一种透骨香药材中多种成分含量测定的方法

1.本发明涉及中药检测技术领域，具体是一种透骨香药材中多种成分含量测定的方法。


背景技术：

2.透骨香为杜鹃花科植物滇白珠gaultheria yunnanensis(franch.)rehd.的干燥全株，主要分布在云南、四川、广西、贵州等地，全株均可入药，性平，味辛，具有清热解毒、活血祛瘀、祛风除温、降气平喘等功效,用于眩晕、风寒感冒、咳嗽哮喘、闭经、跌扑肿痛、风湿痹症的治疗，始载于明初兰茂所著的《滇南本草》(1459年)，在《广西植物资源》、《云南中草药》等地方书籍中也有描述。目前各省标准对于透骨香的用药部位并不统一，在《云南省中药材标准(第二册
·
彝族药)》中该植物名为透骨草，是滇白珠的干燥地上部分。而《中华本草》苗药卷中记载的透骨香为滇白珠的全株或根，《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)收载的药用部位为“全株”。临床常见含透骨香的复方成药有“滇白珠糖浆”、“复方伸筋胶囊”、“痛风灵”等，为苗族民间治疗类风湿病的习用药材，疗效突出。透骨香药材临床开发价值较高，但各地标准和著作中对其药用部位说法不一，限制了透骨香药材质量控制水平的提升和药材资源的深层次开发利用。
3.同一药材的不同药用部位，其成分含量会有较大的差异，如连翘不同部位中连翘酯苷a的含量相比较，连翘叶中连翘酯苷a的含量最高，青翘、连翘花、连翘心中连翘酯苷a的含量均较高，老翘中连翘酯苷a的含量较低。目前关于透骨香质量控制方面的研究较少，除薄层色谱鉴别研究外，只对透骨香中的水杨酸、总黄酮、槲皮苷，槲皮素、木脂素苷，水杨酸甲酯等单个或一类成分进行含量测定。zeng使用ce-ed法检测了透骨香及其制剂，包括( )-儿茶素、芦丁、龙胆酸、香草酸、水杨酸、槲皮素和原儿茶酸进行了鉴别和测定。但是样品量少，且并未对其不同部位进行分析。
4.申请人对透骨香进行了化学成分分析，从鉴定的18个成分中选择了与透骨香药理作用密切相关的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a这6个成分作为其质量。
5.因此，开发一种能同时测定透骨香药材中原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a这6个成分的测定方法是很有必要的。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种透骨香药材中多种成分含量测定的方法，具体如下：
7.一种透骨香药材中多种成分含量测定的方法，采用uplc-ms/ms方法进行测定；使用acquity i-class uplc beh c18色谱柱(2.1mm
×
100mm，内径1.7μm)进行分析；色谱柱和自动进样器分别保持在40℃和25℃，流速为0.3ml/min，进样量为1μl；流动相由0.1％的甲酸水溶液a和0.1％的乙腈甲酸b组成；洗脱梯度如下：0
–
0.5min，10％～10％b；0.5
–
2.5min；
10％～40％b；2.5
–
4分钟，40％～90％b；4
–
4.5分钟，90％～90％b；4.5
–
6分钟，90％～10％b。
8.进一步的，所述uplc-ms/ms方法，所用uplc-ms/ms系统由配备有电喷雾电离源的acquity i-class uplc系统和xevo tqs-三重四极串联质谱仪组成。进一步的，所述uplc-ms/ms系统，还配备了waters vanguard beh c18(2.1mm
×
5mm，1.7μm)色谱柱作为保护柱，对杂质进行过滤。
9.进一步的，所述uplc-ms/ms方法，其质谱仪参数如下：毛细管电压3.0kv；毛细管电离电压3.0kv；离子源温度为120℃；喷雾气体和反吹气体，n2；脱溶剂气流量，650l/h；和去溶剂化气体温度为350℃，使用多反应监测(mrm)模式进行定量。
10.进一步的，所述多反应监测模式下分析物的参数，具体如下：
[0011][0012]
进一步的，所述供试品溶液通过如下步骤制备得到：精密称取透骨香药材，精密加入50％甲醇25ml，称重后回流2h，冷却，加入50％甲醇进行补重，取200μl加入50％甲醇800μl涡混，离心12000rpm，10min，取上清液。
[0013]
进一步的，所述对照品溶液通过如下步骤制备得到：精密称取对照品适量，用甲醇稀释至10ml，分别获得绿原酸(1.020g/l)、原儿茶酸(1.035g/l)、表儿茶素(1.018g/l)、槲皮素(0.878g/l)、白珠树苷(1.030g/l)和滇白珠苷a(1.116g/l)的储备液；精密量取上述六种对照品储备溶液并稀释至最终浓度为绿原酸(0.012mg/ml)、原儿茶酸(0.041mg/ml)、表儿茶素(0.101mg/ml)、槲皮素(0.137mg/ml)、白珠树苷(0.077mg/ml)和滇白珠苷a(0.071mgm/l)；精密量取上述六种对照品的终浓度原液100μl，混合后得到混合对照品溶液，依次用2倍稀释法稀释后，保存在-20℃环境中备用。
[0014]
进一步的，所述多种成分含量测定，是同时测定透骨香药材中的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a含量。
[0015]
进一步的，所述uplc-ms/ms方法，所得数据均使用masslynxtm v 4.1软件(waters corp.，millford，ma，usa)获得，并使用quanlynatm v4.1(waters corp.，millford，ma，usa)工作站进行处理。
[0016]
本发明的具体操作步骤如下：
[0017]
(1)对照品溶液的制备：
[0018]
精密称取对照品适量，用甲醇稀释至10ml，分别获得绿原酸(1.020g/l)、原儿茶酸(1.035g/l)、表儿茶素(1.018g/l)、槲皮素(0.878g/l)、白珠树苷(1.030g/l)和滇白珠苷a
(1.116g/l)的储备液。精密量取上述六种对照品储备溶液并稀释至最终浓度为绿原酸(0.012mg/ml)、原儿茶酸(0.041mg/ml)、表儿茶素(0.101mg/ml)、槲皮素(0.137mg/ml)、白珠树苷(0.077mg/ml)和滇白珠苷a(0.071mgm/l)。精密量取上述六种对照品的终浓度原液100μl，混合后得到混合对照品溶液，依次用2倍稀释法稀释后，保存在冰箱(-20℃)中备用。
[0019]
(2)供试品溶液的制备：
[0020]
精密称取约0.2g药材，精密加入50％甲醇25ml，称重后回流2h，冷却，加入50％甲醇进行补重，取200μl加入50％甲醇800μl涡混，离心12000rpm，10min，取上清液进样，进样量1μl。
[0021]
(3)uplc-ms/ms处理：
[0022]
分别取混合对照品溶液和供试品溶液，按如下条件进行uplc-ms/ms测定：
[0023]
uplc-ms/ms系统由配备有电喷雾电离源的acquity i-class uplc系统和xevo tqs-三重四极串联质谱仪组成。使用acquity i-class uplc beh c18色谱柱(2.1mm
×
100mm，内径1.7μm)进行分析。该系统还配备了waters vanguard beh c18(2.1mm
×
5mm，1.7μm)色谱柱。色谱柱和自动进样器分别保持在40℃和25℃，流速为0.3ml/min，进样量为1μl。流动相由0.1％的甲酸水溶液a和0.1％的乙腈甲酸b组成。洗脱梯度如下：0
–
0.5min，10％～10％b；0.5
–
2.5min；10％～40％b；2.5
–
4分钟，40％～90％b；4
–
4.5分钟，90％～90％b；4.5
–
6分钟，90％～10％b。
[0024]
质谱仪参数如下：毛细管电压3.0kv；毛细管电离电压3.0kv；离子源温度为120℃；喷雾气体和反吹气体，n2；脱溶剂气流量，650l/h；和去溶剂化气体温度为350℃。使用多反应监测(mrm)模式进行定量。表2中列出了mrm模式下分析物的最佳参数。所有数据均使用masslynxtm v4.1软件(waters corp.，millford，ma，usa)获得，并使用quanlynatm v4.1(waters corp.，millford，ma，usa)工作站进行处理。
[0025]
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
[0026]
本发明采用uplc-ms/ms方法，采用由配备有电喷雾电离源的acquity i-class uplc系统和xevo tqs-三重四极串联质谱仪组成的uplc-ms/ms系统。使用acquity i-class uplc beh c18色谱柱(2.1mm
×
100mm，内径1.7μm)进行分析。色谱柱和自动进样器分别保持在40℃和25℃，流速为0.3ml/min，进样量为1μl。流动相由0.1％的甲酸水溶液a和0.1％的乙腈甲酸b组成。洗脱梯度如下：0
–
0.5min，10％～10％b；0.5
–
2.5min；10％～40％b；2.5
–
4分钟，40％～90％b；4
–
4.5分钟，90％～90％b；4.5
–
6分钟，90％～10％b。质谱仪参数如下：毛细管电压3.0kv；毛细管电离电压3.0kv；离子源温度为120℃；喷雾气体和反吹气体，n2；脱溶剂气流量，650l/h；和去溶剂化气体温度为350℃。使用多反应监测(mrm)模式进行定量。
[0027]
按照本发明的方法，可以快速同时分离透骨香药材中的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a，且分离效果好。方法的加样回收率为94.93％-105.4％，rsd≤4.12％。该方法简便、快速、准确且重复性好，可用于透骨香药材中原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a的含量测定，为提升透骨香药材的质量控制水平提供实验依据。
附图说明
[0028]
图1是透骨香hplc/q exactive plus ms质谱正离子模式总离子流图(a.东莨菪碱；b.丁香酚；c.山奈酚；d.熊果酸)。
[0029]
图2是透骨香hplc/q exactive plus ms质谱负离子模式总离子流图(a.原儿茶酸；b.原花青素a2；c.绿原酸；d.原花青素b2；e.香草酸；f.表儿茶素；g.白珠树苷；h.水杨酸；i.苯甲酸；j.槲皮苷；k.滇白珠苷a；l.槲皮素；m.齐墩果酸；n.棕榈酸)。
[0030]
图3是六个成分的专属性图谱(从左到右：混合标准液，样品，空白溶剂)(t1.原儿茶酸；t2.槲皮苷；t3.白珠树苷；t4.表儿茶素；t5.滇白珠苷a；t6.绿原酸)。
[0031]
图4是6种含量测定成分的化学式(t1.原儿茶酸；t2.槲皮苷；t3.白珠树苷；t4.表儿茶素；t5.滇白珠苷a；t6.绿原酸)。
[0032]
图5是系统聚类分析树状图。
[0033]
图6是透骨香主成分分析图(a)载荷图(b)得分图。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
[0035]
实施例：
[0036]
仪器与材料：
[0037]
仪器：
[0038]
uhplc/q exactive plus ms高分辨质谱仪器(美国thermo fisher scientific)；acquityuplc h-class超高效液相色谱仪(美国waters公司)；allegra 30r centrifuge低温高速离心机(美国beckman coulter公司)；多管涡旋振荡器(vx-iii，北京踏锦科技有限公司)；el204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；微量移液器(德国eppendorf股份公司)；实验室专用超纯水机(wp-up-iii-20，四川沃特尔科技发展有限公司)；xevo tqms三重四极杆质谱仪(美国沃特世公司，包括自动进样器，二元梯度泵，柱温箱，真空脱气机，masslynx4.1质谱工作站)
[0039]
试药：
[0040]
透骨香的样品是从中国贵州省不同地区收集，由贵州益佰制药股份有限公司提供。绿原酸(110753-201817)、原儿茶酸(111538-201606)和槲皮素(111538-201606)对照品购于中国食品药品检定研究院。表儿茶素对照品(af8030805)购于成都埃法生物科技有限公司。白珠树苷和滇白珠苷a对照品由实验室自制，批号为20190223。所有对照品的纯度均》98％。其他试剂均为分析纯。
[0041]
方法：
[0042]
对照品溶液的制备：
[0043]
精密称取对照品适量，用甲醇稀释至10ml，分别获得绿原酸(1.020g/l)、原儿茶酸(1.035g/l)、表儿茶素(1.018g/l)、槲皮素(0.878g/l)、白珠树苷(1.030g/l)和滇白珠苷a(1.116g/l)的储备液。精密量取上述六种对照品储备溶液并稀释至最终浓度为绿原酸(0.012mg/ml)、原儿茶酸(0.041mg/ml)、表儿茶素(0.101mg/ml)、槲皮素(0.137mg/ml)、白珠树苷(0.077mg/ml)和滇白珠苷a(0.071mgm/l)。精密量取上述六种对照品的终浓度原液
100μl，混合后得到混合对照品溶液，依次用2倍稀释法稀释后，保存在冰箱(-20℃)中备用。
[0044]
供试品溶液的制备：
[0045]
精密称取约0.2g药材，精密加入50％甲醇25ml，称重后回流2h，冷却，加入50％甲醇进行补重，取200μl加入50％甲醇800μl涡混，离心12000rpm，10min，取上清液进样，进样量1μl。
[0046]
高分辨质谱仪器条件：
[0047]
lc系统：vanquish horizon；色谱柱：hypersil gold aq(2.1
×
100mm,1.9μm)；流动相：0.04％乙酸水(a)-0.04％乙酸乙腈(b)；流速：0.35ml/min；进样量：2μl，洗脱梯度如表1所示。在q exactive plus ms系统中，采用电喷雾离子源，于正离子和负离子扫描模式下分别进行检测，条件如下：喷雾电压：3.8kv( )/3.2kv(-)；蒸发温度：350℃；保护气体：40arb；辅助气体：10arb；毛细管温度：320℃；s-透镜：60；通用方法：fullms-ddms2；扫描范围：m/z120-1500；分辨率(ms1)：70,000；ms/ms分辨率：17,500；步进nce：20、40、60。
[0048]
表1色谱洗脱梯度
[0049]
时间(min)a％b％0.09820.598218.529821.529821.629824982
[0050]
uplc-ms/ms仪器条件：
[0051]
uplc-ms/ms系统由配备有电喷雾电离源的acquity i-class uplc系统和xevo tqs-三重四极串联质谱仪组成。使用acquity i-class uplc beh c18色谱柱(2.1mm
×
100mm，内径1.7μm)进行分析。该系统还配备了waters vanguard beh c18(2.1mm
×
5mm，1.7μm)色谱柱。色谱柱和自动进样器分别保持在40℃和25℃，流速为0.3ml/min，进样量为1μl。流动相由0.1％的甲酸水溶液a和0.1％的乙腈甲酸b组成。洗脱梯度如下：0
–
0.5min，10％～10％b；0.5
–
2.5min；10％～40％b；2.5
–
4分钟，40％～90％b；4
–
4.5分钟，90％～90％b；4.5
–
6分钟，90％～10％b。
[0052]
质谱仪参数如下：毛细管电压3.0kv；毛细管电离电压3.0kv；离子源温度为120℃；喷雾气体和反吹气体，n2；脱溶剂气流量，650l/h；和去溶剂化气体温度为350℃。使用多反应监测(mrm)模式进行定量。表2中列出了mrm模式下分析物的最佳参数。所有数据均使用masslynxtm v4.1软件(waters corp.，millford，ma，usa)获得，并使用quanlynatm v4.1(waters corp.，millford，ma，usa)工作站进行处理。
[0053]
表2mrm模式下6个成分的最佳参数
[0054]
成分分子式定量离子对锥孔电压碰撞能量原儿茶酸c7h6o4152.9-1093015槲皮苷c
21h20o11
447.1-300.83015白珠树苷c
19h26o12
491-2933015表儿茶素c
15h14
o6289.1-244.63515
滇白珠苷ac
27h36o12
551-419.13015绿原酸c
16h18
o9353-1913015
[0055]
结果：
[0056]
高分辨液质联用化学成分快速鉴定：
[0057]
使用uhplc/q exactive plus ms液质联用系统对透骨香样本中的主要化学成分进行检测，根据多级质谱信息，并通过compound discoverer 3.1软件(thermo fisher scientific,ma,usa)进行多库匹配自动鉴定化合物，分别确定了正(图1)、负(图2)模式下共18个化学成分。检测获取的质谱信息如表3所示。
[0058]
表3透骨香uhplc/q exactive plus ms正负离子模式下指认成分质谱信息
[0059][0060]
专属性：
[0061]
分别取混合标准液、样品、空白溶剂，根据前文所述uplc-ms/ms仪器条件进样，记录tic色谱图，如图3所示。结果表明该方法具有良好的专属性。
[0062]
线性关系：
[0063]
精密吸取混合对照品溶液，按前文所述uplc-ms/ms仪器条件测定，以峰面积积分值作为纵坐标(y)，对照品质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，得原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a的回归方程及线性范围示于表4，表明其具有良好的线性关系。
[0064]
表4六个成分的标准曲线，lod和loq
[0065][0066]
精密度：
[0067]
取供试品溶液，在前文所述uplc-ms/ms仪器条件下，通过确定一天和连续三天中的六次重复测定中的六种分析物来研究每种分析物的日内和日间精度，峰面积的变化被用作计算rsd的精密度，原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a的rsd值均在可接受的范围内，结果见表5，表明其具有良好的精密度。
[0068]
重复性：
[0069]
取同一批透骨香药材6份，按前文所述方法制备供试品溶液，按前文所述uplc-ms/ms仪器进样分析，结果见表5，原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷和滇白珠苷a的质量分数rsd分别为1.4％、2.1％、1.2％、1.6％、2.3％、2.1％，表明其具有良好的重复性。
[0070]
稳定性：
[0071]
取同一份供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24h测定溶液，记录峰面积，结果见表5，原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷和滇白珠苷a的rsd分别为1.8％、2.6％、2.1％、1.8％、1.7％、2.8％，其结果表明具有良好的稳定性。
[0072]
表5透骨香中6个成分的精密度、稳定性和重复性(n＝6)
[0073]
[0074][0075]
回收率：
[0076]
使用标准品加入法在同一天内测定分析物的回收率，将三种不同浓度的混标溶液(样品中已知量的50％，100％和150％)加到样品中，按“3.4”项下的lc/ms条件分别注入液质联用仪进行测定，通过比较在相同条件下分析的加标样品和未加标样品之间的差异来计算回收率，结果示于表6中。
[0077]
表6透骨香中6个成分的回收率(n＝9)
[0078][0079][0080]
38批透骨香药材中6个成分uplc-esi-ms/ms含量测定：
[0081]
采用uplc-ms/ms对38个不同地区不同批次的透骨香药材的6个成分同时进行含量测定，成分化学式见图4，含量测定结果见表9。
[0082]
表9 38批透骨香6种成分的含量(mg/g,n＝3)
[0083]
[0084][0085]
系统聚类分析(hca)和主成分分析(pca)：
[0086]
为了整体上分析不同部位透骨香药材之间的质量稳定性及各成分含量的变化，本研究利用spss 20软件(ibm corp.,ny,usa)对38批次透骨香药材进行了hca和pca。使用ward法，选择欧几里德距离作为度量，并按变量z值得分进行标准化来执行hca，结果如图5显示，根据这6种化合物的含量变化，将38个样品分为两个主要簇(i和ii)。簇ⅱ包括了绝大多数的地上部分，而簇ⅰ包括了所有的根，说明在根和地上部分中化合物成分有较大差异。pca分析以这6种化合物作为变量，所得的载荷图和得分图见图6(a)和(b)。如图6(a)所示，表儿茶素，白珠树苷，原儿茶酸，它们的分布刚好在三个不同的方向上，且各自与原点的距离都比较相近，说明这三种成分的含量之间没有相关性，可以推测有三种成分可能是引起透骨香质量变化的重要因素。如图6(b)所示，不同地区根部药材主要在成分2(pc2)轴方向上发生纵向偏移，而不同地区地上部分药材主要向第一象限偏移。这些偏移的产生可能是与这些方向上的变量有关，与图6(a)分析结果一致
[0087]
结论与讨论：
[0088]
有研究表明，透骨香根化学成分的乙酸乙酯活性部分具有很强的镇痛、抗炎活性，
从中鉴定出包括槲皮素、绿原酸、原儿茶酸等10个化学成分。滇白珠苷a具有抗关节炎的药理活性，为透骨香药材的有效成分。zhang b等的研究显示白珠树苷(200mg/kg)能够显著抑制醋酸致痛引起的小鼠腹部收缩,抑制巴豆油引起的小鼠耳廓肿胀,与等摩尔剂量的阿司匹林产生的抑制作用类似。绿原酸在角叉菜胶诱导炎症实验和10％甲醛致痛实验中也表现出良好的抗炎和镇痛活性。陈应康等试验研究显示儿茶素25～100μg/ml可显著改善类风湿性关节炎大鼠关节局部肿痛和多发性关节炎，减轻类风湿性关节炎的症状也是透骨香有效成分之一。因此，本实验从鉴定的18个成分中选择了与透骨香药理作用密切相关的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a这6个成分进行质量控制研究。
[0089]
利用载荷图来对图像特征进行描述，可以得知变量属性特征之间的关系，而得分图可以获得样本之间的区分情况。从主成分的计算方法可以看出，载荷的绝对值越大，对于主成份的影响就越大。如图6(a)所示，成分1(pc1)方向上，滇白珠苷a与槲皮苷，绿原酸处在两极，这可能意味着药材中的绿原酸，槲皮苷的含量越高，那么滇白珠苷a的含量会相应的越低，反之亦然，这种相关性明显的变量将根和地上部分的透骨香药材很明显的区分成了两部分。对于表儿茶素，白珠树苷，原儿茶酸，它们各自的含量对于不同部位的透骨香成分含量的贡献是差不多的，总有一种成分会占据含量的主导地位，且与其他两者无关，这种相关性不明显的变量很大程度形成了不同地区同部位药材的质量差异。
[0090]
在本次测定结果中，白珠树苷在地上部分中的含量明显高于在根中的含量且具有显著性差异(地上部分2.127
±
1.275&1.318
±
1.075根，p《0.05)。且在发生偏离批次的地上部分中，该成分含量明显高于其他批次，这些批次主要是来自于毕节地区，由于毕节位于贵州的西部地区，地势比贵阳等中部地区高1000多米，年平均气温较中部地区更低，我们推测气温较低的环境更加有利于白珠树苷在地上部分的累积。原儿茶酸和表儿茶素是根得分发生偏移的主要因素。表儿茶素因素下，都匀地区受到的影响最大，其表儿茶素的含量整体高于其他地区，而都匀位于贵州南部纬度较低，较于其他地区气候更加温暖湿润，因此可以推测气候温暖的条件更适合表儿茶素在根中的累积。原儿茶酸在植物中整体含量偏低，在它的影响下，得分发生偏移的主要是贵阳地区的根。本技术的研究为进一步完善透骨香不同用药部位的质量控制标准及规范用药部位提供了实验依据。
[0091]
由上可知，本发明的方法能快速同时分离透骨香药材中的原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a，且分离效果好。方法的加样回收率为94.93％-105.4％，rsd≤4.12％。该方法简便、快速、准确且重复性好，可用于透骨香药材中原儿茶酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素、白珠树苷、滇白珠苷a的含量测定，为提升透骨香药材的质量控制水平提供实验依据，也为完善透骨香不同用药部位的质量控制标准及规范用药部位提供了实验依据。
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最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。