一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂及其制备方法

1.本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂及其制备方法。


背景技术：

2.目前，治疗恶性肿瘤的常见策略主要是化疗，但是实体肿瘤发生机制复杂，单化疗药物治疗作用机制单一，往往无法调节多种信号通路，导致肿瘤治疗效果不理想。因此，采用不同机制的药物联合治疗是一种有效可行的治疗策略。
3.紫杉醇(paclitaxel)，是一种产生于红豆杉树皮和针叶中的三环二萜碱类抗癌药物，紫杉醇可以与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合阻止微管解离，阻断增殖期细胞的细胞周期进程使其停滞于g2/m期而无法进入s期，从而抑制癌细胞的生长，对增殖期的肿瘤细胞具有杀伤作用。伊立替康(irinotecan)，喜树碱的水溶性衍生物，是一种dna拓扑异构酶i抑制剂，通过阻断增殖期和静止期细胞的dna复制和rna转录来抑制肿瘤细胞的分裂，对增殖期及静止期的肿瘤细胞均有杀伤作用。基于这两种药物的抗肿瘤机制，可以将紫杉醇和伊立替康联合应用，以提高药物肿瘤的治疗效果。
4.然而，目前用于联合治疗的纳米制剂在实际应用中仍然面临很多问题，例如联合药物不能同时靶向输送至肿瘤部位并实现有效释放。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂及其制备方法，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂可以靶向释放药物，协同抗肿瘤，减少药物对非靶向器官的毒副作用。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂，由包括以下质量百分含量的原料制备得到：紫杉醇0.08％～0.25％、伊立替康前药0.60％～2.00％、乳化剂0.30％～1.00％、骨架材料0.30％～1.00％和注射用水95.00％～99.80％，所述伊立替康前药的结构如式i所示：
[0008][0009]
优选的，所述伊立替康前药的制备方法包括以下步骤：
[0010]
(1)将d-α-生育酚琥珀酸酯、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和卤代烃溶剂混合进行活化，得到预混液；
[0011]
(2)将所述预混液和伊立替康混合进行酯化反应，得到伊立替康前药。
[0012]
优选的，所述酯化反应的温度为25～40℃，时间为24～72h。
[0013]
优选的，所述d-α-生育酚琥珀酸酯和乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为2:1～4，所述乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和伊立替康的摩尔比为5:3～5，所述伊立替康和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为12:3～7。
[0014]
优选的，所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的粒径为100～200nm，多分散系数小于0.3。
[0015]
优选的，所述骨架材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)。
[0016]
优选的，所述乳化剂为维生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)。
[0017]
本发明还提供了上述方案所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)将所述伊立替康前药、紫杉醇、骨架材料和卤代烃溶剂混合，得到油相；
[0019]
(2)将乳化剂和水混合，得到水相；
[0020]
(3)将所述油相和水相混合后去除卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂；
[0021]
所述步骤(1)和步骤(2)的时间先后顺序没有要求。
[0022]
优选的，所述油相和水相混合包括：将油相滴入水相中，然后依次进行剪切和超声。
[0023]
优选的，所述剪切的速率为6000～11000rpm，时间为1～5min；所述超声的功率为50～300w，时间为1～10min。
[0024]
本发明提供了一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂，由包括以下质量百分含量的原料制备得到：紫杉醇0.08％～0.25％、伊立替康前药0.60％～2.00％、乳化剂0.30％～1.00％、骨架材料0.30％～1.00％和注射用水95.00％～99.80％，所述伊立替康前药的结构如式i所示。本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂以紫杉醇和伊立替康前药为原料药，伊立替康前药具有酯酶刺激响应特征，其-oh基团对酯酶刺激响应，可在肿瘤内微环境中的酯酶作用下裂解，释放出原药伊立替康，不仅实现了定位同时释放药物，减少药物对非靶向器官的毒副作用，还可以增加药物的稳定性和溶解性，并且提高了药物的载药量；同时，释放的紫杉醇和伊立替康药物具有协同抗肿瘤作用，从而增强抗肿瘤的效果。
[0025]
本发明还提供了上述方案所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的制备方法。本发明提供的制备方法步骤简单，操作方便，原料易得，具有大规模工业化生产的前景。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为本发明制备伊立替康前药的合成路线图；
[0028]
图2为本发明实施例1制备的伊立替康前药的hplc图；
[0029]
图3为本发明实施例1制备的伊立替康前药的差热分析结果图；
[0030]
图4为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的1h-nmr图(从上至下分别代表伊立替康、本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂和d-α-生育酚琥珀酸酯)；
[0031]
图5为本发明实施例1制备的伊立替康前药的高分辨质谱图；
[0032]
图6为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的粒径分布图；
[0033]
图7为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的体外释放曲线；
[0034]
图8为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂对结肠癌ht-29和hct-116细胞的细胞毒作用。
具体实施方式
[0035]
本发明提供了一种共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂，由包括以下质量百分含量的原料制备得到：紫杉醇0.08％～0.25％、伊立替康前药0.60％～2.00％、乳化剂0.30％～1.00％、骨架材料0.30％～1.00％和注射用水95.00％～99.80％，所述伊立替康前药的结构如式i所示：
[0036][0037]
以质量百分含量计，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的原料包括紫杉醇0.08％～0.25％，优选为0.08％～0.20％，更优选为0.10％～0.15％。
[0038]
以质量百分含量计，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的原料包括伊立替康前药0.60％～2.00％，优选为0.60％～1.80％，更优选为1.00％～1.50％。本发明制备的伊立替康前药的分子式为c
66h90
n4o
10
，理论分子量为1099.6737。
[0039]
在本发明中，所述伊立替康前药的制备方法优选包括以下步骤：将d-α-生育酚琥珀酸酯、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和卤代烃溶剂混合进行活化，得到预混液；将所述预混液和伊立替康混合进行酯化反应，得到伊立替康前药。在本发明中，所述卤代烃溶剂优选为无水二氯甲烷；所述d-α-生育酚琥珀酸酯和乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比优选为2:1～4，更优选为2:3；所述乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和伊立替康的摩尔比优选为5:3～5，更优选为5:4；所述伊立替康和4-二甲氨基吡啶的摩尔比优选为12:3～7，更优选为12:5；所述伊立替康和卤代烃溶剂的质量比优选为5～20:80～95，更优选为7～15:85～93。
[0040]
在本发明中，所述活化优选在冰浴和保护气条件下进行；所述保护气优选为氮气；所述活化的温度优选为0～10℃，更优选为0～4℃，时间优选为1～4h，更优选为1～2h；所述预混液和伊立替康混合的方式优选为搅拌；所述搅拌的速率优选为60～150r/min，更优选为80～120r/min；所述酯化反应优选在避光条件下进行；所述酯化反应的温度优选为25～40℃，更优选为25～30℃，时间优选为24～72h，更优选为40～50h。
[0041]
在本发明中，所述反应结束后优选进行后处理，得到伊立替康前药；所述后处理优选包括：将得到的反应液依次进行分离和干燥；所述分离优选采用色谱柱分离；所述色谱柱优选为硅胶色谱柱；所述色谱柱分离的洗脱剂优选为二氯甲烷和甲醇；所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为20:0.5～2，更优选为20:1～1.5；所述色谱柱分离的条件包括：流动相优选为95:5的0.1％(v/v)tfa甲醇溶液和0.02mol/l磷酸二氢钾水溶液(ph＝3)；所述流动相的流速优选为1.0ml/min；检测温度优选为40℃；进样量优选为10μl；色谱柱的柱型号优选为polypak ec-c18(250mm
×
4.6mm，5μm)；所述干燥优选为真空干燥；所述干燥的温度优选为25～50℃，更优选为30～40℃，时间优选为10～30h，更优选为12～24h，真空度优选为-0.1～-0.05mpa，更优选为-0.1～-0.08mpa。
[0042]
以质量百分含量计，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的原料包括乳化剂0.30％～1.00％，优选为0.30％～0.90％，更优选为0.40％～0.80％。在本发明中，所述乳化剂优选为维生素e聚乙二醇琥珀酸酯(tpgs)。
[0043]
以质量百分含量计，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的原料包括骨架材料0.30％～1.00％，优选为0.30％～0.90％，更优选为0.40％～0.80％。在本发明中，所述骨架材料优选为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量优选为10000kda，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚乳酸和羟基乙酸的嵌段比例优选为50:50。
[0044]
以质量百分含量计，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的原料包括注射用水95.00％～99.80％，优选为95.80％～99.00％，更优选为97.00％～98.00％。
[0045]
在本发明中，所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的粒径优选为100～200nm，更优选为120～180nm，进一步优选为120～150nm；所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的多分散系数优选小于0.30，更优选为0.23～0.30，进一步优选为0.27～0.30。
[0046]
本发明还提供了上述方案所述共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0047]
(1)将所述伊立替康前药、紫杉醇、骨架材料和卤代烃溶剂混合，得到油相；
[0048]
(2)将乳化剂和水混合，得到水相；
[0049]
(3)将所述油相和水相混合后去除卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂；
[0050]
所述步骤(1)和步骤(2)的时间先后顺序没有要求。
[0051]
本发明将所述伊立替康前药、紫杉醇、骨架材料和卤代烃溶剂混合，得到油相。在本发明中，所述伊立替康前药和卤代烃溶剂的质量比优选为5～20:80～95，更优选为7～15:85～93。
[0052]
本发明将乳化剂和水混合，得到水相。在本发明中，所述水优选为注射用水；所述乳化剂和水的质量比优选为3～15:800～3500，更优选为6～12:1600～2400。
[0053]
得到油相和水相后，本发明将所述油相和水相混合后去除卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。在本发明中，所述混合的方式优选包括：将油相滴加到水相中，然后依次进行剪切和超声；所述滴加的速率优选为40～120滴/min，更优选为50～60滴/min；所述剪切的速率优选为6000～11000rpm，更优选为7000～10000rpm，时间优选为1～5min，更优选为2～4min；所述超声的功率优选为50～300w，更优选为150～200w，时间优
选为1～10min，更优选为3～7min；所述去除卤代烃溶剂优选通过旋蒸进行；所述旋蒸的温度优选为25～40℃，更优选为30～37℃，时间优选为5～10min，更优选为6～8min；所述旋蒸的装置优选为旋转蒸发仪。
[0054]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明的方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0055]
图1为本发明制备伊立替康前药的合成路线图：本发明将d-α-生育酚琥珀酸酯、乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、卤代烃溶剂和伊立替康混合进行反应，得到伊立替康前药。
[0056]
实施例1
[0057]
处方组成：
[0058]
油相：
[0059][0060]
水相：
[0061]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.0g；
[0062]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0063]
制备工艺参数：
[0064][0065]
制备方法：
[0066]
精密称取530mg(1.0mmol)d-α-生育酚琥珀酸酯、310mg(1.5mmol)乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和60mg(0.5mmol)4-二甲氨基吡啶溶解于20ml二氯甲烷，在氮气保护下冰浴活化2h；再加入710mg(1.2mmol)伊立替康，在30℃条件下避光反应48h，反应产物用硅胶色谱柱法分离纯化，洗脱剂为体积比20:1的二氯甲烷/甲醇，然后将收集到的产物真空干燥，得到伊立替康前药；
[0067]
精密称取0.7g紫杉醇、5.0g伊立替康前药及3.0g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取3.0g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以11000rpm持续剪切1min，得到初乳，再在冰浴中150w探头超声3min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米粒。
[0068]
后续实施例中伊立替康前药的制备方法和实施例1一致。
[0069]
实施例2
[0070]
处方组成：
[0071]
油相：
[0072][0073]
水相：
[0074]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.0g；
[0075]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0076]
制备工艺参数：
[0077][0078]
制备方法：
[0079]
精密称取0.7g紫杉醇、5.0g伊立替康前药及3.0g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取3.0g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以6000rpm持续剪切3min，得到初乳，再在冰浴中50w探头超声5min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0080]
实施例3
[0081]
处方组成：
[0082]
油相：
[0083][0084]
水相：
[0085]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.0g；
[0086]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0087]
制备工艺参数：
[0088][0089]
制备方法：
[0090]
精密称取0.7g紫杉醇、5.0g伊立替康前药及3.0g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到
油相；精密称取3.0g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以6000rpm持续剪切3min，得到初乳，再在冰浴中300w探头超声8min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0091]
实施例4
[0092]
处方组成：
[0093]
油相：
[0094][0095]
水相：
[0096]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.3g；
[0097]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0098]
制备工艺参数：
[0099][0100]
制备方法：
[0101]
精密称取0.7g紫杉醇、6.3g伊立替康前药及2.3g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取2.3g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以6000rpm持续剪切5min，得到初乳，再在冰浴中150w探头超声5min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0102]
实施例5
[0103]
处方组成：
[0104]
油相：
[0105][0106]
水相：
[0107]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.4g；
[0108]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0109]
制备工艺参数：
[0110][0111]
制备方法：
[0112]
精密称取0.1g紫杉醇、1.8g伊立替康前药及3.4g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取3.4g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以11000rpm持续剪切1min，得到初乳，再在冰浴中150w探头超声3min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0113]
实施例6
[0114]
处方组成：
[0115]
油相：
[0116][0117]
水相：
[0118]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5g；
[0119]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0120]
制备工艺参数：
[0121][0122]
制备方法：
[0123]
精密称取0.7g紫杉醇、5.0g伊立替康前药及2.5g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取2.5g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以11000rpm持续剪切1min，得到初乳，再在冰浴中150w探头超声1min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0124]
实施例7
[0125]
处方组成：
[0126]
油相：
[0127][0128]
水相：
[0129]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3.0g；
[0130]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0131]
制备工艺参数：
[0132][0133]
制备方法：
[0134]
精密称取1.5g紫杉醇、5.0g伊立替康前药及3.0g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到油相；精密称取3.0g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以11000rpm持续剪切2min，得到初乳，再在冰浴中150w探头超声3min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0135]
实施例8
[0136]
处方组成：
[0137]
油相：
[0138][0139]
水相：
[0140]
tpgs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.2g；
[0141]
蒸馏水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
800ml；
[0142]
制备工艺参数：
[0143][0144]
制备方法：
[0145]
精密称取0.5g紫杉醇、6.0g伊立替康前药及2.2g plga溶于5ml二氯甲烷中，得到
油相；精密称取2.2g tpgs溶于800ml蒸馏水中，得到水相；将油相缓慢滴入水相中，然后用高速剪切机以11000rpm持续剪切5min，得到初乳，再在冰浴中300w探头超声10min，随后在室温下旋转蒸发除去卤代烃溶剂，得到共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂。
[0146]
利用高效液相色谱对伊立替康、实施例1制备的伊立替康前药和上述两者的混合物进行hplc分析，结果如图2所示。图2为本发明实施例1制备的伊立替康前药的hplc图，根据图2可知，伊立替康和伊立替康前药的出峰时间不同，证明伊立替康前药的成功合成。
[0147]
采用膜过滤法测定紫杉醇的包封率和载药量：游离紫杉醇不溶于水，能被0.45μm微孔滤膜截留；将新鲜制备的纳米制剂过0.45μm微孔滤膜，精密量取滤液1ml，用甲醇定容至10ml，涡旋破乳，5000rpm离心3min，取上清液，进样10μl，hplc法测定紫杉醇的量，并根据公式计算包封率(ee)：
[0148][0149]
计算结果如表1所示：
[0150]
表1本发明紫杉醇的包封率
[0151]w药物总量
(g)w
包封药物量
(g)包封率(％)0.4870.37476.80.5020.38777.10.5140.40378.4
[0152]
根据表1可知，本发明紫杉醇的包封率大于75％，可以达到78.4％，能够实现对紫杉醇良好地包封。
[0153]
对d-α-生育酚琥珀酸酯、伊立替康、d-α-生育酚琥珀酸酯和伊立替康的混合物以及本发明实施例1制备的伊立替康前药进行差热分析，结果如图3所示。图3为本发明实施例1制备的伊立替康前药的差热分析结果图，根据图3可知，d-α-生育酚琥珀酸酯在80.67℃处产生了一个药物典型的吸热峰，伊立替康在87.82℃处产生了一个药物典型的吸热峰，表明其均具有结晶性；在d-α-生育酚琥珀酸酯和伊立替康物理混合物中能观察到药物的典型吸热峰；和伊立替康相比，伊立替康前药的冻干粉缺少明显的吸热峰，说明伊立替康前药具有无定型的本质和低结晶性特点，进一步证明了伊立替康前药的成功合成。
[0154]
对伊立替康、本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂和d-α-生育酚琥珀酸酯进行氢谱分析，结果如图4所示。图4为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的1h-nmr图，根据图4可知，本发明d-α-生育酚琥珀酸酯和伊立替康之间发生了共轭，成功合成伊立替康前药。
[0155]
对本发明实施例1制备的伊立替康前药进行高分辨质谱分析，结果如图5所示。图5为本发明实施例1制备的伊立替康前药的高分辨质谱图，根据图5可知，本发明伊立替康前药(c
66h90
n4o
10
)的理论分子量为1099.6737([m h] m/z)，与高分辨质谱所测得的分子量一致，证明了伊立替康前药的成功合成。
[0156]
利用粒径仪对本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的粒径和多分布系数进行测定，检测方法为：精密量取实施例1新鲜制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂1ml于10ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度摇匀，用粒径电位测定仪测定纳米
粒的粒径和zeta电位，平行测定三次，结果如图6所示。图6为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的粒径分布图，根据图6可知，本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的平均粒径为125nm。
[0157]
利用透析袋法对本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的体外释放行为进行检测，检测方法为：为了满足紫杉醇的漏槽条件，配制的释放介质为含0.5％(w/v)tween-80的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)，配制的模拟肿瘤中高含量酯酶的释放介质为含0.5％(w/v)吐温80的磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)和酯酶(60u/ml)的混合液；取实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂3份，每份3ml，转移至透析袋中(截留分子量为8000～14000da)，分别置于47ml释放介质的容器中，37℃避光振荡(100rpm)，于不同的时间点取出0.5ml介质用于测试，并补充等体积的新鲜透析介质；采用hplc测定释放介质中紫杉醇和伊立替康的浓度，计算药物累积释放百分率，结果如图7所示。图7为本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的体外释放曲线，根据图7可知，本发明实施例1制备的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂呈现酯酶刺激响应的药物释放特征。
[0158]
利用mtt法考察空白纳米粒制剂、游离紫杉醇、载伊立替康前药纳米制剂以及共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂对结肠癌ht-29细胞和hct-116细胞的抗增殖作用，具体步骤如下：将ht-29和hct-116细胞以1
×
104/well(180μl)细胞密度接种于96孔板，孵育24h，使细胞贴壁生长，待细胞密度接近80％左右，将系列浓度的制剂分别加入到细胞培养孔中，使细胞中紫杉醇药物浓度梯度分别为0.10、1.00、5.00、10.00和20.00μg/ml，每个浓度设置6个复孔，将培养板置于培养箱中孵育24h和48h；给药结束后，每孔加入20μl的mtt溶液(5.0mg/ml)，继续孵育4h；待生成紫色甲瓒结晶后，吸弃上清，每孔加入200μl的二甲基亚砜，放入水平摇床振摇20min，使结晶完全溶解；使用酶标仪于490nm波长下测定每孔吸光度值(od值)，计算细胞活力，结果如图8所示。根据图8可知，在该浓度范围内空白纳米制剂对肿瘤细胞无抑制作用；在相同时间和相同给药浓度下，肿瘤细胞生存抑制率大小为：共载紫杉醇和伊立替康纳米制剂》载伊立替康纳米制剂》游离紫杉醇，可见伊立替康前药与紫杉醇具有抗肿瘤协同效果，共载紫杉醇和伊立替康纳米制剂能明显改善紫杉醇对肿瘤细胞的增殖抑制效应。
[0159]
本发明实施例2～4制备得到的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂的结构特点和性能测试结果与实施例1相似。
[0160]
由以上实施例可知，本发明提供的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂中伊立替康前药具有酯酶刺激响应特征，实现了定位同时释放药物，增加了药物的稳定性和溶解性，提高了药物的载药量，伊立替康和紫杉醇的累积释放量高，增强了伊立替康的抗肿瘤效果。本发明提供的制备方法步骤简单，操作方便，得到的共载紫杉醇和伊立替康前药纳米制剂粒径均匀，多分布系数小于0.3。
[0161]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。