗的抵抗。
108.2.人源化菌群荷瘤小鼠模型的肿瘤免疫微环境评估和分析
109.越来越多的证据表明，肠道菌群能够调节宿主的免疫功能和对肿瘤治疗的响应。为了探索肠道菌群在pd-1抑制剂治疗中的分子及细胞机制，我们对各组小鼠的肿瘤组织进行了免疫组化分析。我们观察到利用结肠癌患者菌群构建的小鼠模型(col)，其肿瘤组织中
t细胞浸润显著减少，包括cd4

t细胞和cd8

t细胞，而这两种细胞在机体抗肿瘤免疫反应中起着关键作用(图5)。此外，健康人的肠道菌群(hv)可增加肿瘤免疫微环境cd4

和cd8

t细胞的浸润，形成了“热”的肿瘤微环境。参见图4中b，不实施构建操作的原始小鼠(control)、人源化肠道菌群群荷瘤小鼠模型(col)、饲喂广谱抗生素组合物小鼠(abx cocktail)的肿瘤组织中cd4的ihc评分和cd8的ihc评分都相对较低，接受健康人粪菌的荷瘤小鼠(hv)明显提高。这一结果显示，人源化菌群荷瘤小鼠模型(col)能够有效地反应患者的肿瘤免疫微环境状态。
110.上述实施例是为了便于本技术领域的普通技术人员理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易地对实施例做出修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。