一种苦木碱提取物、制备方法、检测方法、组合物和应用与流程

1.本发明属于一种提取物技术领域，具体是涉及一种苦木碱提取物、制备方法、检测方法、组合物和应用。


背景技术：

2.苦木，为苦木科植物苦木picrasma quassioides(d.don)benn.的干燥枝和叶，是一种广泛分布于中国南方的落叶植物。性味苦寒，有小毒。具有清热，祛湿，解毒之功效。用于风热感冒，咽喉肿痛，腹泻下痢，湿疹，疮疖，毒蛇咬伤。目前，国内外的研究集中在苦木提取物的药用价值，尤以脂溶性生物碱类成分在抗炎、抗肿瘤和降压等方面研究较多，苦木(picrasma quassioides)提取物是国家药监局已批准使用的化妆品原料，多以复配添加的形式运用，对其质量控制和化妆品中功效应用的研究较少。
3.苦木提取物的体外抗菌活性和抗炎作用研究，赵文娜等，西北药学杂志，2019年7月，第34卷第4期，公开了苦木提取物外用具有较好的抗菌和抗炎作用，其用于化妆品中，具有修复由于炎症引起的皮肤损伤的作用。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种苦木碱提取物、制备方法、检测方法、组合物和应用，本发明的苦木碱提取物具有由于物理损伤，晒后损伤，化学损伤，氧化损伤等损伤后的皮肤修复作用。
5.本发明的内容为苦木碱提取物的制备方法，步骤为，将苦木药材和乙醇溶剂混合，进行提取，提取温度控制在75-85℃，料液比为1:8-12，将提取后的溶液进行浓缩，浓缩温度为55-65℃，浓缩后的溶液进行冷冻干燥，得到苦木碱提取物。
6.优选的，所述乙醇溶剂的体积浓度为80％，或者所述提取温度控制在80℃。
7.优选的，所述料液比为1:10；或者，所述浓缩温度为60℃；或者，所述浓缩至浓缩液和提取后的溶液的体积比为1:3。
8.本发明提供一种苦木碱提取物，采用上述的制备方法提取得到。
9.本发明提供一种苦木碱提取物的检测方法，以苦木碱己(4-甲氧基-5-羟基-铁屎米酮)作为检测指标，采用酶标仪法，检测所述的苦木碱提取物的碱类活性成分，检测波长为358nm。
10.本发明提供一种组合物，含有所述的苦木碱提取物，所述组合物优选为化妆品或药物组合物。
11.本发明提供一种苦木碱提取物的应用，苦木碱提取物在修复由于物理损伤，晒后损伤，化学损伤或氧化损伤引起的皮肤损伤方面的用途；更优选，苦木碱提取物在修复由于物理损伤或氧化损伤引起的皮肤损伤方面的用途；优选的，苦木碱提取物的浓度为50ug/ml。
12.常规的抗炎作用与抑制炎症因子有关，原理为：在众多炎症细胞因子中，起主要作
用的是tnf-α、il-1β、il-6、il-8等。tnf-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。il-6能诱导b细胞分化和产生抗体，并诱导t细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。结论：功效物通过抑制炎症因子的产生，达到抗炎的目的。
13.本发明的有益效果是，本发明在对苦木碱进行提取时，控制反应温度为70-90℃，料液比为1:8-12，浓缩温度为50-70℃，得到的苦木碱提取物中含有最多的苦木碱己。苦木提取物一般具有抗炎、抗肿瘤和降压作用，发明人在前述研究中发现，其和蛋白酶混合进行发酵后的产物具有更好的抗炎以及因为抗炎引起的皮肤修复作用。一般来说，抗炎作用的主要原理为物质中含有大量的杀菌物质，可以灭杀能引起炎症反应的微生物，或者含有大量的酶类物质可以引起免疫反应。但是发明人发现，苦木碱提取物可以直接修复损伤的皮肤，且这种损伤并不是因为炎症引起的损伤，而是物理损伤，晒后损伤，化学损伤或氧化损伤，尤其是在物理损伤和氧化损伤方面，具有明显更好的修复效果，通过实验数据可以看出，其比常见的抗氧化剂vc具有更好的修复效果，且使用的量较少，可以低至50ug/ml，在微量时，就具有很好的修复作用。
14.本技术所述的物理损伤，和erk通路有关。原理为：细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，erk)包括erk1和erk2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，其中erk1和erk2的分子量分别为44kda和42kda。磷酸化激活的erk1/2由胞质转位到核内，进而介导elk-1，atf，ap-1，c-fos和c-jun的转录活化，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的癌变等多种生物学反应。结论：功效物通过激活erk通路促进细胞增殖。
15.抗光损伤(紫外)&抗氧化，和减少胞内自由基相关。原理为，自由基的四大来源：1、人体内细胞代谢和能量产生过程中的自然副产物，人体内无时无刻不在制造着自由基。2、各种人为因素刺激产生，如精神压抑、自然衰老、悲伤和各种疾病感染等。3、多米诺骨牌效应，一旦某个自由基产生，就会出现链式反应，从而产生更多的自由基。4、外界环境因素，如各种污染源、雾霾、汽车废气、农药污染等，还有紫外线照射、磁场、有害射线，以及生活中的不良习惯和嗜好，如吸烟，熬夜，喜吃油炸、烧烤、腌制食品等。结论：功效物通过减少胞内自由基的产生，达到抗氧化的目的。
16.本技术的实验显示，苦木碱类提取物对角质形成细胞划痕损伤修复能力测试、苦木碱类提取物抗uvb损伤角质形成细胞修复功效测试、苦木碱类提取物抗果酸致角质形成细胞化学损伤能力测试、苦木碱类提取物抗h2o2致人皮肤成纤维细胞氧化损伤能力测试，结果均显示提取的苦木碱类物质能对细胞划痕损伤修复等有显著的促进效果。结果显示，本技术的苦木碱类提取物对于细胞划痕损伤修复以及氧化损伤修改具有明显更好的效果，且在低浓度50ug/ml时，具有比高浓度100ug/ml更好的效果。
附图说明
17.图1为不同浓度苦木碱提取物对细胞划痕损伤修复的影响图；
18.从上至下依次为苦木碱提取物100ug/ml、苦木碱提取物50ug/ml、苦木碱提取物10ug/ml、维生素c 50ug/ml，左侧均为加样前状态，右侧均为加样后状态。
19.图片从上到下依次为苦木碱提取物100ug/ml、苦木碱提取物50ug/ml、苦木碱提取物10ug/ml、vc 50ug/ml。
20.图2为不同浓度苦木碱提取物对uvb损伤修复的影响图。
21.图3为不同浓度苦木碱提取物对果酸损伤修复的影响图。
22.图4为不同浓度苦木碱提取物对h2o2损伤修复的影响图。
具体实施方式
23.实施例1
24.一种苦木碱提取物的制备方法
25.取6g苦木药材，过10目筛，将其和体积浓度为80％乙醇混合，进行提取，提取温度为80℃，料液比为1:10，提取时间为90min，提取次数2次，合并苦木提取液，浓缩至苦木浓缩液和苦木提取液的体积比为1:3，浓缩温度为60℃，将所得浓缩液冷冻干燥72h，即得苦木碱提取物，苦木碱的提取率为0.3480％。
26.苦木碱的提取率的提取率的测试方法为，取苦木碱己对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液，精密吸取0.1mg/ml对照品溶液0.5、1、1.5、2、3ml，分别置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，配制成浓度范围为5～30ug/ml的苦木碱己标准溶液，备用，取96孔板设置5个梯度，每个梯度3个复孔，将空白板放入酶标仪，测定空白板吸光值，取出，每个梯度加样200ul，重复3次，放入酶标仪(型号：varioskan lux多功能酶标仪，厂家：赛默飞)测定吸光值(波长设置为358nm)，测试结果扣除空白值后取平均值，绘制标准曲线。
27.采用上述同样的方法，检测上述实施例1得到的苦木碱提取物的苦木碱己的含量，苦木碱的提取率为0.3480％。
28.对比例1
29.一种苦木碱提取物的制备方法
30.取6g苦木药材，过10目筛，将其和体积浓度为80％乙醇混合，进行提取，提取温度为90℃，料液比为1:30(即乙醇溶液的体积为180ml)，提取时间为90min，提取次数2次，合并苦木提取液，浓缩至苦木浓缩液和苦木提取液的体积比为1:3，浓缩温度为60℃，将所得浓缩液冷冻干燥72h，即得苦木碱提取物，苦木碱的提取率为0.3145％。
31.对比例2
32.一种苦木碱提取物的制备方法
33.取6g苦木药材，过10目筛，将其和体积浓度为80％乙醇混合，进行提取，提取温度为60℃，料液比为1:12，提取时间为90min，提取次数2次，合并苦木提取液，浓缩至苦木浓缩液和苦木提取液的体积比为1:3，浓缩温度为60℃，将所得浓缩液冷冻干燥72h，即得苦木碱提取物，苦木碱的提取率为0.2936％。
34.实施例2
35.苦木碱类提取物对各种原因造成的细胞损伤修复能力功效实验
36.2.1苦木碱类提取物对角质形成细胞划痕损伤修复能力测试
37.1.培养基及溶液配制
38.(1)dmem高糖培养基：将一袋dmem高糖培养基粉末加至800ml纯化水中搅拌溶解，
后加入nahco
3 3.7g继续搅拌至粉末完全溶解，调ph至7.1-7.2后定容至1l，用0.22μm过滤器过滤除菌后密封放于4℃保存。
39.(2)dmem高糖完全培养基：向dmem高糖培养基中加入fbs使其含量为10％。
40.2.使用划痕插件进行划痕实验
41.(1)角质形成细胞复苏，用含10％fbs的dmem作为培养液培养细胞。
42.(2)取对数期细胞，用0.25％胰酶消化细胞，含10％fbs的dmem作为培养液，用消毒过的镊子，将culture-insert 2well底面放在6孔板。注意只有插件底面具有粘性，同时应该保证附着的界面，光滑，干燥。必要时可以用手指推动或者颠倒观察是否粘贴牢固。细胞悬液配置和以往相同，5*105每ml，在两侧孔中各加入70ul(36000)细胞悬液，在孔外加入培养基，不能低于1ml，于37℃，5％co2培养箱中培养24h后，将孔板取出拍照。
43.(3)将插件拔出，以含0.5％血清的完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液以及阴性对照组，2ml/孔，加入孔内。置于37℃，5％co2培养箱内培养6h后在显微镜下观察细胞形态并拍照。
44.3.实验结果如表1和图1所示。
45.表1不同物质对细胞划痕损伤修复表
[0046][0047][0048]
通过划痕修复实验结果来看，苦木碱提取物(50ug/ml、100ug/ml)对角质形成细胞划痕损伤修复有促进效果，vc并无促进效果。
[0049]
2.2苦木碱类提取物抗uvb损伤角质形成细胞修复功效测试
[0050]
1.培养基及溶液配制
[0051]
(1)dmem高糖培养基：将一袋dmem高糖培养基粉末加至800ml纯化水中搅拌溶解，后加入nahco
3 3.7g继续搅拌至粉末完全溶解，调ph至7.1-7.2后定容至1l，用0.22μm过滤器过滤除菌后密封放于4℃保存。
[0052]
(2)dmem高糖完全培养基：向dmem高糖培养基中加入fbs使其含量为10％。
[0053]
(3)mtt溶液(5mg
·
ml-1)：避光条件下，将50mg mtt粉末溶于10ml 1
×
pbs缓冲液中，置于60℃水浴中助溶，0.22μm过滤器过滤除菌后置于-20℃避光保存。
[0054]
2.抗光损伤功效检测
[0055]
(1)人永生化角质形成细胞(hacat)接种：将细胞悬液密度调整至8x104个/ml后接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。
[0056]
(2)实验分组：设置阴性对照组(nc)、阳性对照组(pc)和样品组。样品组共设2个浓度梯度，每个浓度梯度均设3个复孔。
[0057]
(3)uvb诱导细胞损伤：弃去旧培养基，加入少量pbs，50μl/孔，置于uvb灯管下辐照3min(辐射强度5mw/cm2，照射距离3cm)，以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔,阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基。
[0058]
(4)置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
[0059]
(5)mtt检测：在避光条件下，每孔加入10μl mtt溶液(5mg
·
ml-1
)，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱内充分反应4h后弃去孔板内上清液，加入dmso，150μl/孔，震荡溶解10min，使用酶标仪检测各孔570nm处吸光度值，以630nm为参考波长。
[0060]
(6)计算：各组吸光度值减去本底吸收后，以细胞对照组吸光度值为100％，计算各浓度加样组细胞的细胞活力百分比，计算公式如下：
[0061]
细胞活力百分比(％)＝样品孔平均od值/阴性对照组平均od值
×
100％。
[0062]
(7)统计分析：采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。
[0063]
3.抗光损伤功效检测结果
[0064]
mtt测试结果
[0065]
通过显微镜观察各组细胞，阴性对照组细胞呈长梭形，正常贴壁生长；而阳性对照组细胞大面积收缩融合，且出现收缩变圆的异常形态，视野内几乎看不到正常形态细胞。样品组与阳性组类似。
[0066]
通过mtt法检测各组细胞od值并计算细胞生存率，结果如表2和图2所示：以阴性对照组细胞活力为100％计算，阳性对照组细胞活力降至48％。苦木碱提取物与阳性组相比细胞活力有提高，说明苦木碱提取物有明显的抗光损伤修复作用。
[0067]
表2苦木碱提取物对uvb损伤修复结果表
[0068][0069]
2.3苦木碱类提取物抗果酸致角质形成细胞化学损伤能力测试
[0070]
1.培养基及溶液配制
[0071]
(1)dmem高糖培养基：将一袋dmem高糖培养基粉末加至800ml纯化水中搅拌溶解，后加入nahco
3 3.7g继续搅拌至粉末完全溶解，调ph至7.1-7.2后定容至1l，用0.22μm过滤器过滤除菌后密封放于4℃保存。
[0072]
(2)dmem高糖完全培养基：向dmem高糖培养基中加入fbs使其含量为10％。
[0073]
(3)mtt溶液(5mg
·
ml-1
)：避光条件下，将50mg mtt粉末溶于10ml 1
×
pbs缓冲液中，置于60℃水浴中助溶，0.22μm过滤器过滤除菌后置于-20℃避光保存。
[0074]
2.抗化学损伤功效检测
[0075]
(1)人永生化角质形成细胞(hacat)接种：将细胞悬液密度调整至8x104个/ml后接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。
[0076]
(2)实验分组：设置阴性对照组(nc)、阳性对照组(pc)和样品组。样品组中共设2个浓度梯度，每个梯度设6个复孔。
[0077]
(3)果酸诱导氧化损伤：弃去旧培养基，用培养基将果酸母液稀释至2000ug/ml后加入细胞，100μl/孔，细胞阴性对照孔和调零孔加入完全培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱内培养10min后弃去。
[0078]
(4)待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔，阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
[0079]
(5)mtt检测：在避光条件下，每孔加入10μl mtt溶液(5mg
·
ml-1
)，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱内充分反应4h后弃去孔板内上清液，加入dmso，150μl/孔，震荡溶解10min，使用酶标仪检测各孔570nm处吸光度值，以630nm为参考波长。
[0080]
(6)计算：各组吸光度值减去本底吸收后，以细胞对照组吸光度值为100％，计算各浓度加样组细胞的细胞活力百分比，计算公式如下：
[0081]
细胞活力百分比(％)＝样品孔平均od值/阴性对照组平均od值
×
100％。
[0082]
(7)统计分析：采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。
[0083]
3.实验结果
[0084]
mtt测试结果
[0085]
(1)显微镜下观察到阴性对照组细胞呈多角形，正常贴壁生长；而阳性对照组细胞大面积收缩融合，且出现收缩变圆的异常形态。不同浓度的苦木碱提取物作用24h后，加样组正常细胞数量增多，较阳性对照组有改善。
[0086]
(2)通过mtt法检测各组细胞od值并计算细胞生存率，结果如表3和图3所示：以阴性对照组细胞活力为100％计算，阳性对照组细胞活力降至46％，苦木碱提取物样品与阳性组和vc相比，细胞活力有所提高，说明苦木碱提取物具有一定的抗化学损伤修复作用。
[0087]
表3苦木碱提取物抗化学损伤修复结果表
[0088][0089]
2.4苦木碱类提取物抗h2o2致人皮肤成纤维细胞氧化损伤能力测试
[0090]
1.培养基及溶液配制
[0091]
(1)dmem高糖培养基：将一袋dmem高糖培养基粉末加至800ml纯化水中搅拌溶解，后加入nahco
3 3.7g继续搅拌至粉末完全溶解，调ph至7.1-7.2后定容至1l，用0.22μm过滤器过滤除菌后密封放于4℃保存。
[0092]
(2)dmem高糖完全培养基：向dmem高糖培养基中加入fbs使其含量为10％。
[0093]
(3)mtt溶液(5mg
·
ml-1
)：避光条件下，将50mg mtt粉末溶于10ml 1
×
pbs缓冲液中，置于60℃水浴中助溶，0.22μm过滤器过滤除菌后置于-20℃避光保存。
[0094]
2、抗氧化损伤功效检测
[0095]
(1)人永生化角质形成细胞(hacat)接种：将细胞悬液密度调整至8x104个/ml后接种于96孔板，100μl/孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h。
[0096]
(2)实验分组：设置阴性对照组(nc)、阳性对照组(pc)和样品组。样品组中共设2个浓度梯度，每个浓度梯度均设6个复孔。
[0097]
(3)h2o2诱导损伤：弃去旧培养基，加入h2o2(600μm)溶液，100μl/孔，阴性对照组加
入完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养1.5h后弃去。
[0098]
(4)待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔,阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
[0099]
(4)mtt检测：在避光条件下，每孔加入10μl mtt溶液(5mg
·
ml-1
)，将96孔板置于37℃，5％co2培养箱内充分反应4h后弃去孔板内上清液，加入dmso，150μl/孔，震荡溶解10min，使用酶标仪检测各孔570nm处吸光度值，以630nm为参考波长。
[0100]
(5)计算：各组吸光度值减去本底吸收后，以细胞对照组吸光度值为100％，计算各浓度加样组细胞的细胞活力百分比，计算公式如下：
[0101]
细胞活力百分比(％)＝样品孔平均od值/阴性对照组平均od值
×
100％。
[0102]
(6)统计分析：采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义。
[0103]
3.测试结果
[0104]
1.mtt测试结果
[0105]
(1)通过显微镜观察各组细胞，阴性对照组细胞呈长梭形，正常贴壁生长；而阳性对照组细胞大面积收缩融合，且出现收缩变圆的异常形态，视野内几乎看不到正常形态细胞。样品组与阳性组类似。
[0106]
(2)通过mtt法检测各组细胞od值并计算细胞生存率，结果如表4和图4所示：以阴性对照组细胞活力为100％计算，阳性对照组细胞活力降至41％，苦木样品组与阳性组相比细胞活力有不同程度的提高，说明不同浓度的苦木碱提取物均有明显的抗氧化损伤修复作用。
[0107]
表4苦木碱提取物抗氧化损伤修复结果表
[0108][0109]
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本技术的保护范围限于这些例子；在本技术的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本技术中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
[0110]
本技术中一个或多个实施例旨在涵盖落入本技术的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本技术中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。