信息处理装置、信息处理方法、程序和光学测量系统与流程

1.本公开涉及信息处理装置、信息处理方法、程序和光学测量系统。


背景技术：

2.通常，当分析诸如细胞、微生物或脂质体的生物相关微粒(在下文中，简称为微粒)的蛋白质时，广泛地使用流式细胞仪(流式细胞仪)。流式细胞术是通过利用具有特定波长的激光束(激发束)照射在流路中流动的微粒并且检测从每个微粒发射的荧光光束或散射束来逐一分析多个微粒的方法。在该流式细胞术中，通过将由光电探测器检测的光转换为电信号用于量化，并且执行统计分析，可以确定每个微粒的类型、尺寸、结构等。
3.此外，近年来，已经开发了即使在不布置许多高灵敏度光电探测器的情况下也能够在不担心泄漏的情况下使用的下一代流式细胞仪，诸如光谱流式细胞仪。
4.与传统的流式细胞仪不同，光谱流式细胞仪不具有针对一种荧光染料设置一个高灵敏度光电探测器的配置，并且因此可以从一个微粒获得大量的荧光信息。因此，各种荧光分离处理可以用于从光谱流式细胞仪获得的荧光信息。
5.引用列表
6.专利文献
7.专利文献1：jp2012-52985a


技术实现要素：

8.技术问题
9.然而，在光谱流式细胞仪中，根据装置本身的性能、待测量的微粒的类型等，在荧光分离性能、处理时间、可靠性、结果稳定性等方面产生差异。因此，难以根据待测量物体设定合适的荧光分离方法。
10.因此，本公开提出了使得可以根据待测量对象设置合适的荧光分离方法的信息处理装置、信息处理方法、程序和光学测量系统。
11.问题的解决方案
12.根据实施例的信息处理装置包括分离单元，该分离单元从由一种或多种荧光染料标记的生物样本测得的荧光信号中，通过使用最小二乘法的算术运算分别计算从该一种或多种荧光染料和该生物样本发射的一个或多个荧光光束和自发荧光光束的荧光强度，该最小二乘法使用每种荧光染料的荧光光谱基准和该生物样本的自发荧光光谱，其中在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的每一个设置所述荧光强度的上限值和下限值。
附图说明
13.图1是示出在实施方式中使用的光谱流式细胞仪的示意性配置实例的示意图。
14.图2是示出图1中所示的流式细胞仪的示意性配置实例的框图。
15.图3是示出根据本实施方式的信息处理系统的示意性配置实例的框图。
16.图4是用于说明根据实施方式的解混的概要的示图。
17.图5是示出在未染色微粒用作未染色样本时获得的光谱信息和标准偏差的实例的曲线图。
18.图6是示出不包括自发荧光光谱的基准光谱的实例的示图。
19.图7是示出包括自发荧光光谱的基准光谱的实例的示图。
20.图8是示出当使用不包括自发荧光光谱的基准光谱时的解混结果的二维曲线图。
21.图9是示出当使用包括自发荧光光谱的基准光谱时的解混结果的二维曲线图。
22.图10是示出当使用仅包括自发荧光光谱的基准光谱时以及当使用包括荧光染料的自发荧光光谱和荧光光谱基准两者的基准光谱时的解混结果的实例的示图。
23.图11为示出根据该实施方式的受限基准光谱的实例的示图；
24.图12是示出根据本实施例的自发荧光校正参数ε的自动确定操作的示例的流程图。
25.图13是用于解释当根据实施方式的自发荧光校正参数ε改变时，荧光分离性能的改变的示图(部分1)。
26.图14是用于解释当根据实施方式的自发荧光校正参数ε改变时，荧光分离性能的改变的示图(部分2)。
27.图15是用于解释当根据实施方式的自发荧光校正参数ε改变时，荧光分离性能的改变的示图(部分3)。
28.图16是示出当以不同的预定宽度δ改变自发荧光校正参数ε时从未染色样本获得的自发荧光量的标准偏差的变化的曲线图。
29.图17是示出当未提供惩罚项并且自发荧光光谱不受限制时的荧光分离性能以及当提供惩罚项并且自发荧光光谱受限制时的荧光分离性能的示图(实施例)。
30.在下文中，将参考附图详细描述本公开的优选实施方式。注意，在本说明书和附图中，具有基本相同的功能配置的组件由相同的附图标记表示，并且省略冗余的描述。
具体实施方式
31.注意，将按照以下顺序给出描述。
32.1.介绍
33.2.实施例
34.2.1流式细胞仪的概述
35.2.2光谱流式细胞仪的示意性配置实例
36.2.3信息处理系统的示意性配置实例
37.2.4关于解混
38.2.5关于针对每个测量信道的固定噪声的优化
39.2.6关于有限的自发荧光校正
40.2.7关于有限自发荧光校正参数的自动确定
41.2.8作用和效果
42.1.介绍
43.在基本医学和临床领域的流式细胞术中，使用多种荧光染料的多色分析已变得广泛，以便推进全面解释。然而，当如在多色分析中将多个荧光染料用于一次测量时，来自除目标荧光染料以外的荧光染料的光泄漏到各个光电探测器中，这可能降低分析精度。因此，在与多色分析兼容的流式细胞术中，可想到执行荧光校正以便从目标荧光染料仅提取目标光信息。
44.荧光校正是例如进行用于减去已经泄漏的光以从目标荧光染料获得光的校正。
45.然而，在光谱彼此接近的荧光染料的情况下，对光电探测器的泄漏大，因此在一些情况下不能进行荧光校正。
46.作为解决这种问题的方法，例如，可以设想使用光谱流式细胞仪。光谱流式细胞仪是通过利用用于染色的荧光染料的光谱信息去卷积(解混)从微粒测量的荧光数据来分析每个微粒的荧光量的系统，并且包括用于检测光谱的阵列型高灵敏度光电探测器而不是包括在常规流式细胞仪中的许多高灵敏度光电探测器。
47.如上所述，这种光谱流式细胞仪可以从一个微粒获得大量的荧光信息。因此，各种荧光分离处理可以用于从光谱流式细胞仪获得的荧光信息。
48.然而，根据光谱流式细胞仪本身、待测量的微粒等的性能，在荧光分离性能、处理时间、可靠性、结果稳定性等方面产生差异。因此，难以为每个待测量物体设定合适的荧光分离方法。
49.此外，许多现有的光谱流式细胞仪被配置成使得用户可以通过将参数自由度限制到可以由一般用户控制的范围来容易地操作光谱流式细胞仪。因此，存在光谱流式细胞仪最初具有的荧光染料的分离能力不能最大化的情况。
50.因此，以下实施例提出了一种信息处理装置、信息处理方法、程序和光学测量系统，其中，通过使得能够根据待测量物体设置合适的荧光分离方法来进一步提高荧光染料的分离能力。
51.2.实施例
52.在下文中，将参考附图详细描述本公开的第一实施方式。
53.2.1流式细胞仪的概述
54.根据本实施方式的流式细胞仪可以是使用称为流式细胞仪的分析方法分析每个样本的装置。在流式细胞仪中，样本被标记有在特定条件下发射光的荧光试剂，并且当利用激发光束照射样本时发射的光被收集作为荧光信息。可以从该荧光信息分析细胞。
55.在一般的流式细胞仪中，通过使用光学滤光器针对每个波长范围划分和提取从样本发射的荧光光束，并且通过测量荧光获得的数据被用作关于荧光染料的信息(对应于以下荧光染料信息)。
56.同时，在光谱流式细胞仪中，包括棱镜等的分光器在不使用光学滤光器的情况下分离各波长的光的荧光光束并测量各波长的光强度，从而获取从样本发射的光的光谱信息。以下，将测定光谱信息称为测量光谱。然后，使用荧光光谱基准，通过称为光谱解混(在下文中，简称为解混)的方法，分离每种荧光染料的该测量光谱。
57.在此，荧光光谱基准是用作每种荧光染料的参考的光谱信息，并且可以是例如从用单一荧光染料标记的样本(在下文中，也称为单一染色样本)测量的荧光成分的光谱信息。此外，荧光光谱基准的定义可包括例如从未标记样本(在下文中，也称为未染色样本)测
量的自发荧光成分的光谱信息(在下文中，称为自发荧光光谱)。作为荧光光谱基准，可以使用通过光谱流式细胞仪实际测量的值，或者可以使用从荧光染料的提供商提供的目录值等。
58.本实施例中的解混是用于通过使用各荧光染料的荧光光谱基准的线性和进行由光谱流式细胞仪测量的测量光谱的近似来从测量光谱中获得各荧光染料的荧光染料信息(例如，荧光强度)的方法。将通过解混产生的每种荧光染料的荧光染料信息用于例如样本如细胞的分析。
59.应注意，本说明书中的荧光信号可被定义为包括测量光谱和荧光染料信息两者的概念。
60.在本实施方式中，作为光学测量装置，例示能够获取测量光谱和荧光染料信息两者的光谱流式细胞仪，但是本公开不限于此，并且还可以使用获取荧光染料信息的普通流式细胞仪。
61.在此，在流式细胞仪中，存在微芯片方法、液滴方法、比色皿方法、流动池方法等作为用于将样本提供至流路上的观察点(在下文中，称之为点)的方法。在本实施方式中，举例说明了微芯片方法(部分，流动池方法)流式细胞仪，但是本公开不限于此，并且可以是另一供应方法的流式细胞仪。
62.此外，流式细胞仪包括用于分析样本(诸如细胞)的分析器类型和用于分析和分选样本的细胞分选器类型。在本实施方式中，举例说明了分析仪型流式细胞仪，但是本公开不限于此，并且可以是分类器型流式细胞仪。
63.此外，本公开不限于流式细胞仪，并且可以是利用激发光束照射样本并且基于其荧光分析样本的各种光学测量装置。例如，本公开可以是获取诸如载玻片上的组织切片的样本的图像的显微镜。
64.2.2光谱流式细胞仪的示意性配置实例
65.图1是示出了在本实施方式中使用的光谱流式细胞仪(在下文中，简称为流式细胞仪)的示意性配置实例的示意图。此外，图2是示出了图1中所示的流式细胞仪的示意性配置实例的框图。注意，为了便于附图，在图1和图2中的每个图中省略了一些光学元件。
66.如图1和图2所示，根据本实施方式的流式细胞仪1包括光源单元100、解复用光学系统150、散射光检测单元130和荧光检测单元140，并且使用微芯片120检测来自被供应至预定流路的样本的光。
67.样本是，例如，源自生物的颗粒，如细胞、微生物、或生物相关的颗粒，并且包括多个源自生物的颗粒的群体。样本可以是，例如，细胞，如动物细胞(例如，血细胞)或植物细胞，微生物，如包括大肠杆菌的细菌，包括烟草花叶病毒的病毒，或包括酵母的真菌，构成染色体的细胞的生物相关颗粒，脂质体，线粒体，外来体，或各种细胞器，或生物衍生的微粒，如包括核酸、蛋白质、脂质、糖链的生物相关聚合物，及其复合物。此外，样本广泛地包括合成颗粒如胶乳颗粒、凝胶颗粒或工业颗粒。此外，工业颗粒可以是，例如，有机或无机聚合物材料，或金属。有机聚合物材料包括聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯等。无机聚合物材料包括玻璃、二氧化硅、磁性材料等。金属包括金胶体、铝等。这些颗粒中的每一个的形状通常是球形的，但可以是非球形的，并且其尺寸、质量等没有特别限制。
68.在此，用一种或多种荧光染料标记(染色)样本。可以通过已知方法用荧光染料标
记样本。例如，当样本是细胞时，选择性结合至细胞表面上存在的抗原的荧光标记的抗体与待测量的细胞混合，并且荧光标记的抗体结合至细胞表面上的抗原。因此，待测量的细胞可以用荧光染料标记。
69.荧光标记的抗体是荧光染料作为标记与其结合的抗体。具体地，荧光标记的抗体可以是通过抗生物素蛋白-生物素反应将抗生物素蛋白结合至生物素标记的抗体的荧光染料结合至获得的抗体。或者，荧光标记的抗体可以是荧光染料直接结合的抗体。注意，作为抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体。此外，不特别限制用于标记样本的荧光染料，并且可以使用至少一种用于染色细胞等的已知染料。
70.(光源单元100)
71.如图1所示，光源单元100包括例如一个或多个(在该实例中为三个)激发光源101至103、全反射镜111、二色镜112和113、全反射镜115以及物镜116。
72.在该配置中，全反射镜111、二色镜112和113以及全反射镜115构成波导光学系统，其将分别从激发光源101至103发射的激发光束l1至l3引导到预定光路上。
73.物镜116构成将在预定光路上传播的激发光束l1至l3会聚在设置在微芯片120内的流路上的光斑123a上的聚光光学系统。注意，光斑123a的数量不限于一个。即，激发光束l1至l3可以会聚在不同的斑点上。此外，激发光束l1至l3的聚光位置不需要与光斑123a一致，并且可以在其各自的光轴上前后移动。
74.在图1所示的实例中，布置分别发射具有不同波长的激发光束l1至l3的三个激发光源101至103。例如，对于激发光源101至103中的每一个，可以使用发射相干光的激光光源。例如，激发光源102可以是发射蓝色激光束(峰值波长：488nm(纳米)，功率：20mw)的二极管泵浦固态激光器(dpss激光器)。此外，激发光源101可以是发射红色激光束(峰值波长：637nm，功率：20mw)的激光二极管，并且类似地，激发光源103可以是发射近紫外激光束(峰值波长：405nm，功率：8mw)的激光二极管。此外，分别从激发光源101至103发射的激发光束l1至l3可以是脉冲光束。
75.例如，全反射镜111在预定方向上全反射从激发光源101发射的激发光束l1。
76.二色镜112是使由全反射镜111反射的激发光束l1的光轴与从激发光源102发射的激发光束l2的光轴重合或平行的光学元件。例如，二色镜112透射来自全反射镜111的激发光束l1并且反射来自激发光源102的激发光束l2。作为二色镜112，例如，可以使用被设计成透射具有637nm的波长的光并且反射具有488nm的波长的光的二色镜。
77.二色镜113是使来自二色镜112的激发光束l1和l2的光轴与从激发光源103发射的激发光束l3的光轴重合或平行的光学元件。例如，二色镜113透射来自全反射镜111的激发光束l1并且反射来自激发光源103的激发光束l3。作为二色镜113，例如，可以使用被设计成透射具有637nm波长的光和具有488nm波长的光并且反射具有405nm波长的光的二色镜。
78.最终被收集为由二色镜113在相同方向上行进的光的激发光束l1至l3由全反射镜115全反射并且入射在物镜116上。
79.应注意，用于将激发光束束l1至l3转换成平行光的光束成形单元可以设置在从每个激发光源101至103至物镜116的光路上。光束整形单元可以包括例如一个或多个透镜、反射镜等。
80.物镜116将入射的激发光束l1至l3聚集在随后描述的微芯片120中的流动路径上
的预定光斑123a上。在样本穿过光斑123a的同时，用作为脉冲光束的激发光束l1至l3照射光斑123a。因此，从样本发射荧光光束，并且激发光束l1至l3被样本散射以产生散射光束。
81.在本说明书中，在所有方向上从样本生成的散射光中，将在预定角度范围内沿激发光束l1至l3的前进方向向前行进的分量称为前向散射光束l12，将在预定角度范围内沿激发光束l1至l3的前进方向向后行进的分量称为后向散射光，并且将在相对于激发光束l1至l3的光轴的预定角度之外的方向上的分量称为侧向散射光。
82.物镜116具有例如相对于光轴对应于约30
°
至40
°
的数值孔径。在从样本发射的荧光光束中，沿激发光束l1至l3的行进方向在预定的角度范围内向前行进的分量(在下文中，称为荧光光束l13)和前向散射光束l12被输入至沿激发光束l1至l3的行进方向向前布置的解复用光学系统150。
83.(解复用光学系统150)
84.如图1和图2所示，例如，解复用光学系统150包括滤光器151、准直透镜152、分色镜153以及全反射镜154(见图1)。然而，本公开不限于该配置，并且可以进行各种修改。
85.在激发光束l1至l3的光路上布置在微芯片120的下游侧的滤光器151选择性地阻挡例如传播至微芯片120的下游侧的光束l11中的激发光束l1至l3的一部分(例如，激发光束l1和l3)。此处，行进至微芯片120的下游侧的光包括从微芯片120中的样本发射的激发光束l1至激发光束l3(包括其前向散射光束)和荧光光束l13。因此，滤光器151阻挡激发光束l1和l3的分量，并透射激发光束l2(称为前向散射光束l12)和荧光光束l13的分量。
86.注意，滤光器151被布置为相对于光束l16的光轴倾斜。因此，防止了由滤光器151反射的光束l16的返回光经由物镜116等入射在散射光检测单元130等上。
87.例如，通过准直透镜152将已穿过滤光器151的前向散射光束l12和荧光光束l13转换成平行光，然后通过分色镜153解复用。例如，分色镜153反射前向散射光束l12并且透射入射光束之外的荧光光束l13。由分色镜153反射的前向散射光束l12被引导至散射光检测单元130，并且已经穿过分色镜153的荧光光束l13被引导至荧光检测单元140。
88.(散射光检测单元130)
89.散射光检测单元130包括：例如，多个透镜131、133、以及135，其成形由分色镜153和全反射镜132反射的前向散射光束l12的光束截面；隔膜137，其调节前向散射光束l12的光量；掩模134，其选择性地透射具有前向散射光束l12的特定波长的光(例如，激发光束l2的分量)；以及光电探测器136，其检测穿过掩模134和透镜135并且入射在其上的光。
90.光电探测器136包括例如二维图像传感器、光电二极管等，并且检测已经穿过掩模134和透镜135并且入射在掩模134和透镜135上的光的光量和大小。由光电探测器136检测的信号被输入到例如稍后描述的信息处理系统10中的装置控制单元11、数据记录单元13和/或数据分析单元14。
91.(荧光检测单元140)
92.例如，荧光检测单元140包括分光光学系统141和光电探测器142，分光光学系统141将入射荧光光束l13光谱分散成针对每个波长的分散光束l14，光电探测器142检测针对每个预定波长带(也称为信道)的分散光束l14的光量。
93.分光光学系统141包括例如一个或多个光学元件141a(诸如棱镜和衍射光栅)，并且将入射荧光l13分光成色散光束7l14以根据波长变化的角度发射。
94.光电探测器142可包括例如接收用于每个信道的光的多个光接收单元。在这种情况下，多个光接收单元可被布置在由分光光学系统141沿分光方向的一列或者两列或更多列中。此外，例如，对于每个光接收单元，可以使用诸如光电倍增管的光电转换元件。然而，可以使用二维图像传感器等代替多个光接收单元。
95.由光电探测器142检测并指示用于每个信道的荧光l13的光量的信号(荧光信号)被输入至例如稍后描述的信息处理系统10中的装置控制单元11、数据记录单元13和/或数据分析单元14。
96.2.3信息处理系统的示意性配置实例
97.图3是示出了根据本实施方式的信息处理系统的示意性配置实例的框图。如图3所示，信息处理系统10大致包括设置测量条件并控制装置的操作的装置控制单元11(即，流式细胞仪1)、检测许多样本的荧光量的荧光光谱检测单元12、记录每个检测样本的光谱信息的数据记录单元13、以及执行各种数据处理以从记录数据获得期望分析结果的数据分析单元14。
98.(装置控制单元11)
99.装置控制单元11通过改变在微芯片120的流路中流动的样本的进液条件和激发光源101至103的激光输出的参数、光电探测器136和142的灵敏度控制、包括诸如分色镜153的光学系统中的每个光学元件的光学台的位置调整等来优化测量条件。作为特定操作程序，为了设置对于待测量的样本可以获得期望结果的最佳条件，用户在微芯片120中供给实际样本，并且在观看由光电探测器142检测的荧光信号的同时根据需要重复调整各种参数的操作。为了使参数设置的容易改变成为可能，装置控制单元11由例如终端装置(诸如个人计算机(pc))构成。用户通过主要由装置控制单元11执行的控制软件输入各种参数的改变。
100.(荧光光谱检测单元12)
101.例如，荧光光谱检测单元12对应于参考图1和图2描述的流式细胞仪1，并且光学地分析样本。具体地，荧光光谱检测单元12首先分别从激发光源101至103发射激发光束l1至l3，并用激发光束l1至l3照射在流路中流动的样本。接下来，荧光光谱检测单元12检测从样本发射的荧光光束l13。例如，如上所述，荧光光谱检测单元12使用分色镜153、滤光器151等将具有特定波长的光束(目标荧光光束l13)与从样本发射的光分离，并且使用诸如32通道光电倍增管(pmt)或图像传感器的光电探测器142检测分离的光束。此时，荧光光束l13通过包括例如棱镜或衍射光栅的分光光学系统141分光，并且检测具有根据光电探测器142的信道变化的波长的光束。结果，可以容易地获得检测到的光束(荧光光束)的光谱信息。待分析的样本没有特别限制，并且其实例包括细胞和微珠。
102.(数据记录单元13)
103.数据记录单元13是例如使用存储器或磁盘的记录装置，并且记录由荧光光谱检测单元12获取的每个样本的光谱信息以及散射光束、时间和位置的信息，除了光谱信息之外。在细胞等的正常样本分析中，在一个实验条件下分析数千至数百万的样本。因此，在数据记录单元13中，例如，针对每个实验条件，以有组织的状态记录多条光谱信息。
104.(数据分析单元14)
105.数据分析单元(分离单元)14例如由诸如pc的信息处理装置构成，对由荧光光谱检测单元12检测的每个波长区域中的光强度进行量化，并且执行解混以获得所使用的每种荧
光染料的荧光量(强度)。对于该解混，例如，可以使用通过使用由实验数据计算的荧光光谱基准的最小二乘法的线性拟合。
106.可以使用从仅用一种荧光染料染色的单个染色样本获得的两种类型的光谱信息和从未染色样本获得的光谱信息通过统计处理来计算荧光光谱基准。通过适当地执行该统计处理，用于染色的荧光染料的荧光光谱基准的特殊光谱形状和未染色样本的自发荧光成分的光谱形状(这也是荧光光谱基准之一)可从通过流式细胞仪1测量的实际数据中估计。
107.所计算的荧光光谱基准与诸如荧光分子名称、测量日期和样本的类型的信息一起被记录在数据记录单元13中。由数据分析单元14估计的样本的荧光量也被存储在数据记录单元13中，根据目的绘制并显示，并且由此用于由用户分析样本。
108.以这种方式，数据分析单元14执行从从许多样本测量的光谱信息(在下文中，称为测量数据)计算荧光量的解混。在解混中，例如，通过基于最小二乘法的过程计算每种荧光染料的荧光量。在本实施方式中，从测量数据中正确地计算与由数据分析单元14执行的解混相关的参数，从而实现根据目的荧光分离过程计算的高分辨率。
109.2.4关于解混
110.图4是用于说明根据本实施方式的解混的概要的示图。如图4所示，在根据本实施方式的解混中，使用从单个染色样本获得的光谱信息提取的荧光染料的光谱波形作为荧光光谱基准(图4中的(a)中所示的荧光光谱基准r1至r4)，并且通过计算以分离测量数据(解混)中包括的每种荧光染料的光谱信息(图4中的(c)中所示的光谱信息c1至c4)，计算从多染色样本测量的光谱信息(图4中的(b)中所示的光谱信息c1 c2 c3 c4)中包括的每种荧光染料的荧光强度。
111.在该解混中，可使用如以下公式(1)中所示的最小二乘法(lsm)、如公式(2)中所示的加权最小二乘法(加权lsm)等。
[0112][0113][0114]
注意，在公式(1)和(2)中，s表示矩阵(在下文中，称为基准光谱)，其中用于解混的荧光光谱基准被布置在列方向上，s
t
表示基准光谱s的转置矩阵，yj表示测量光谱信息(也称为观测值)，并且xi表示要获得的荧光强度。注意，在本说明书中，i和j是1或更大的整数。另外，在公式(2)中，l表示由下面的公式(3)表示的加权系数矩阵。此外，在公式(3)中，λi表示由下面的公式(4)表示的加权系数。
[0115]
[0116][0117]
poisson noise term泊松噪声项
[0118]
fixed noise term固定噪声项
[0119]
如公式(1)至公式(4)中所示，在解混中，使用包括基于通过流式细胞仪测量的光量的泊松噪声项的通用最小二乘法(lsm)或wlsm。其中，当使用lsm时，计算量小并且处理时间短，但是，另一方面，具有小荧光强度的部分的贡献小。因此，当使用wlsm时，流式细胞仪的实际数据中的正和负之间的分离性能通常更好。
[0120]
注意，当使用wlsm时，期望设置固定噪声项，以防止过大的权重被施加到具有小值的数据。对于该固定噪声项，例如，具有基于在装置开发阶段的评估经验上改善的分离性能的常数可用作固定值。
[0121]
2.5关于针对每个测量信道的固定噪声的优化
[0122]
在根据本实施例的解混算法中，可以通过将公式(4)中的固定噪声项设置为根据测量信道而变化的最佳值来改善荧光分离性能。用于固定噪声项的值可以例如从未染色样本的测量数据的每个信道的变化来计算。未染色样本的测量数据包括样本的所有自发荧光、装置的噪声、激发光束l1至l3的拉曼位移的影响等。因为来自荧光染料的荧光组分以加到未染色样本的自发荧光的形式被检测，所以未染色样本的测量变化确定检测极限。
[0123]
图5是示出在未染色微粒用作未染色样本时获得的光谱信息和标准偏差的实例的曲线图。图5的(a)示出了通过测量未染色的微珠获得的光谱信息，并且图5的(b)示出了其标准偏差。通过基于如图5中所示的波形设置固定噪声项，可以改善通过解混的分离性能。
[0124]
应注意，通过设置图5中所示的波形，用于待测量的每个样本，如各种类型的电池或微珠，以及每个实验，可以设置最佳条件。此外，因为即使在使用正常流式细胞仪的测量中，该设置所必需的未染色状态下的样本的测量也是必要项，所以可以在不使用户进行额外工作的情况下执行最佳分离处理。
[0125]
2.6关于有限的自发荧光校正
[0126]
接下来，将描述根据本实施例的用于最优地执行自发荧光校正功能的分离算法。
[0127]
图6是示出不包括自发荧光光谱的基准光谱的实例的示图，并且图7是示出包括自发荧光光谱的基准光谱的实例的示图。注意，这里的基准光谱对应于上述公式(1)和(2)中的基准光谱s。图6中所示的基准光谱s包括四种荧光组分(荧光染料)的荧光光谱基准：异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)、pe-dazzle 594和别藻蓝蛋白(apc)。此外，除了图6中示出的四个荧光光谱基准之外，图7中示出的基准光谱s还包括样本自身的自发荧光光谱。应注意，图6和图7示出了作为每个荧光光谱基准(包括自发荧光光谱)的光谱波形的曲线图，但实际上，每个荧光光谱基准的每个信道的荧光强度被存储在与每个荧光光谱基准对应的行中。
[0128]
如上所述，当执行解混时，流式细胞仪1将荧光染料的基准光谱用作参考(参见图
6)。具体地，通过从观测值[y1，...，ym]中减去观测值[y1，...，ym]与未染色样本的平均值(自发荧光量的平均值)之间的差，并使用图6所示的基准光谱s对结果执行wlsm(参见公式(2)至(4))，得到每种荧光染料的荧光强度[x1，...，xn]。
[0129]
在这种解混中，如图7所示，通过将样本的自发荧光光谱加入到基准光谱s，可执行更理想的荧光分离过程。具体地，通过使用基准光谱s执行wlsm，其中图7所示的自发荧光光谱照原样被添加到观测值[y1，...，ym]中(参见公式(2)-(4))，得出各荧光染料的荧光强度[x1，...，xn]。
[0130]
然而，当自发荧光光谱照原样加入到到基准中时，其他荧光染料的分离结果的变化被放大，并且荧光分离性能可能劣化。这将参考图8和图9进行描述。
[0131]
图8是示出当使用不包括自发荧光光谱的基准光谱时的解混结果的二维曲线图，并且图9是示出当使用包括自发荧光光谱的基准光谱时的解混结果的二维曲线图。如在图8和图9中由虚线包围的二维图中，在ssc_a
×
cd3_viogreen_a的二维图中，图中的左下分布d1在垂直轴方向上扩展(图8
→
图9)，并且在cd16_fitc_a
×
cd56_pc5_a的二维图中，图中的左分布d2在水平轴方向上扩展(图8
→
图9)。
[0132]
如上所述，作为通过使用包括自发荧光光谱的基准光谱使荧光分离性能劣化的因素之一，认为接近包括在基准中的自发荧光光谱的形状的荧光染料的荧光光谱基准被包括在基准光谱中。这将参考图10进行描述。
[0133]
图10是示出当使用仅包括自发荧光光谱的基准光谱时以及当使用包括荧光染料的自发荧光光谱和荧光光谱基准两者的基准光谱时的解混结果的实例的示图。图10的(a)示出从未染色样本测量的测量数据的二维图。图10的(b1)示出了仅包括未染色样本的自发荧光光谱的基准光谱的实例，并且(c1)示出了使用(b1)中示出的基准光谱的(a)的未混合测量数据的结果。此外，图10的(b2)示出除了自发荧光光谱之外还包括荧光染料的荧光光谱基准的基准光谱的实例，并且(c2)示出使用(b2)中示出的基准光谱的(a)的解混测量数据的结果。
[0134]
如图10所示，可以看出，在除了自发荧光光谱((b1)
→
(c1))之外还使用包括荧光染料的荧光光谱基准的基准光谱的解混的情况下的自发荧光成分的变化量w2大于在仅包括自发荧光光谱((b2)
→
(c2))的基准光谱的解混的情况下的自发荧光成分的变化量w1。如上所述，其因素之一被认为是(b2)的基准光谱包括接近自发荧光光谱的光谱形状的荧光染料的荧光光谱基准。
[0135]
因此，在本实施例中，如以下公式(5)所示，将用于抑制基准光谱中的自发荧光成分(自发荧光光谱)的惩罚项添加到用于执行wlsm的上述公式(2)。注意，在公式(5)中，p表示惩罚系数，i表示单位矩阵。
[0136][0137]
penalty term惩罚项
[0138]
惩罚系数p是根据流式细胞仪1的装置条件等确定的值。例如，当作为装置条件在
流式细胞仪1中设置的荧光强度的可检测范围的上限值为约106时，惩罚系数可被设置为约10-8
。
[0139]
惩罚项pi通过将基准光谱s中的一行自发荧光光谱a乘以ε(0＜ε＜1)来抑制基准光谱中的自发荧光成分，如以下公式(6)中所示。注意，在公式(6)中，ε是用于校正自发荧光光谱的参数(自发荧光校正参数)并且是正则化参数。此外，a’表示通过自发荧光校正参数减小的自发荧光光谱ε。
[0140]a′
＝εa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(6)
[0141]
自发荧光校正参数的值ε可被设置为大于0且小于1的值，例如，0.1以下。大致地，可以例如使用以下公式(7)来确定自发荧光校正参数ε。应注意，在公式(7)中，l表示加权平方误差(也称为加权矩阵)，并且a表示还原之前的自发荧光光谱。
[0142][0143]
通过利用这种自发荧光校正参数ε减小基准光谱s中的自发荧光成分，如图11所示，包括图7所示的自发荧光光谱a的基准光谱s被转换成其中自发荧光光谱a利用自发荧光校正参数ε减小为自发荧光光谱a’的基准光谱s。要注意的是，图11为示出根据本实施方式的受限基准光谱的实例的示图。
[0144]
以这种方式，通过利用自发荧光校正参数ε限制基准光谱s中的自发荧光成分，可以抑制自发荧光成分的变化的增加。结果，可抑制解混中的自发荧光成分的变化的影响，并且因此可抑制荧光分离性能的劣化。即，在本实施方式中，通过将惩罚系数p和自发荧光校正参数ε设定为适当的值，即使当使用包括自发荧光成分的基准光谱时，也可以抑制荧光分离性能的劣化。
[0145]
注意，这里，已经例示了仅利用自发荧光校正参数ε限制自发荧光成分的情况，但是本实施例不限于此，并且能够利用自发荧光校正参数ε限制荧光染料的荧光光谱基准。例如，可利用自发荧光校正参数ε限制包括在染色样本中的具有小的绝对量的荧光染料或者最初具有小的荧光强度的荧光染料。然而，这种情况下的自发荧光校正参数ε可以是与用于另一荧光染料和自发荧光的自发荧光校正参数ε不同的值。
[0146]
2.7关于有限自发荧光校正参数的自动确定
[0147]
在以上描述中，惩罚系数p(或惩罚项pi)是根据如上所述作为装置条件的荧光强度的上限值的设定而确定的值，因此可以根据装置的设定而自动确定。即，在本实施方式中，例如，数据分析单元14可基于在流式细胞仪1中设置的装置条件(荧光强度等的上限值)自动确定惩罚系数p。
[0148]
同时，自发荧光校正参数ε是为待测量的每种类型的样本或每组样本(在下文中，称为样本组)需要适当设置的量。然而，也可以通过以下方法自动确定自发荧光校正参数ε。
[0149]
图12是示出根据本实施例的自发荧光校正参数的自动确定操作的示例的流程图。应注意，例如，该操作可以是由数据分析单元14执行的操作。因此，以下将该操作描述为由数据分析单元(确定单元)14执行的操作。
[0150]
如图12所示，在本操作中，首先，数据分析单元14执行测量数据的校正(步骤s101)。在测量数据的校正中，除了上述荧光校正之外，例如，执行从数据记录单元13中记录的测量数据中提取从与待分析的染色样本相同或相似类型的未染色样本获得的测量数据
的过程。
[0151]
注意，在步骤s101中提取的未染色数据可以是每次执行分析时使用流式细胞仪1测量的测量数据，或者可以是通过对于与待分析的染色样本相同或同一类型的未染色样本的过去执行而记录在数据记录单元13中的未染色数据。与待分析的染色样本相同或类型的未染色样本可以是在标记待分析的染色样本之前的未染色样本、与待分析的染色样本相同类型(例如，相同类型的细胞等)的未染色样本等。
[0152]
接下来，计算校正的未染色数据的简单平均值，并且从未染色数据中减去计算的简单平均值(步骤s102)。
[0153]
接下来，数据分析单元14使用仅包括与从其获取未染色数据的未染色样本相同或类型相同的未染色样本的自发荧光光谱的基准光谱s，对通过在步骤s102中减去简单平均值而获得的未染色数据进行解混(步骤s103)。
[0154]
接下来，数据分析单元14计算在步骤s103中通过解混计算的自发荧光的荧光强度(在下文中，也称为自发荧光量)的标准偏差σ0(步骤s104)。这里，由于在步骤s102中从未染色数据中减去简单平均值，因此在步骤s103中获得的自发荧光量的分布是以零为中心的分布。因此，在步骤s104中，计算以零为中心的标准偏差σ0。
[0155]
接下来，数据分析单元14将自发荧光校正参数ε设定为初始值(步骤s105)。自发荧光校正参数ε的初始值可以是小于1的值，诸如0.1。
[0156]
接下来，如公式(6)中所示，数据分析单元14利用自发荧光校正参数ε来衰减包括在基准光谱s中的自发荧光光谱a(步骤s106)。
[0157]
接下来，数据分析单元14将通过在步骤s102中减去简单平均值而获得的未染色数据与利用自发荧光校正参数ε衰减自发荧光光谱a的基准光谱s解混(步骤s107)。注意，在步骤s107中，由于未混合的对象是未染色数据，因此作为未混合的结果而获得的荧光量是自发荧光量。
[0158]
接下来，数据分析单元14在步骤s107中计算通过解混计算的自发荧光量的标准偏差σ
0n
(步骤s108)。注意，如在步骤s104中，由于在步骤s102中从未染色数据减去简单平均值，因此在步骤s107中获得的自发荧光量的分布是以零为中心的分布。因此，在步骤s108中，计算以零为中心的标准偏差σ
εn
。
[0159]
接下来，数据分析单元14确定自发荧光校正参数ε是否等于或小于自发荧光校正参数ε的预设最小值ε_min(步骤s109)。如果自发荧光校正参数ε大于最小值ε_min(步骤s109中的否)，则数据分析单元14将自发荧光校正参数ε减小预定宽度δ(步骤s110)，然后返回到步骤s106，并执行后续操作。注意，预定宽度δ可以是例如充分小于1的值，诸如0.01或0.005。
[0160]
同时，如果自发荧光校正参数ε已达到最小值ε_min或更小(步骤s109中的“是”)，则数据分析单元14针对通过重复步骤s106至s110计算的每个自发荧光校正参数ε线性地内插标准偏差σ
εn
以获得自发荧光校正参数ε的最佳值，例如，σ
εn
＝σ0的自发荧光校正参数ε(步骤s111)，并结束本操作。
[0161]
注意，在上述操作中，已经例示了以下情况：以预设的预定宽度δ的间隔指定标准偏差σ
εn
，线性内插通过各自发荧光校正参数ε获得的标准偏差σ
εn
，由此标准偏差σ
εn
和标准偏差σ0彼此一致。然而，本公开不限于此。然而，当标准偏差σ
εn
小于或大于标准偏差σ0时，由
校正的自发荧光光谱a’表示的自发荧光量与另一荧光光谱基准的比率偏离测量数据中包括的自发荧光成分与另一荧光染料的荧光光谱的比率，并且存在不能抑制荧光分离性能的劣化的可能性。因此，期望标准偏差σ
εn
与标准偏差σ0在一定程度上一致。
[0162]
如上所述，通过从未染色数据与仅包括自发荧光光谱的基准光谱s和包括自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱s未混合的结果来确定最佳自发荧光校正参数ε，可以通过使用在使用流式细胞仪1进行的分析中通常测量的信息(未染色数据和自发荧光光谱)来确定自发荧光校正参数ε的最佳值。因此，可以在不增加用户负担的情况下执行适当的分析。
[0163]
2.8作用和效果
[0164]
如上所述，根据本实施例，由于用自发荧光校正参数ε限制基准光谱s中的自发荧光成分，因此可以抑制自发荧光成分的变化的增加。结果，可抑制解混中的自发荧光成分的变化的影响，并且因此可抑制荧光分离性能的劣化。即，在本实施方式中，通过将惩罚系数p和自发荧光校正参数ε设定为适当的值，即使当使用包括自发荧光成分的基准光谱时，也可以抑制荧光分离性能的劣化。
[0165]
图13至图15是用于解释当根据本实施方式的自发荧光校正参数ε改变时，荧光分离性能的改变的示图。图13示出自发荧光校正参数ε为1，即，基准光谱s中的自发荧光成分未被减少(不受限制)的情况，图14示出自发荧光校正参数ε为0.1的情况，并且图15示出自发荧光校正参数ε为0.025的情况。
[0166]
应注意，在图13至图15中，(a)示出了通过将测量数据与基准光谱s解混而获得的每种荧光染料的荧光光谱和自发荧光光谱，(b)示出了通过将未染色数据与基准光谱s解混而获得的自发荧光量的标准偏差σ
ε
(c)示出了作为待分离的荧光染料的apc_vio770和pc5(pe-cy5)的二维曲线图，以及(d)示出了作为待分离的荧光染料的fitc和viogreen的二维曲线图。
[0167]
在图13至图15的(a)中，轮廓线表示测量数据，并且实线和虚线表示荧光光谱基准(包括自发荧光光谱)。应注意，在荧光光谱基准中，l1至l3是自发荧光光谱。
[0168]
如从图13至图15中可以看出，当自发荧光校正参数ε设置为0.025(图15)时，具体地，fitc与viogreen之间的变化的扩展(参见各图的(d))也小。这指示当自发荧光校正参数ε被设置为0.025时与当自发荧光校正参数ε被设置为1或0.1时相比改善了荧光分离性能。
[0169]
另外，在本实施例中，根据未染色数据与仅包括自发荧光光谱的基准光谱s和包括自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱s未混合的结果来确定最佳自发荧光校正参数ε。因此，可以通过使用在使用流式细胞仪1进行的分析中通常测量的信息(未染色数据和自发荧光光谱)来确定自发荧光校正参数ε的最佳值。因此，可以在不增加用户负担的情况下执行适当的分析。
[0170]
图16是示出当以不同的预定宽度δ改变自发荧光校正参数ε时从未染色样本获得的自发荧光量的标准偏差的变化的曲线图，其中(a)指示当预定宽度δ是0.1时在0至1的范围内的标准偏差的变化，以及(b)指示当预定宽度δ是0.005时在0至0.1的范围内的标准变化。如图16的(a)和(b)中所示，可以看出，当将预定宽度δ设置为小值时，即，当自发荧光校正参数ε更精细地改变时(参见(b))，与当将预定宽度δ设置为大值时(参见(a))相比，可以获得接近标准偏差σ0的更优化的自发荧光校正参数ε。
[0171]
此外，图17是示出当未提供惩罚项时的荧光分离性能，自发荧光光谱不受限制，并且当提供惩罚项并且自发荧光光谱受限制时的荧光分离性能的示图(本实施方式)。在图17中，(a)示出当未染色数据与仅包括自发荧光光谱的基准光谱未混合时的自发荧光量的变化(标准偏差σ0)，(b)示出当未染色数据与包括无限自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱未混合时的自发荧光量的变化(标准偏差σ
εn
)，以及(h)示出当未染色数据与包括有限自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱未混合时的自发荧光量的变化(标准偏差σ
εn
)。
[0172]
此外，(c)至(g)分别是示出当未染色数据与包括在(b)中示出的无限制的自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱未混合时的荧光分离性能的二维曲线图，以及(i)至(m)分别是示出当未染色数据与包括在(h)中示出的有限的自发荧光光谱和荧光光谱基准的基准光谱未混合时的荧光分离性能的二维曲线图。
[0173]
应注意，在图17的(h)至(m)中，惩罚系数p为10-7
，并且自发荧光校正参数ε为0.005。
[0174]
如参考图17中的(c)至(g)和(i)至(m)可以看出，如在本实施方式中，通过提供惩罚项pi并限制基准光谱s中的自发荧光光谱，改善了解混的荧光分离性能。
[0175]
例如，如(c)和(i)所示，在fitc和viogreen之间的关系中，当不提供惩罚项时，自发荧光光谱不受限制(参见(c))，fitc的标准偏差σ
fitc
为257，viogreen的标准偏差σ
viogreen
为271。另一方面，当提供惩罚项并且自发荧光光谱受到限制时(参见(i))，fitc的标准偏差σ
fitc
是190，并且viogreen的标准偏差σ
viogreen
是192。即，对于fitc，荧光分离性能提高26％，并且对于viogreen，荧光分离性能提高30％。
[0176]
另外，如(f)和(l)所示，在vioblue和apc之间的关系中，当不提供惩罚项并且不限制自发荧光光谱时(参见(f))，vioblue的标准偏差σ
vioblue
为268。另一方面，当提供惩罚项并且自发荧光光谱受到限制时(参见(l))，vioblue的标准偏差σ
vioblue
是189。即，荧光分离性能提高了30％。
[0177]
到目前为止，已经参考附图详细地描述了本公开的优选实施方式。然而，本公开的技术范围不限于这种实例。显然，本领域普通技术人员可以想到在权利要求中描述的技术思想的范围内的各种变形例或修改例，并且自然应当理解，这些变形例或修改例也属于本公开的技术范围。
[0178]
此外，在本说明书中描述的效果仅仅是说明性的或示例性的，而不是限制性的。即，根据本说明书的描述，根据本公开的技术可表现出对本领域技术人员显而易见的其他效果连同或代替上述效果。
[0179]
应注意，以下配置也属于本公开的技术范围。
[0180]
(1)
[0181]
一种信息处理装置，包括分离单元，所述分离单元从由一种或多种荧光染料标记的生物样本测得的荧光信号中，通过使用最小二乘法的算术运算分别计算从所述一种或多种荧光染料和所述生物样本发射的一个或多个荧光光束和自发荧光光束的荧光强度，所述最小二乘法使用每种所述荧光染料的荧光光谱基准和所述生物样本的自发荧光光谱，其中
[0182]
在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的每一个设置所述荧光强度的上限值和下限值。
[0183]
(2)
[0184]
根据(1)所述的信息处理装置，其中
[0185]
所述分离单元通过包括惩罚项的算术公式来分别计算从所述一种或多种荧光染料和所述生物样本发射的所述荧光光束和所述自发荧光光束的所述荧光强度，所述惩罚项设定所述一种或多种荧光染料和所述生物样本中的每一个的所述荧光强度的所述上限值和所述下限值。
[0186]
(3)
[0187]
根据(2)所述的信息处理装置，其中
[0188]
所述算术公式由以下公式(1)表示：
[0189][0190]
其中，xi(i是1或更大的整数)表示所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中每一个的荧光强度，yj(j是1或更大的整数)表示所述荧光信号，s表示包括所述荧光染料中每一个的荧光光谱基准和所述生物样本的自发荧光光谱的基准光谱，s
t
表示所述基准光谱s的转置矩阵，l表示加权系数矩阵，p表示惩罚系数，i表示单位矩阵，并且pi表示所述惩罚项。
[0191]
(4)
[0192]
根据(1)至(3)中任一项所述的信息处理装置，其中
[0193]
在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的至少一个设置的所述上限值和所述下限值分别与为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的另一个设置的所述上限值和所述下限值不同。
[0194]
(5)
[0195]
根据(4)所述的信息处理装置，其中
[0196]
所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的至少一者是所述自发荧光光束。
[0197]
(6)
[0198]
根据(2)或(3)所述的信息处理装置，其中
[0199]
所述算术公式包括用于设置所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的至少一者与所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的另一者之间的所述不同上限值的自发荧光校正参数。
[0200]
(7)
[0201]
根据(3)所述的信息处理装置，其中
[0202]
被包括在所述基准光谱s中的所述一个或多个荧光光谱基准和所述自发荧光光谱中的至少一者利用具有大于0且小于1的值的自发荧光校正参数来减小。
[0203]
(8)
[0204]
根据(6)或(7)所述的信息处理装置，进一步包括确定所述自发荧光校正参数的确定单元，其中
[0205]
确定单元
[0206]
通过使用利用所述自发荧光光谱的最小二乘法对从未染色生物样本测得的荧光信号执行算术运算来计算从未染色生物样本发射的自发荧光光束的荧光强度的第一标准偏差，
[0207]
通过使用利用所述荧光染料中的每一种的所述荧光光谱基准和所述自发荧光光谱的最小二乘法对从所述未染色生物样本测得的所述荧光信号执行所述算术运算来计算从所述未染色生物样本发射的所述自发荧光光束的所述荧光强度的第二标准偏差，以及
[0208]
确定所述自发荧光校正参数，使得所述第二标准偏差与所述第一标准偏差一致或者接近所述第一标准偏差。
[0209]
(9)
[0210]
根据(1)至(8)中任一项所述的信息处理装置，其中
[0211]
最小二乘法是加权最小二乘法。
[0212]
(10)
[0213]
一种信息处理方法，包括：通过使用最小二乘法的算术运算，从由一种或多种荧光染料标记的生物样本测得的荧光信号中分别计算从所述一种或多种荧光染料和所述生物样本发射的一个或多个荧光光束和自发荧光光束的荧光强度，所述最小二乘法使用每种所述荧光染料的荧光光谱基准和所述生物样本的自发荧光光谱，其中
[0214]
在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的每一个设置所述荧光强度的上限值和下限值。
[0215]
(11)
[0216]
一种用于使计算机起分析用一种或多种荧光染料标记的生物样本的作用的程序，其中
[0217]
所述程序使所述计算机执行以下处理：通过使用最小二乘法的算术运算从由所述生物样本测得的荧光信号中分别计算从所述一种或多种荧光染料和所述生物样本发射的一个或多个荧光光束和自发荧光光束的荧光强度，所述最小二乘法使用每种所述荧光染料的荧光光谱基准和所述生物样本的自发荧光光谱，以及
[0218]
在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的每一个设置所述荧光强度的上限值和下限值。
[0219]
(12)
[0220]
一种光学测量系统，包括：
[0221]
激发光源，用一个或多个激发光束照射用一种或多种荧光染料标记的生物样本；
[0222]
检测单元，检测荧光光束的荧光信号和通过所述一个或多个激发光束的照射从所述生物样本发射的自发荧光；以及
[0223]
分离单元，所述分离单元从通过所述检测单元检测的所述荧光信号中，通过使用最小二乘法的算术运算分别计算从所述一种或多种荧光染料和所述生物样本发射的一个或多个荧光光束和自发荧光光束的荧光强度，所述最小二乘法使用每种所述荧光染料的荧光光谱基准和所述生物样本的自发荧光光谱，其中
[0224]
在使用所述最小二乘法的算术运算中，为所述一个或多个荧光光束和所述自发荧光光束中的每一个设置所述荧光强度的上限值和下限值。
[0225]
参考标号列表
[0226]
1 流式细胞仪
[0227]
10 信息处理系统
[0228]
11 装置控制单元
[0229]
12 荧光光谱检测单元
[0230]
13 数据记录单元
[0231]
14 数据分析单元
[0232]
100 光源单元
[0233]
101至103 激发光源
[0234]
111、115 全反射镜
[0235]
112、113 分色镜
[0236]
116 物镜
[0237]
120 微芯片
[0238]
123a 光斑
[0239]
130 散射光检测单元
[0240]
131、133、135 透镜
[0241]
134 掩模
[0242]
136 光电探测器
[0243]
137 隔膜
[0244]
140 荧光检测单元
[0245]
141 分光光学系统
[0246]
141a 光学元件
[0247]
142 光电探测器
[0248]
150 解复用光学系统
[0249]
151 滤光器
[0250]
152 准直透镜
[0251]
153 分色镜
[0252]
154 全反射镜
[0253]
l1、l2、l3 激发光束
[0254]
l11 光束
[0255]
l12 前向散射光束
[0256]
l13 荧光光束
[0257]
l14 分散光束。