使用突变IDH抑制剂的组合疗法的制作方法

使用突变idh抑制剂的组合疗法
1.本发明涉及使用突变体异柠檬酸脱氢酶(idh)抑制剂和一种或多种抗代谢剂、低甲基化剂和突变体fms-样酪氨酸激酶3(flt3)抑制剂的组合疗法，用于治疗癌症。
2.idh1和idh2是催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸并将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp

)还原为nadph的酶(megias-vericat j等人,blood lymph.cancer:targets and therapy 2019；9:19-32)。
3.idh1中的新生形(de novo)突变，例如在idh1氨基酸残基r132处，有助于几种类型的癌症中的肿瘤发生，包括实体瘤癌症和血液学恶性肿瘤(badur mg等人,cell reports 2018；25:1680)。idh1突变可以产生高水平的2-羟基戊二酸(2-hg)，其抑制细胞分化，并且突变体idh1的抑制剂可以降低2-hg水平，这促进细胞分化(molenaar rj等人,oncogene 2018；37:1949-1960)。突变也发生在idh2中，例如在氨基酸残基r172、r140和r172处(yang h等人clin.cancer.res.2012；18:5562-5571；mondesir j等人,j.blood med.2016；7:171-180)。
4.例如，急性髓性白血病(aml)的特征在于各种各样的突变基因和包含随时间并且在疗法的选择压力下动态地进化的白血病前期和白血病克隆的多克隆基因组结构(bloomfield cd等人,blood revs.2018；32:416-425)。
5.使用阿糖胞苷和蒽环类抗生素(“7 3”)的诱导化疗已经成为患有新诊断的aml的受试者的标准护理超过四十年。
6.近年来，美国食品和药物管理局批准了五种另外的药物用于治疗aml：米哚妥林、依那替尼(enasidenib)、cpx-351、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(bloomfield cd等人,blood revs.2018；32:416-425)和艾伏尼布(ivosidenib)(megias-vericat j等人,blood lymph.cancer:targets and therapy2019；9:19-32)。
7.可以预期约60％-70％的患有aml的成人在适当的诱导疗法后达到完全缓解(cr)状态，并且可以预期超过25％的患有aml的成人(约45％的达到cr的那些)可以存活3年或更长时间，并且可以治愈。
8.然而，在7-14％的aml受试者中观察到idhl抗性突变，并且相关的高2-hg水平可以产生表观遗传超甲基化表型和分化阻断，导致白血病发生(megias-vericat j等人,blood lymph.cancer:targets and therapy 2019；9:19-3)。此外，在大约三分之一的aml受试者中观察到flt3激酶中的突变(lee hj等人,oncotarget 2018；9:924-936)。
9.因此，仍然需要替代的突变idh相关癌症疗法。
10.某些突变体idh1和idh2抑制剂公开在wo 2018/111707 al中，包括本文定义为“化合物a”的化合物，其为突变体idh1的共价抑制剂，其修饰变构结合袋中的单一半胱氨酸(cys269)，快速使酶失活，并且选择性地抑制2-hg产生，而不影响(α-kg)水平(wo 2018/111707 a1)。
11.本发明提供一种治疗癌症的方法，其包括向具有idh突变的人类癌症受试者施用治疗有效量的(a)式i的第一化合物：
[0012][0013]
其中：
[0014]
r1为-ch2ch(ch3)2、-ch2ch3、-ch2ch2och3或
–
ch
2-环丙基；
[0015]
r2为-ch3或-ch2ch3；且
[0016]
x为n或ch；
[0017]
或其药学上可接受的盐；以及
[0018]
(b)一种或多种第二化合物，为抗代谢剂或其药学上可接受的盐；低甲基化剂(hypomethylating agent)或其药学上可接受的盐；和突变体flt3抑制剂或其药学上可接受的盐。
[0019]
在一个实施方案中，idh突变为idh1突变或idh2突变。在另一个实施方案中，idh突变为idh1突变。在另一个实施方案中，idh1突变为idh1 r132突变。在另一个实施方案中，idh1突变为r132h。在另一个实施方案中，idh1突变为r132c、r132g、r132l或r132s。在另一个实施方案中，idh1 r132突变为r132h。在另一个实施方案中，idh1突变为r132c。在另一个实施方案中，idh1突变为r132g。在另一个实施方案中，idh1突变为r132l。在另一个实施方案中，idh1突变为r132s。
[0020]
在另一个实施方案中，idh突变为idh2突变。在另一个实施方案中，idh2突变为idh2 r140突变或idh2 r172突变。在另一个实施方案中，idh2突变为r140突变。在另一个实施方案中，r140突变为r140q、r140l或r140w。在另一个实施方案中，idh2突变为r172突变。在另一个实施方案中，r172突变为r172k、r172m、r172g、r172s或r172w。
[0021]
在本发明方法的一个实施方案中，在式i的第一化合物或其药学上可接受的盐中，x为n。在另一个实施方案中，在第一化合物或其药学上可接受的盐中，x为n，r1为
–
ch
2-环丙基，且r2为-ch2ch。在另一个实施方案中，在第一化合物中，x为n，r1为
–
ch
2-环丙基，且r2为-ch2ch3。
[0022]
在另一个实施方案中，第一化合物为：
[0023]
7-[[(1s)-1-[4-[(1r)-2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；
[0024]
7-[[(1s)-1-[4-[(1s)-2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；或
[0025]
1-乙基-7-[[(1s)-1-[4-[1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)丙基]苯基]乙基]氨基]-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；
[0026]
或其药学上可接受的盐。
[0027]
在另一个实施方案中，第一化合物为7-[[(1s)-1-[4-[(1s)-2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮。
[0028]
在另一个实施方案中，第一化合物为：
[0029][0030]
或其药学上可接受的盐。
[0031]
在另一个实施方案中，第一化合物为化合物a。
[0032]
在另一个实施方案中，受试者被鉴定为具有idh1突变，例如r132 idh1突变。在另一个实施方案中，受试者被鉴定为具有idh2突变，例如idh2 r172、r140或r172突变。在另一个实施方案中，受试者被鉴定为在组织中具有idh突变。
[0033]
在另一个实施方案中，癌症为血液学恶性肿瘤，并且受试者被鉴定为在血液、骨髓、淋巴结或淋巴液中具有idh突变。在另一个实施方案中，受试者被鉴定为在血细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞或淋巴液细胞中具有idh突变。
[0034]
在另一个实施方案中，癌症为实体瘤癌症，并且受试者被鉴定为在实体瘤组织中具有idh1突变。在另一个实施方案中，受试者被鉴定为在实体瘤组织细胞中具有idh突变。
[0035]
在另一个实施方案中，在施用突变体flt3抑制剂之前，人受试者已被鉴定为具有flt3突变。在另一个实施方案中，flt3突变为flt3内部串联(tandem)(flt3-itd)突变。在另一个实施方案中，flt3突变为flt3酪氨酸激酶结构域(flt3-tkd)突变。在另一个实施方案中，flt3突变为flt3 d835突变。
[0036]
在另一个实施方案中，第一化合物或其药学上可接受的盐在第二化合物或其药学上可接受的盐之前施用。
[0037]
在另一个实施方案中，第一化合物或其药学上可接受的盐在第二化合物或其药学上可接受的盐之后施用。
[0038]
在另一个实施方案中，第一化合物或其药学上可接受的盐与第二化合物或其药学上可接受的盐共同配制。
[0039]
在本发明方法的另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤癌症。在另一个实施方案中，所述实体瘤癌症为胆管癌(cholangiocarcinoma)、头颈癌、软骨肉瘤、肝细胞癌、黑素瘤、胰腺癌、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌或鼻腔鼻窦未分化癌(sinonasal undifferentiated carcinoma)。在另一个实施方案中，肺癌为非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，肺癌为非小细胞肺癌，并且还施用α-kr g12c抑制剂和/或egfr抑制剂。在另一个实施方案中，所述实体瘤癌症为胆管癌。在另一个实施方案中，还向受试者施用放射疗法。
[0040]
在另一个实施方案中，所述癌症为血液学恶性肿瘤。在另一个实施方案中，血液学恶性肿瘤是aml(acute myeloid leukemia)、骨髓增生异常综合征骨髓增生性肿瘤、血管免疫母细胞性t-细胞淋巴瘤、t-细胞型急性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症(essential thrombocythemia)、原发性骨髓纤维化或慢性髓性白血病。在另一个实施方案中，所述血液
学恶性肿瘤为aml。
[0041]
在本发明方法的另一个实施方案中，第二化合物为抗代谢剂或其药学上可接受的盐。在本发明方法的另一个实施方案中，抗代谢剂为阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶(5-fu)、6-巯嘌呤(6-mp)、卡培他滨、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞或光氨蝶呤(phototrexate)，或它们中任一种的药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，抗代谢药剂为阿糖胞苷或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，抗代谢药剂为阿糖胞苷。在另一个实施方案中，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿糖胞苷。在另一个实施方案中，所述癌症为aml，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿糖胞苷。在另一个实施方案中，所述癌症为胆管癌，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿糖胞苷。
[0042]
在本发明方法的另一个实施方案中，第二化合物为低甲基化剂或其药学上可接受的盐。在本发明方法的另一个实施方案中，低甲基化剂为阿扎胞苷(azacitidine)(5-阿扎胞苷)、5-氮杂-2'-脱氧胞二磷胆碱(citidine)(地西他滨/decitabine)、瓜地西他滨(guadecitabine)(sgi-110)、5-氟-2'-脱氧胞二磷胆碱、西博拉林(zebularine)、cp-4200、rg108、七尾霉素a(nanaomycin a)或它们中任一种的药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，低甲基化剂为阿扎胞苷或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，低甲基化剂为阿扎胞苷。在另一个实施方案中，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿扎胞苷。在另一个实施方案中，所述癌症为aml，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿扎胞苷。在另一个实施方案中，所述癌症为胆管癌，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为阿扎胞苷。
[0043]
在另一个实施方案中，式i的第一化合物或其药学上可接受的盐与低甲基化剂或其药学上可接受的盐和bcl-2抑制剂或其药学上可接受的盐一起施用。在另一个实施方案中，式i的第一化合物与低甲基化剂和bcl-2抑制剂一起施用。在另一个实施方案中，bcl-2抑制剂为维奈托克(venetoclax)、奥巴克拉(obatoclax)、纳维托克(navitoclax)或它们中任一种的药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，bcl-2抑制剂为维奈托克或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，bcl-2抑制剂为维奈托克。在另一个实施方案中，化合物a与低甲基化剂和bcl-2抑制剂一起施用。在另一个实施方案中，化合物a与阿扎胞苷和维奈托克一起施用。在另一个实施方案中，所述癌症为aml，并且化合物a与阿扎胞苷和维奈托克一起施用。在另一个实施方案中，所述癌症为胆管癌，并且化合物a与阿扎胞苷和维奈托克一起施用。
[0044]
在本发明方法的另一个实施方案中，第二化合物是突变体flt3抑制剂或其药学上可接受的盐。在本发明方法的另一个实施方案中，突变体flt3抑制剂为米哚妥林、吉特替尼(gilteritinib)、奎扎替尼(quizartinib)(ac220)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、来妥替尼(lestaurtinib)或克莱拉尼(crenolanib)，或它们中任一种的药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，突变体flt3抑制剂是米哚妥林或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，突变体flt3抑制剂为米哚妥林。在另一个实施方案中，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为米哚妥林。在另一个实施方案中，所述癌症为aml，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为米哚妥林。在另一个实施方案中，所述癌症为胆管癌，第一化合物为化合物a，并且第二化合物为米哚妥林。
[0045]
在本发明方法的另一个实施方案中，化合物a与抗代谢剂和低甲基化剂一起施用。
[0046]
在本发明方法的另一个实施方案中，化合物a与抗代谢药剂和突变体flt3抑制剂一起施用。
[0047]
在本发明方法的另一个实施方案中，化合物a与低甲基化剂和突变体flt3抑制剂一起施用。
[0048]
在本发明方法的另一个实施方案中，化合物a与抗代谢剂、低甲基化剂和突变体flt3抑制剂一起施用。
[0049]
本发明还提供了式i的化合物：
[0050][0051]
其中：
[0052]
r1为-ch2ch(ch3)2、-ch2ch3、-ch2ch2och3或
–
ch
2-环丙基；
[0053]
r2为-ch3或-ch2ch3；且
[0054]
x为n或ch；
[0055]
或其药学上可接受的盐；
[0056]
用于与一种或多种抗代谢药剂或其药学上可接受的盐；低甲基化剂或其药学上可接受的盐；或突变体型flt3抑制剂或其药学上可接受的盐组合，用于治疗具有idh突变的人类受试者的癌症。
[0057]
在一个实施方案中，受试者被鉴定为在血液、骨髓、淋巴结、淋巴液、血细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞或淋巴液细胞中具有idh突变，例如idh1或id2突变。
[0058]
在另一个实施方案中，式i的化合物与低甲基化剂(例如阿扎胞苷)或其药学上可接受的盐和bcl-2抑制剂或其药学上可接受的盐组合用于治疗鉴定为具有idh1 r132突变的人类受试者的癌症。
[0059]
在一个实施方案中，idh突变为idh1突变或idh2突变。在另一个实施方案中，idh突变为idh1突变。在另一个实施方案中，idh1突变为idh1 r132突变。在另一个实施方案中，idh1突变为r132h、r132c、r132g、r132l或r132s。在另一个实施方案中，idh1 r132突变为r132h。在另一个实施方案中，idh1突变为r132c。在另一个实施方案中，idh1突变为r132g。在另一个实施方案中，idh1突变为r132l。在另一个实施方案中，idh1突变为r132s。
[0060]
在另一个实施方案中，idh突变为idh2突变。在另一个实施方案中，idh2突变为idh2 r140突变或idh2 r172突变。在另一个实施方案中，idh2突变为r140突变。在另一个实施方案中，r140突变为r140q、r140l或r140w。在另一个实施方案中，idh2突变为r172突变。在另一个实施方案中，r172突变为r172k、r172m、r172g、r172s或r172w。
[0061]
在一个实施方案中，受试者被鉴定为具有idh突变，例如idh1或idh2突变。
[0062]
对于所使用的式i化合物，优选x为n，或其药学上可接受的盐；优选r1为
–
ch
2-环丙基，或其药学上可接受的盐；优选r2为-ch2ch3，或其药学上可接受的盐；优选x为n且r1为
–
ch
2-环丙基，或其药学上可接受的盐；优选r1为
–
ch
2-环丙基且r2为-ch2ch3，或其药学上可接受的盐；更优选x为n，r1为
–
ch
2-环丙基且r2为-ch2ch3，或其药学上可接受的盐；最优选x为n，r1为
–
ch
2-环丙基且r2为-ch2ch3。
[0063]
优选的化合物为：
[0064]
7-[[(1s)-1-[4-[(1r)-2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；
[0065]
7-[[(1s)-1-[4-[(1s)-2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-1-乙基-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；或
[0066]
1-乙基-7-[[(1s)-1-[4-[1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)丙基]苯基]乙基]氨基]-4h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮；
[0067]
或其药学上可接受的盐。
[0068]
在另一个实施方案中，第一化合物为：
[0069][0070]
(化合物a)或其药学上可接受的盐。
[0071]
在另一个实施方案中，第一化合物为化合物a。
[0072]
本文提供了使用式i化合物与一种或多种抗代谢剂、低甲基化剂或突变体flt3抑制剂的组合来治疗癌症的新方法。因此，本发明的一些方面提供了式i的化合物，其用于与抗代谢剂、低甲基化剂或突变体flt3抑制剂中的一种或多种同时、分开或依次组合用于治疗具有idh突变(例如idh1或idh2突变)的受试者的癌症。此外，本发明的一些方面提供了式i的化合物，其用于与抗代谢剂、低甲基化剂或突变体flt3抑制剂中的一种或多种同时、分开或依次组合用于治疗实体瘤癌症。另外，本发明的一些方面提供了式i的化合物，其用于与抗代谢剂、低甲基化剂或突变体flt3抑制剂中的一种或多种同时、分开或依次组合用于治疗血液学恶性肿瘤。本发明的另一个方面提供了式i的化合物，其用于与低甲基化剂和bcl-2抑制剂同时、分开或依次组合用于治疗被鉴定为具有idh突变(例如idh1或idh2突变)的受试者的癌症。
[0073]
在一个实施方案中，idh突变为idh1突变或idh2突变。在另一个实施方案中，idh突变为idh1突变。在另一个实施方案中，idh1突变为idh1 r132突变。在另一个实施方案中，idh1突变为r132h、r132c、r132g、r132l或r132s。在另一个实施方案中，idh1 r132突变为r132h。在另一个实施方案中，idh1突变为r132c。在另一个实施方案中，idh1突变为r132g。在另一个实施方案中，idh1突变为r132l。在另一个实施方案中，idh1突变为r132s。
[0074]
在另一个实施方案中，idh突变为idh2突变。在另一个实施方案中，idh2突变为idh2 r140突变或idh2 r172突变。在另一个实施方案中，idh2突变为r140突变。在另一个实施方案中，r140突变为r140q、r140l或r140w。在另一个实施方案中，idh2突变为r172突变。在另一个实施方案中，r172突变为r172k、r172m、r172g、r172s或r172w。
[0075]
本发明还提供了包含式i的化合物的药物组合物，其用于与以下中的一种或多种组合使用：抗代谢剂或其药学上可接受的盐；低甲基化剂或其药学上可接受的盐；或突变体flt3抑制剂或其药学上可接受的盐，以治疗被鉴定为具有idh突变的人类受试者的癌症。在一个实施方案中，在血细胞、骨髓细胞或血液和骨髓细胞中鉴定了idh突变。
[0076]
本发明还提供了式i的化合物在制备用于治疗具有idh突变(例如idh1或idh2突变)的人受试者的癌症的药物中的用途。在一个实施方案中，受试者被鉴定为在血液、骨髓、淋巴结、淋巴液、血细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞或淋巴液细胞中具有idh突变，其中用于制备药物的式i的化合物与一种或多种抗代谢剂或其药学上可接受的盐；低甲基化剂或其药学上可接受的盐；或突变体flt3抑制剂或其药学上可接受的盐组合施用。
[0077]
在本发明的方法或用于本发明的用途的化合物的一个实施方案中，所述癌症为一线(frontline)癌症。在另一个实施方案中，所述一线癌症为实体瘤癌症。在另一个实施方案中，所述一线癌症为血液学恶性肿瘤。在另一个实施方案中，所述一线血液学恶性肿瘤为一线aml。
[0078]
在本发明的方法或用于本发明用途的化合物的另一个实施方案中，所述癌症为复发性癌症。在另一个实施方案中，所述复发性癌症为实体瘤癌症。在另一个实施方案中，所述复发性癌症为血液学恶性肿瘤。在另一个实施方案中，所述复发性血液学恶性肿瘤为复发性aml。
[0079]
在本发明的方法或用于本发明用途的化合物的另一个实施方案中，所述癌症为难治性癌症。在另一个实施方案中，所述难治性癌症为实体瘤癌症。在另一个实施方案中，所述难治性癌症为血液学恶性肿瘤。在另一个实施方案中，所述难治性血液学恶性肿瘤为难治性aml。
[0080]
在本发明的方法或用于本发明用途的化合物的另一个实施方案中，所述癌症为晚期癌症。在另一个实施方案中，所述晚期癌症为晚期实体瘤癌症。在另一个实施方案中，所述晚期癌症为晚期血液学恶性肿瘤。在另一个实施方案中，所述晚期血液学恶性肿瘤为晚期aml。
[0081]
在另一个实施方案中，aml为急性早幼粒细胞白血病。
[0082]
用于测定突变体idh1酶活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在wo 2018/111707 al中。
[0083]
如上文所用，并且在贯穿于本发明的描述中，除非另有说明，否则以下术语应理解为具有如下含义：
[0084]
术语“血液学组织”是指血液、骨髓、脾、淋巴结或淋巴液。
[0085]
术语“实体瘤组织”是指不是血液学组织的组织。实体组织的非限制性实例为胆管组织、胰腺组织、头部组织、颈部组织、肝组织、皮肤组织、星形细胞瘤组织、少突胶质(oligodendroglial)组织、神经胶质组织、脑组织、膀胱组织、结肠直肠组织、肺组织和鼻腔鼻窦未分化癌组织。
[0086]
术语“实体瘤癌症”意指起源于非血液或骨髓的组织中的癌症。
[0087]
术语“血液学恶性肿瘤”涉及血液、骨髓、淋巴结或淋巴液中的癌症。
[0088]
术语“一线癌症”意指人类癌症受试者从未针对所治疗的癌症进行治疗。
[0089]
术语“难治性癌症”是指已经治疗、但人类癌症受试者对治疗无反应的癌症。
[0090]
术语“复发性癌症”是指人类癌症受试者对治疗有反应一段时间期限，但该癌症已复发。
[0091]
术语“晚期癌症”是指已经扩散到淋巴结或扩散到癌症起源点之外的其他组织的癌症。例如，aml是已经扩散到血液或骨髓外的组织的aml。
[0092]
术语“癌症受试者”是指已被诊断患有癌症的受试者。
[0093]
术语“实体瘤受试者”是指已被诊断患有实体瘤癌症的受试者。在一个实施方案中，实体瘤癌症为胆管癌。
[0094]
术语“血液学恶性肿瘤受试者”是指已被诊断患有血液学恶性肿瘤的受试者。在一个实施方案中，血液学恶性肿瘤受试者为aml受试者。术语“aml受试者”是指已被诊断患有aml的受试者。用于诊断aml的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在dohner h等人,blood 2017；129:424-447中。
[0095]
术语“急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)”、“急性髓性白血病(acute myelogenous leukemia)”和“急性非淋巴细胞白血病”是同义的。
[0096]“对血液学恶性肿瘤(例如aml)治疗的反应性”包括改善的总体存活、部分反应、长期稳定疾病，或长期存活的改善，特征在于完全缓解(通过如下确定：骨髓中小于5％的成髓细胞、不存在循环母细胞)、血液学恢复(根据外周血绝对中性粒细胞计数大于1,000个细胞/μl和血小板计数大于100,000/μl证明，不需要红细胞输注，并且不存在髓外疾病)(bloomfield cd等人,blood revs.2018；32:416-425)。
[0097]
术语“idh1 r132突变”与“r132 idh1突变”同义，并且是指受试者的idh1基因中氨基酸残基132处的idh1突变，如例如在受试者的核酸(例如dna)中确定的。
[0098]
术语“flt3突变”是指受试者的flt3基因中的突变。
[0099]
术语“突变体idh抑制剂”是指化合物，其抑制突变体idh酶活性，和/或抑制突变体idh酶的2-hg生成。用于测定突变体idh1和突变体idh2酶活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在wo 2018/111707 a1中。在术语“突变体idh抑制剂”中，词语“突变体”是指idh基因，而不是抑制剂。
[0100]
术语“突变体flt3抑制剂”是指抑制突变型f13激酶活性的化合物。用于测定突变体flt3活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在lee hj等人,oncotarget 2018；9:924-936中。在术语“突变体flt3抑制剂”中，词语“突变体”是指flt3蛋白，而不是指抑制剂化合物。
[0101]
术语“鉴定为具有idh突变”，例如idh1或idh2突变，意指已经分析了来自人类受试者的组织或细胞的核酸(例如dna)以确定人类受试者是否具有idh突变。在一个实施方案中，已经分析了人类受试者的血液、骨髓、淋巴结、淋巴液、血细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞或淋巴液细胞的idh突变。在另一个实施方案中，已经分析了人类受试者的实体组织的idh突变。
[0102]
术语“bcl-2抑制剂”是结合bcl-2并导致癌细胞中的细胞毒性、癌细胞中bcl-2表达的下调、癌细胞中的线粒体功能障碍和癌细胞中的细胞凋亡的化合物。用于确定那些效应的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在wen m等人,front.pharmacol.2019；10:391中。
[0103]
在本发明方法的一个实施方案中，将人类受试者鉴定为具有idh1 r132突变的一方可以与施用第一和第二化合物的一方不同。在另一个实施方案中，将人类受试者鉴定为具有idh1 r132突变的一方与施用第一和第二化合物的一方不同。在另一个实施方案中，将人类受试者鉴定为具有idh1 r132突变的一方与施用第一和第二化合物的一方相同。
[0104]
术语“鉴定为具有flt3突变”意指已经分析了来自人受试者的血细胞、骨髓细胞、
或血细胞和骨髓细胞的核酸(例如dna)以确定人受试者是否具有一种或多种flt3突变。
[0105]
用于鉴定idh1和flt3突变的分析方法是本领域普通技术人员已知的(clark,o.等人,clin.cancer.res.2016；22:1837-42)，包括但不限于核型分析(karyotyping)(guller jl等人,j.mol.diagn.2010；12:3-16)、荧光原位杂交(yeung dt等人,pathology 2011；43:566-579)、sanger测序(lutha,r等人,haematologica 2014；99:465-473)、代谢谱(miyata s等人,scientific reports 2019；9:9787)、聚合酶链反应(ziai,jm和aj siddon,am.j.clin.pathol 2015；144:539-554)和下一代测序(例如全转录组测序)(lutha,r等人,haematologica 2014；99:465-473；wang h-y等人,j.exp.clin.cancer res.2016；35:86)。
[0106]
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”、“治疗(treating)”等意在包括减缓、停止或逆转癌症的进展。这些术语还包括缓解、改善、减弱、消除或减少病症或病况的一种或多种症状，即使癌症实际上没有得到消除并且即使癌症的进展本身没有得到减缓、停止或逆转
[0107]“治疗有效量”是指施用于受试者的化合物或其药学上可接受的盐的量，其将引起受试者的生物或医学反应或对受试者的期望的治疗效果。
[0108]
作为本领域技术人员，主治医师可以通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果容易地确定治疗有效量。在确定受试者的有效量时，主治医师考虑许多因素，包括但不限于：个体受试者的体型、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的涉及程度或严重程度；个体受试者的反应；所施用的具体化合物；施用方式；施用的制剂的生物利用度特征；所选择的剂量方案；使用的伴随药物；以及其他相关情况。
[0109]
术语“与......组合”意指在癌症的治疗中使用式i的化合物或式i的化合物用于同时、单独或依次组合任何一种或多种抗代谢剂或其药学上可接受的盐；低甲基化剂或其药学上可接受的盐，任选地与bcl-2抑制剂或其药学上可接受的盐组合；或突变体flt3抑制剂或其药学上可接受的盐，用于治疗具有idh突变的人类受试者的癌症。
[0110]
本发明的方法施用的化合物可以任选地配制成药物组合物，其通过使化合物生物可利用的任何途径施用。在一个实施方案中，此类组合物配制用于口服施用。此类药物组合物及其制备方法是本领域众所周知的。(参见例如remington:the science and practice of pharmacy(d.b.troy,editor,第21版,lippincott,williams&wilkins,2006)。
[0111]“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”为本领域通常接受的、用于将生物活性剂递送至哺乳动物(例如人)的介质。
[0112]
本领域普通技术人员将理解，在本发明方法中施用的化合物能够成盐。化合物与许多无机酸和有机酸中的任一种反应以形成药学上可接受的酸加成盐。此类药学上可接受的酸加成盐和制备它们的常用方法为本领域众所周知的。参见例如p.stahl等人,handbook of pharmaceutical salts:properties,selection and use,(vcha/wiley-vch,2008)。
[0113]“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本发明化合物的相对无毒性的一种或多种无机或有机盐(s.m.berge等人,“pharmaceutical salts”,journal of pharmaceutical sciences,第66卷,第1期,1977年1月)。
[0114]
材料和方法
[0115]
化合物和制剂：对于体内研究，用媒介物以适当的浓度制备每种测试制品。对于体内研究，将化合物a配制在具有1.1摩尔当量hcl的阿拉伯胶(acacia)媒介物(水，10％阿拉
伯胶，0.05％消泡剂[dow corning 1510-us])中。每7天用媒介物以适当浓度新鲜制备化合物a，并在给药之间在4℃下储存。将米哚妥林(medchem express,批次/批号lot#23950)配制在20％peg400水溶液中，并每周新鲜制备(在给药之间储存在4℃下)。阿糖胞苷通过用无菌盐水从阿糖胞苷的储备溶液(注射剂20mg/ml,(pfizer注射剂))稀释每周新鲜制备。在无菌水中配制阿扎胞苷(sigma，批号mkbr7212)，并在给药前立即每天新鲜制备。
[0116]
体内人aml pdx模型：在将原代人aml细胞尾静脉注射到雌性nod scidγ(nsg,nod.cg-prkdcscid il2rgtm1wjl/szj[jackson labs#005557])小鼠(6至7周龄)中后建立aml模型。在研究中使用两种模型：1)idh1(r132h)、nras(q61h)原发性人aml和(2)idh1(r132h)、flt3-itd原发性人aml。根据需要，如所述的，使用来自荷瘤小鼠的脾细胞繁殖和扩增模型。如上所述，用媒介物以适当的浓度制备每种测试制品，以10μl/克体重的给药体积给予动物在本研究中测试的剂量。在本研究期间，以指定剂量处理接受化合物a(po，qd)的小鼠。组合药剂的给药如下：米哚妥林50mg/kg po，qd(53天，在化合物a剂量开始后7天开始)，阿糖胞苷2mg/kg ip[(qd
×
5，休息2)
×
2]休息14d并重复(2个周期，在化合物a剂量开始时开始)，阿扎胞苷1mg/kg ip[(qd
×
5，休息2)
×
2]休息14d并重复(2个周期，在化合物a剂量开始时开始)。与媒介物处理的和无处理()(无肿瘤)对照小鼠相比，评估处理的小鼠。每周记录体重两次。在研究过程中通过颌下出血每两周将全血样品(《100μl)收集到k-edta血液收集管中，并通过facs进行分析，以监测研究小鼠中的分化状态和白血病负荷(在研究过程中定期采集血浆用于2-hg分析)。对于血浆采集，对于每个受试者，将50至70μl全血等分到1.5ml微量离心管中，并以300x g旋转8分钟(4℃)。收集10μl血浆并转移到新的1.5ml微量离心管中，并在-80℃冷冻用于2-hg lcms分析。通过使用来自作为对照的媒介物处理的和未处理的小鼠的血浆，评估血浆2-hg，来监测2-hg产生的抑制。对于流式细胞术，采集50-70μl全血，每管加入60μl染色/洗涤缓冲液(在dpbs(hyclone sh30028)中的5％热灭活的(hi)-fbs(v/v)(invitrogen 10082)，通过移液管上下混合3至4次，并将100μl血液悬浮液转移至5ml聚丙烯管，如下所述染色和分析。
[0117]
aml pdx模型繁殖：在患者来源的idh1(r132h)白血病模型中，通过全血样品的流式细胞术，鉴定植入人idh1(r132h)aml细胞的小鼠具有晚期疾病进展。处理脾脏和如下所述分离的脾细胞。将200μl/受试者脾细胞制备物iv(静脉内，尾静脉)注射到受体nsg小鼠中。(10e
6-25e6个活白细胞/ml，每只小鼠2e
6-5e6用于繁殖模型)。通过流式细胞术分析监测进展，每四周一次，直到在外周血中鉴定出aml(》0.2％人aml细胞(总白细胞(wbc)的％hcd33 hcd45 ))。一旦确认植入，则每两周监测小鼠直至准备进行研究。将小鼠随机分组，并且当(总wbc的)平均％人aml达到2-8％时开始研究。收集下颌下血液。
[0118]
脾/脾细胞处理和制备：切除后，称重脾脏，将脾脏的3/4置于含有pbs的标准无菌15ml聚丙烯锥形管中，并置于冰上。将脾脏的剩余1/4固定在10％nbf中并递送至病理学检查。将脾置于15ml收集管中的冰冷无菌pbs中。将脾从收集管中取出并置于100微米50ml锥形管细胞过滤器(bd falcon#352360)中。通过用5ml注射器柱塞的末端以圆周运动将脾组织相对于细胞过滤器的表面轻轻摩擦来处理脾。在该过程中，用10ml室温无菌dpbs(hyclone sh30028)冲洗过滤器的表面3次。在没有完整的脾组织可见后，进行过滤器的最终冲洗，并使用10ml无菌血清移液管将细胞制备物上下混合15次。通过离心(300
×
g)收集细胞沉淀，并用30ml无菌dpbs洗涤三次。将细胞计数并以期望的植入物浓度重悬于dpbs中。
[0119]
骨髓采集：使用含有1ml pbs的1ml注射器的27g至25g针头从胫骨和股骨采集骨髓。
[0120]
人白细胞的流式细胞术分析：收集来自体内研究的下颌下血液样品。根据制造商的说明书添加荧光剂缀合的抗体染色剂(抗-人cd33-pe(克隆wm53，bd目录号555450)、抗-人cd14-apc(克隆bd目录号340436)、抗-人cd15-v450(克隆hi98，bd目录号561584)、抗-人cd117-bv421(克隆yb5.b8，bd目录号562434)、抗-人cd11b-apccy7(克隆icrf44，bd目录号557754)、抗-人cd45-pecy7(克隆hi30，bd目录号557748)和抗-人cd3-fitc(克隆sk7，bd目录号340542))。将样品在室温下避光孵育30分钟。孵育后，向每个样品中加入1.5ml 1x bd lyse/fix(37℃，(bd#558049))并在室温孵育12分钟。将管以300
×
g离心7分钟。抽吸bd lyse/fix溶液，并用染色/洗涤缓冲液洗涤细胞沉淀3次(1次洗涤步骤由以下组成：将沉淀重悬于3ml染色/洗涤缓冲液中，以300x g离心，抽吸洗涤)。然后将固定的细胞重悬于300至400μl染色/洗涤缓冲液中。使用标准流式细胞术原理和技术在becton dickinson facsverse流式细胞仪(目录号651155系列号z6511550447)上分析样品。在染色和固定样品的同一天分析样品。在facsverse细胞计数器上、用facsuite软件进行群体门控和群体百分比的数据分析。在graphpad prism或jmp13中绘制来自数据分析的群体百分比值。如果动物死于疾病或者如果在任何给定的一天由于技术原因不能获得血液，则该天将不存在数据点，因此不确定(nd)。
[0121]
aml pdx模型的血浆中的lc-ms代谢物分析：通过血浆的液相色谱-质谱(lc-ms)分析，确定idh1抑制对总2-hg和α-kg浓度的影响。通过将2-hg和α-kg掺入水中来制备校准曲线。在通过lc-ms分析之前，该方法利用o-苄基羟胺衍生化。将10微升每种标准品或样品置于深孔96-孔板中，并与100μl含有10μm d5-3-羟基戊二酸和10μm d6-α-kg的内标溶液合并。然后用210μl 4:3甲醇:氯仿处理血浆样品，离心，除去上清液并干燥。向每个样品中加入100ul的1m o-苄基-羟胺的吡啶缓冲液(8.6％吡啶，ph 5)和100ul的1m n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)的吡啶缓冲液。衍生化反应在室温下进行1小时。使用beckman biomek fx液体处理器，向每个样品中加入300μl乙酸乙酯。将板密封并涡旋5分钟，然后在eppendorf 5810r离心机中以4000rpm离心5分钟。将220μl上层转移到新的96-孔板中。将样品在50℃下在加热氮气下干燥，并用100μl甲醇/水(1:1)重构。将1微升衍生化样品注射到由shimadzu prominence 20a hplc系统和thermo quantum ultra
tm
三重四极质谱仪组成的lc-ms系统上。在water xbridge
tm c18柱(2.1x 50mm,3.5μm)上以0.6ml/分钟的流速分离分析物。流动相a是0.1％甲酸水溶液，流动相b是甲醇。梯度曲线为：0分钟，5％b；2分钟，100％b；4.00分钟，100％b；4.1分钟，5％b；5.50分钟，停止。质谱仪利用以正离子选择反应监测模式操作的hesi-ii探头。通过绘制分析物浓度对分析物/内标峰面积比并使用1/浓度加权、用xcalibur
tm
软件进行数据的二次拟合来构建校准曲线。未知物的分析物浓度根据校准曲线反向计算。
[0122]
统计方法
[0123]
组合分析方法(combination analysis method)(用于ivef研究的bliss independence)可以用于分析结果。将通常的重复测量模型拟合至对数体积vs.组和时间。对比陈述用于测试使用组合的两种特定治疗在每个时间点的相互作用效应。这相当于bliss independence方法，并且假设肿瘤体积在理论上可以达到零，即完全消退。
[0124]
组合的预期累加响应(ear)在肿瘤体积标度上计算为：响应(ear)ear体积＝v1*v2/v0，其中v0、vi和v2分别是媒介物对照、单独的处理1和单独的处理2的估计平均肿瘤体积。如果相互作用测试是显著的，则根据观察到的组合平均体积分别小于或大于ear体积，在统计学上宣布组合效应大于累加或小于累加。否则，统计结论是累加的。
[0125]
如果停滞是最佳预期响应，则可以将bliss方法直接应用于％δt/c值，以获得ear百分比响应：ear％δt/c＝y1*y2/100，其中y1和y2是单一药剂处理的百分比δt/c值。
[0126]
1.化合物a和阿糖胞苷的组合
[0127]
在基本上如上所述进行的实验中，对于化合物a和阿糖胞苷的组合获得了表1a-1d中的结果。
[0128][0129]
每列是来自一只动物的数据。
[0130]
在第47天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(86％)；b：化合物a(39％)；c:阿糖胞苷(5.2％)；和e：化合物a 阿糖胞苷(0.48％)(p《0.001)。
[0131][0132]
每列是来自一只动物的数据。
[0133]
在第47天，对于每个相应的治疗组，aml细胞分化％为：a:媒介物(10％)；b：化合物a(37％)；c：阿糖胞苷(8％)；和e：化合物a 阿糖胞苷(71％)(p《0.001)。
[0134][0135]
对于每个相应的治疗组，％骨髓aml清除率为：a:媒介物(94％)；b：化合物a(78％)；c：阿糖胞苷(63％)；和化合物a 阿糖胞苷(14％)(p＝0.0011)。
[0136]
[0137][0138]
对于每个相应的治疗组，％血浆2-hg为：a:媒介物(100％)；b：化合物a(3.4％)；c：阿糖胞苷(24％)；和e：化合物a 阿糖胞苷(11％)(p＝0.0004)。
[0139]
总之，化合物a和阿糖胞苷的组合在骨髓和外周均增强了对aml的抑制。
[0140]
2.化合物a和阿扎胞苷的组合
[0141]
在基本上如上所述进行的实验中，对于化合物a和阿扎胞苷的组合获得了表2a-2d中的结果。
[0142]
[0143][0144]
每列是来自一只动物的数据。
[0145]
在第43天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(71％)；b：化合物a(52％)；g：阿扎胞苷(22％)；和h：化合物a 阿扎胞苷(9.7％)(p《0.023)。
[0146]
[0147][0148]
每列是来自一只动物的数据。
[0149]
在第43天，对于每个相应的治疗组，aml细胞分化％为：a:媒介物(15％)；b：化合物a(37％)；g：阿扎胞苷(10％)；和h：化合物a 阿扎胞苷(59％)(p《0.001)。
[0150]
[0151][0152]
对于每个相应的治疗组，％骨髓aml清除率为：a:媒介物(94％)；b：化合物a(87％)；g：阿扎胞苷(55％)；和h：化合物a 阿扎胞苷(19％)(p＝0.0032)。
[0153]
[0154][0155]
对于每个相应的治疗组，％血浆2-hg为：a:媒介物(100％)；b：化合物a(-15％)；g：阿扎胞苷(48％)；和h：化合物a 阿扎胞苷(-9.6％)(p＝0.1714)。
[0156]
总之，化合物a和阿扎胞苷的组合在骨髓和外周均增强了对aml的抑制。
[0157]
3.化合物a和米哚妥林的组合
[0158]
在基本上如上所述进行的实验中，对于化合物a和米哚妥林的组合获得了
[0159]
表3a-d中的结果。
[0160]
[0161][0162]
每列是来自一只动物的数据。
[0163]
在第50天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(32％)；b:1mg化合物a(37％)；f：米哚妥林(1.1％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(2.2％)(p＝0.473)。
[0164]
在第50天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(32％)；c:10mg化合物a(2.8％)；f：米哚妥林(1.1％)；和l:10mg化合物a 米哚妥林(0.6％)(p＝0.016)。
[0165]
在第64天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(67％)；b:1mg化
合物a(51％)；f：米哚妥林(2.2％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(1.3％)(p＝0.767)。
[0166]
在第64天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(67％)；c:10mg化合物a(1.1％)；f：米哚妥林(2.2％)；和l:10mg化合物a 米哚妥林(0.56％)(p《0.001)。
[0167]
在第78天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(129％)；b:1mg化合物a(65％)；f：米哚妥林(3.9％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(1.6％)(p＝0.829)。
[0168]
在第78天，对于每个相应的治疗组，血浆aml细胞％为：a:媒介物(129％)；c:10mg化合物a(0.66％)；f：米哚妥林(3.9％)；和l:10mg化合物a 米哚妥林(0.25％)(p《0.001)。
[0169]
[0170][0171]
每列是来自一只动物的数据。
[0172]
在第50天，对于每个相应的治疗组，aml细胞分化％为：a:媒介物(28％)；b:1mg化合物a(43％)；f：米哚妥林(33％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(81％)(p《0.001)。
[0173]
在第50天，对于每个相应的治疗组，aml细胞分化％为：a:媒介物(28％)；c:10mg化合物a(79％)；f：米哚妥林(33％)；和l:10mg化合物a 米哚妥林(80％)(p 0.776)。
[0174]
[0175][0176]
对于每个相应的治疗组，％骨髓aml清除率为：a:媒介物(86％)；b:1mg化合物a(90％)；f：米哚妥林(26％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(19％)(p＝0.828)。
[0177]
对于每个相应的治疗组，％骨髓aml清除率为：a:媒介物(86％)；c:10mg化合物a(2.3％)；f：米哚妥林(26％)；和l:1mg化合物a 米哚妥林(0.58％)(p＝0.906)。
[0178]
[0179][0180]
对于每个相应的治疗组，％血浆2-hg为：a:媒介物(100％)；b:1mg化合物a(38％)；f：米哚妥林(70％)；和i:1mg化合物a 米哚妥林(21％)(p＝0.789)。
[0181]
对于每个相应的治疗组，％血浆2-hg为：a:媒介物(100％)；c:10mg化合物a(9.2％)；f：米哚妥林(70％)；和l:10mg化合物a 10mg米哚妥林(6.8％)(p＝0.373)。
[0182]
总之，化合物a和米哚妥林的组合在骨髓和外周中均增强了对aml的抑制。