白芍药材的质量双标可视化质量控制技术

1.本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及以白芍对照药材为基准物质，建立一套不依赖于对照品，较为全面控制药材质量的方法，该方法稳定性、精密度良好，可以弥补目前白芍药材质量控制的不足，能够为白芍药材质量提升提供新思路。


背景技术：

2.白芍药材为毛茛科植物芍药paeonia lactiflora pall.的干燥根，主要分布于浙江、安徽、四川等低。性微寒，味微苦、酸，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等功效，具有抗炎、抗癌、抗氧化、镇痛、护肝等多种药理作用。现代研究表明，白芍的化学成分众多，以萜苷类化合物为主，此外还含有黄酮类、芳香酸以及鞣质等多种活性物质，因此在评价药材质量时仅对单一成分芍药苷进行定量控制，并不能全面反映白芍药材的整体质量，具有一定的局限性。
3.目前白芍药材的质量评价方法有单指标含量测定法、多指标含量测定法和指纹图谱与含量测定结合法，但存在一些不足，例如指标性成分不能科学地反映药材整体药效、指纹图谱不能清晰地判断供试品真伪优劣的问题。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明旨在提供一种基于质-量双标技术的白芍药材质量控制方法。以白芍对照药材为定性、定量的基准物质，采用高效液相色谱结合q-tof-ms技术，建立一套不依赖于对照品，较为全面科学地控制药材质量的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
6.本发明提供了一种白芍药材质量控制标准的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1 基于对照药材的白芍药材定性研究；步骤2 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究；步骤3 方法学考察。
7.进一步，所述步骤1的具体步骤包括：（1）溶液的制备：取白芍对照药材及供试药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50倍量的70%甲醇，称定重量，加热回流1 h，放冷，补足失重，摇匀，滤过；续滤液挥干，70%甲醇定容，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得；（2）色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent sb-c
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色谱柱，色谱柱规格为4.6
×
100 mm，2.7-micron；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速0.6 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长280 nm下进行检测；进样量10μl；（3）特征图谱的建立：每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将280 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出获得9批供试药材的hplc叠加图谱；9批供试药材使用
中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对；（4）相似度评价：以特征峰的相似度明确白芍药材真伪，供试药材与对照药材的相似度均大于0.97；（5）特征峰化学成分解析：采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出8个化学成分；（6）中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序：利用visual basic编程语言设计包含1个oel控件和4个command控件的适用于白芍药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制程序。
8.更进一步，所述（5）中鉴定出8个化学成分分别为：（2）号峰为儿茶素、（3）号峰为没食子酰芍药苷、（4）号峰为没食子酸、（6）号峰为氧化芍药苷、（7）号峰为没食子酸甲酯、（9）号峰为芍药内酯苷、（10）号峰为芍药苷和（14）号峰为苯甲酰芍药苷。
9.进一步，所述步骤2的具体步骤包括：以步骤1中确定的10号峰“芍药苷”作为内标物质，通过内标物质化学成分准确定量，计算供试药材特征峰化学成分的相对含量；取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限。
10.进一步，所述步骤2的特征峰均为白芍发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。
11.进一步，所述步骤3的具体步骤包括：（1）精密度实验：精密吸取同一供试品溶液10 μl，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.38%，表明仪器精密度良好；（2）稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μl，按色谱条件，分别在0、4、8、12、24、48 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.47%，表明供试品溶液在48 h内稳定；（3）重复性实验：按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.91%，表明方法重复性良好；（4）线性关系考察：配制“芍药苷”的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=22.217x－0.5501）、相关系数（r=0.999 2）。结果表明“芍药苷”在0.5760-7.200 μg范围内线性关系良好。
12.进一步，所述方法通过白芍药材特征图谱中的特征峰作为白芍药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。
13.进一步，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分白芍的优劣。
14.进一步，所述方法通过visual basic编程语言设计的可视化的质-量双标质量控制程序适用于白芍药材（饮片）。
15.与现有技术相比本发明的有益效果。
16.（1）本发明首次公开白芍药材质-量双标控制方法，可以弥补目前白芍药材质量控制方法中单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。
17.（2）本发明利用现代分析检测技术指认出的特征峰化学成分为5种单萜苷类成分、2种有机酸类成分和1种黄酮类成分。芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等白芍总苷化合物具有抗炎、镇痛、造血、保肝的功效，芍药苷通过抑制肿瘤坏死因子-α（tnf-α）和白细胞介素-6（il-6）的产生发挥抗炎活性；芍药内酯苷通过减少大脑皮层前列腺素e2的释放发挥镇痛作用；白芍总苷通过减轻炎症反应，提高肝细胞存活率发挥保肝作用；没食子酰芍药苷通过激活nrf2信号通路减轻血管内皮细胞损伤。上述化学成分均为白芍发挥其“养血调经，平抑肝养”功效和抗炎、镇痛、增加造血功能等药理作用的活性化学成分，能为白芍质量控制提供较全面的依据。
附图说明
18.图1是9批白芍供试药材的叠加图谱。
19.图2是对照药材特征图谱及供试药材共有模式。
20.图3是陕西商洛白芍样品质-量双标质量控制方法可视化结果。
具体实施方式
21.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
22.实施例1。
23.白芍对照药材（批号：120905-200508，中国食品药品检定研究所）。白芍药材供试品（四川成都、四川峨嵋、四川中江、浙江杭州、浙江磐安、大别山、安徽亳州、云南昆明、陕西商洛）经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为毛茛科植物芍药paeonia lactiflora pall.的干燥根。根据2020版《中华人民共和国药典》白芍“含量测定”项下方法检测，9批产地供试品均能符合药典规定（含芍药苷不得少于1.6 %）。
24.1.基于对照药材的白芍药材定性研究。
25.1.1溶液的制备。
26.取白芍对照药材0.5 g，精密称定，用70%甲醇25 ml加热回流1 h，放置冷却，再次称其质量，用70%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液用0.22 μm微孔滤膜滤过，作为参照物溶液；取供试药材粉末（过4号筛）0.5 g，按上述方法制成供试品溶液。
27.1.2色谱条件。
28.色谱柱：agilent sb-c
18
色谱柱（4.6
×
100 mm，2.7-micron）；流动相：0.1%甲酸水（a）-乙腈（b），进行梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～10 min，5%
ꢀ→
27% b；10～15 min，27%
ꢀ→
27% b；流速：0.6 ml/min；柱温：30 ℃；dad检测器波长：280 nm；进样量：10 μl。
29.1.3 特征图谱的建立。
30.将参照物溶液和供试品溶液，每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将280 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出。9批供试药材的hplc叠加图谱，见图1；9批供
试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对，见图2。
31.1.4 相似度评价。
32.供试药材与对照药材的相似度均大于0.97。
33.1.5 特征峰化学成分解析。
34.采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出8个特征峰。
35.本发明所述的白芍药材质量控制方法，得到的白芍药材特征图谱可以用于判断白芍药材的真伪。
36.2. 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究。
37.10号峰“芍药苷”分离效果好、峰面积大且保留时间稳定居中，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰相对定量研究。根据2020版《中华人民共和国药典》白芍“含量测定”项下方法检测，9批产地供试品均符合药典规定。通过内标物质化学成分准确定量，计算9批供试药材特征峰化学成分的相对含量。取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，见表1。
38.表1 基于内标物质的特征峰相对定量结果。
39.3.方法学考察。
40.3.1 精密度试验。
41.精密吸取同一供试品溶液10 μl，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.38%，表明仪器精密度良好。
42.3.2 稳定性试验。
43.精密吸取同一供试品溶液10 μl，按色谱条件，分别在0、4、8、12、24、48 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.47%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
44.3.3 重复性实验。
45.按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.91%，表明方法重复性良好。
46.3.4 线性关系考察。
47.配制“芍药苷”的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=22.217x－0.5501）、相关系数（r=0.9992）和线性范围（0.5760-7.200 μg）。结果表明进样量范围内与峰面积呈良好的线性关系。
48.实施例2陕西商洛白芍供试品的鉴别。
49.陕西商洛白芍样品与对照药材的相似度为0.982。通过本发明所设计的中药材（饮片）可视化的“质-量”双标质量控制方法程序（01版），可以直观的判定陕西商洛白芍样品为“真”，质量为“良”，见图3。
50.白芍为常用中药，由芍药鲜根加工而成，主产于四川、安徽、浙江等地。以白芍药材特征图谱中的特征峰作为白芍药材的定性标准，能够明显区分出伪品以及药材优劣。所设计的中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序（01版）可以将样品的真伪优劣可视化。本发明能清晰、直观地判断样品的真伪优劣，弥补目前白芍药材质量控制的不足，达到全面控制白芍药材的目的。