当归药材的质量双标可视化质量控制技术

1.本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及以当归对照药材为基准物质，建立一套不依赖于对照品，较为全面控制药材质量的方法，该方法稳定性、精密度良好，可以弥补目前当归药材质量控制的不足，能够为当归药材质量提升提供新思路。


背景技术：

2.当归药材来源于伞形科当归属植物angelic sinensis(oliv.)diels的干燥根，始载于《神农本草经》，又名干归、马尾当归、马尾归、云归、山民归等，是我国临床最常用中药之一，具补血活血和调经止痛的功效，有“血中之气药”“补血之要药”“妇科之良药”等称号，主要含有挥发油、有机酸、多糖、核苷类、氨基酸等多种类型的化合物，药用历史悠久，许多经典名方以其入药。甘肃作为当归道地产区历史悠久，南北朝时，医书记载当归产于陇西（今甘肃陇西至兰州一带）、黑水（今甘肃定西）、西川（今四川西部）。近年来，随着当归市场需求量的增加，种植面积在不断扩大，随着全球气候变暖，气温升高的大环境，当归传统主产区出现一定的变化，正在逐渐向西迁移，种苗质量良莠不齐，影响了当归药材生产健康发展；且当归的栽培历时长，优质种质的收集、选育工作相对滞后，品种退化严重，以上都可能是影响药材品质的重要因素。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明提供一种当归药材质-量双标控制方法。以当归对照药材为定性、定量的基准物质，采用高效液相色谱结合q-tof-ms技术，建立一套不依赖于对照品，较为全面科学地控制药材质量的方法。
4.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
5.本发明提供了一种当归药材质量控制标准的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1 基于对照药材的当归药材定性研究；步骤2 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究；步骤3 方法学考察。
6.进一步地，所述步骤1的具体步骤包括：（1）溶液的制备：取当归对照药材及供试药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇，称定质量，超声提取30 min（频率：40 khz），放冷，加甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm滤膜, 即得；（2）色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent poroshell 120 sb-c
18
，色谱柱规格为100 mm
×
4.6 mm，2.7 μm；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速0.6 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长254 nm下进行检测；进样量5 μl；（3）特征图谱的建立：每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将254 nm波长
下的图谱数据由分析检测仪器中导出获得8批供试药材的hplc叠加图谱；8批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对；（4）相似度评价：以特征峰的相似度明确当归药材真伪。样品与对照药材的相似度均大于0.98；（5）特征峰化学成分解析：采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出6个化学成分；（6）中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序：利用visual basic编程语言设计包含1个oel控件和4个command控件的适用于当归药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制程序。
7.更进一步地，所述（5）中鉴定出6个化学成分分别为：（4）号峰为绿原酸、（6）号峰为阿魏酸、（7）号峰为洋川芎内酯i、（11）号峰为欧前胡素、（14）号峰为藁本内酯和（15）号峰为欧当归内酯。
8.进一步地，所述步骤2的具体步骤包括：以步骤1中确定的（6）号峰“阿魏酸”作为内标物质，通过内标物质化学成分准确定量，计算8批供试药材特征峰化学成分的相对含量；取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限。
9.进一步地，所述步骤2的特征峰均为当归发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。
10.进一步地，所述步骤3的具体步骤包括：（1）精密度实验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.0%，表明仪器精密度良好；（2）稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.4 %，表明供试品溶液在24 h内稳定；（3）重复性实验：按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.0%，表明方法重复性良好；（4）线性关系考察：配制阿魏酸的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y= 0.7021x 0.7703）、相关系数（r=0.9991）和线性范围（0.0510～0.2020 mg）；结果表明进样量范围内与峰面积呈良好的线性关系。
11.进一步地，所述方法通过当归药材特征图谱中的特征峰作为当归药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。
12.进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分当归的优劣。
13.进一步地，所述方法通过visual basic编程语言设计的可视化的质-量双标质量控制程序适用于当归药材（饮片）。
14.与现有技术相比本发明的有益效果。
15.（1）本发明首次公开当归药材质-量双标控制方法，可以弥补目前当归药材质量控制方法中单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。
16.（2）本发明利用现代分析检测技术指认出的特征峰化学成分中绿原酸具有保肝、利胆、抗肿瘤、抗病毒等广泛的药理活性。苯酞类化合物包括藁本内酯、洋川芎内酯ⅰ、欧当归内酯等，是当归挥发油的主要成分，其中藁本内酯的含有量最高，该类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多种药理作用。香豆素类化合物包括欧前胡素等，该类化合物具有抗肿瘤、抗高血压、抗心肌缺血、抗炎、止痛等多种药理活性，说明本方法选择的特征峰能够较为科学地反映当归药材的药效，能全面科学地反映中药当归的内在质量。
附图说明
17.图1是当归对照药材及8批当归供试药材的叠加图谱。
18.图2是对照药材特征图谱及供试药材共有模式。
19.图3是甘肃岷县样品质-量双标质量控制方法可视化结果。
20.图4是安徽亳州样品质-量双标质量控制方法可视化结果。
具体实施方式
21.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
22.实施例1。
23.当归对照药材（批号：120927-201617，中国食品药品检定研究所）。当归药材供试品（甘肃岷县、甘肃定西、甘肃渭源县、甘肃文县、安徽亳州、河北、云南、宁夏）经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为伞形科当归属植物angelic sinensis(oliv.)diels的干燥根。根据2020版《中华人民共和国药典》当归“含量测定”项下方法检测，8批产地供试品中，供试品均能符合药典规定（含阿魏酸不得少于0.05%）。
24.1.基于对照药材的当归药材定性研究。
25.1.1溶液的制备。
26.精密称取当归对照药材2.0 g，置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 ml，称定质量，超声提取30 min（频率：40 khz），放冷，加甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm滤膜, 作为参照物溶液；取供试药材粉末（过4号筛）2.0 g，按上述方法制成供试品溶液。
27.1.2色谱条件。
28.色谱柱：agilent poroshell 120 sb-c18，色谱柱规格为100 mm
×
4.6 mm，2.7 μm；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；0～15 min，5%
→
40%b；15～17 min，40%
→
60%b；17～25 min，60%
→
75%b，25～31 min，75%
→
87%b；31～35 min，87%
→
95%b；流速0.6 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长：254 nm；进样量5 μl。
29.1.3 特征图谱的建立。
30.将参照物溶液和供试品溶液，每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将254 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出。8批供试药材的hplc叠加图谱，见图1；8批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对，见图2。
31.1.4 相似度评价。
32.供试药材与对照药材的相似度均大于0.98。
33.1.5 特征峰化学成分解析。
34.采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出6个特征峰。
35.本发明所述的当归药材质量控制方法，得到的当归药材特征图谱可以用于判断当归药材的真伪。
36.2.基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究。
37.6号峰“阿魏酸”分离效果好、峰面积大且保留时间稳定居中，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰相对定量研究。根据2020版《中华人民共和国药典》当归“含量测定”项下方法检测，8批产地供试品均符合药典规定。通过内标物质化学成分准确定量，计算8批供试药材特征峰化学成分的相对含量。取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，见表1。
38.表1 8批当归药材基于内标物的特征峰相对定量结果。
39.3方法学考察。
40.3.1精密度实验。
41.精密吸取同一供试品溶液5 μl，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.0%，表明仪器精密度良好。
42.3.2稳定性实验。
43.精密吸取同一供试品溶液5 μl，按色谱条件，分别在0、2、4、10、16、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
44.3.3重复性实验。
45.按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.0%，表明方法重复性良好。
46.3.4线性关系考察。
47.配制阿魏酸的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y= 0.7021x 0.7703）、相关系数（r=0.9991）和线性范围（0.0510～0.2020 mg）。结果表明进样量范围内与峰面积呈良好的线性关系。
48.实施例2当归药材优劣的鉴别。
49.根据可视化程序计算各供试品特征峰相对含量与对照药材对比进行评分进行绘图判定优劣。其中亳州的药材评分为37.29，判定为中等偏下品质。由于当归市场需求量的增加，种苗质量良莠不齐，施肥、栽培方式、海拔梯度、育苗方式及时期都可能是影响药材品质的重要因素。以当归药材特征图谱中的特征峰作为当归药材的定性标准，能够明显区分出优劣，说明建立的特征峰相对含量下限可以区分当归的优劣，能够解决劣质当归导致临床药效不佳的问题。本发明能清晰地判断供试品的优劣，弥补目前当归药材质量控制的不足，达到全面控制当归药材的目的，见图4。