人参果总皂苷的应用和抗心肌纤维化的药物

1.本发明涉及心血管疾病药物领域，特别是人参果总皂苷的应用和抗心肌纤维化的药物。


背景技术：

2.心肌纤维化是多种心血管疾病(如心肌梗死、高血压、心肌病、瓣膜疾病)发展至后期的共同病理环节，是心室重构持续发展和不可逆的重要原因。心肌纤维化的持续发展会严重影响心脏正常的收缩和舒张功能，最终导致慢性心力衰竭、心肌梗死、恶性心律失常甚至猝死。心肌纤维化与心血管疾病的预后密切相关。
3.目前，肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂是治疗心肌纤维化的主要药物。在一项对34名高血压患者的研究中，心内膜活检显示，接受氯沙坦治疗的患者左心室硬度和纤维化程度均有所降低。另一项活检研究发现赖诺普利与氢氯噻嗪相比降低了心肌胶原体积分数。心脏核磁共振显示，在一组氯沙坦治疗的肥厚性心肌病患者中，晚期钆增强可显著降低，说明raas抑制剂可抑制纤维化。醛固酮受体拮抗剂具有类似的抗心肌纤维化作用。螺内酯可以通过拮抗醛固酮使肥厚性心肌病小鼠模型中胶原含量恢复正常。此外，醛固酮受体拮抗剂对多种与心肌瘢痕相关的疾病如充血性心力衰竭、高血压、冠心病具有良好的临床效果。在80例代谢综合征患者中，螺内酯可降低血清ⅰ型前胶原c末端前肽和ⅰ型前胶原氨基末端前肽的含量，同时改善左心室舒张功能。在临床实践中心衰患者在使用包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂的最佳药物治疗后，5年生存率仍然较低，且仍有明显心肌纤维化存在，说明单纯依靠抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统并不能很好的改善心肌纤维化。
4.因鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种人参果总皂苷的应用和抗心肌纤维化的药物，以解决相关技术中的药物无法很好的改善心肌梗死后心肌纤维化的问题。
6.为解决上述问题，第一方面，本发明实施例提供一种人参果总皂苷在制备抗心肌纤维化药物中的应用，药物以人参果总皂苷为抗心肌纤维化的有效成分。
7.进一步地，所述心肌纤维化包括急性心肌梗死诱导的心肌组织病理损伤。
8.进一步地，所述急性心肌梗死诱导的心肌组织病理损伤包括急性心肌梗死后的心肌胶原纤维沉积。
9.进一步地，所述抗心肌纤维化包括降低心肌α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ的表达。
10.进一步地，所述人参果总皂苷的动物给药量为19.5mg/kg/d～39mg/kg/d。
11.进一步地，所述人参果总皂苷的动物给药量为高剂量39mg/kg/d或低剂量19.5mg/kg/d。
12.人参果总皂苷可以采用振源胶囊中去除胶囊，仅保留其中的粉末，即为人参果总
皂苷。也可以采用如下方法：取人参果浆，离心，离心液备用。离心后的果渣加水提取，提取液过滤，备用。将离心液与提取液经大孔树脂柱吸附，吸附饱和后水洗，再用乙醇溶液洗脱，洗脱液减压回收乙醇，收液，减压干燥，粉碎，即得。
13.第二方面，本发明实施例还提供了抗心肌纤维化的药物，包括有效治疗量的人参果总皂苷和药学上的辅料。辅料包括但不限于粘附剂、润湿剂、分散剂、表面活性剂等，更为具体地，可以包括但不限于如下的常规辅料：淀粉、糊精、预胶化淀粉、微晶纤维素、羟丙基纤维素、壳聚糖、卡波姆、羧甲基纤维素钠、聚维酮、聚乙二醇、交联聚维酮、微粉硅胶、枸橼酸、甘露醇等。配以辅料所制成的剂型包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂等合适的常规剂型。
14.进一步地，所述人参果总皂苷的动物给药量为19.5mg/kg/d～39mg/kg/d。
15.进一步地，所述人参果总皂苷的动物给药量为高剂量39mg/kg/d或低剂量19.5mg/kg/d。
16.与现有技术相比，本发明采用人参果总皂苷可制备出安全有效的治疗药物，能够抑制心肌梗死后心肌纤维化的病理过程。
附图说明
17.图1a为急性心肌梗死术后2周各组小鼠代表性心超检测平面图；
18.图1b为急性心肌梗死术后4周各组小鼠代表性心超检测平面图；
19.图2为各组小鼠血清ck-mb、alt和s-cr表达水平结果图；
20.图3为各组心肌组织he染色结果图(
×
400倍)；
21.图4为各组心肌组织masson染色结果图(
×
200倍)；
22.图5为各组小鼠心肌cvf测量结果图；
23.图6为心肌α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ的表达情况结果图。
具体实施方式
24.下面将参考附图中示出的若干示例性实施方式来描述本发明的原理和精神。应当理解，描述这些实施方式仅仅是为了使本领域技术人员能够更好地理解进而实现本发明，而并非以任何方式限制本发明的范围。
25.心肌纤维化是指多种原因所致的心肌正常组织结构中胶原纤维的过度沉积，其胶原浓度和胶原容积分数显著增加，各型胶原比例失调，导致心肌结构紊乱，僵硬度增加，心室舒张功能障碍。它是多种心血管及相关疾病发展到一定阶段的共同病理性改变。心肌梗死时会造成数十亿心肌细胞在短时间内大量坏死。由于人类的心肌细胞几乎不能再生，大量心肌细胞的死亡会导致修复性纤维化，以维持梗死心室结构的完整性，防止心脏破裂，但过度的心肌纤维化会导致不良心血管事件。
26.此外，心肌纤维化还是大多数心血管疾病发展至一定阶段的共同病理性改变，常伴有心脏收缩和舒张功能障碍，心律失常和心血管不良事件。心肌纤维化可从多个方面影响心脏功能，如血管周围纤维化可影响冠脉供血，导致心肌组织缺血缺氧，甚至坏死；胶原纤维的大量沉积，导致室壁硬度明显增加，顺应性降低，使心肌舒缩和同步性下降，导致心功能减退；胶原纤维在间质的大量沉积，可影响心肌电信号的传导，易形成折返环及传导阻
滞等，导致心律失常。心肌纤维化最终可诱发难治性心力衰竭、心肌梗死、心律失常甚至猝死。
27.许多心脏病，如高血压性心肌肥厚、冠心病心肌梗死后的心肌重塑、糖尿病性心脏病、限制型心肌病、扩张型心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病等均存在不同程度的心肌纤维化。根据有无心肌细胞坏死和瘢痕形成，心肌纤维化可分为反应性纤维化和修复性纤维化。反应性纤维化发生于血管周围或心肌间质，是心肌对负荷过重的反应，常见于高血压、肥厚性心肌病、主动脉瓣膜狭窄和高血糖等；修复性纤维化是对心肌细胞坏死后的反应，常见于心肌梗死、心肌炎等。
28.如前所述，由于心肌间质纤维化发生机理十分复杂，目前尚未发现针对性的治疗药物。当前西药的研究主要集中在血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、内皮素受体拮抗剂、醛固酮受体拮抗剂、抗氧化剂、钙拮抗剂、β受体阻滞剂等。这些药物中，仅血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂的研究有力证据较多，但仍不能完全抑制心肌间质纤维化的发生。内皮素受体拮抗剂、抗氧化剂尚处于试验阶段，而钙拮抗剂、醛固酮受体拮抗剂、β受体阻滞剂是否具有抗纤维化作用仍存在争议。
29.基于此，本发明实施例提供一种抗心肌纤维化的药物，有效成分为人参果总皂苷，在下文的实施例中，人参果总皂苷的来源为振源胶囊(批号：国药准字z22026091)，其中去除胶囊仅保留其中的粉末即为人参果总皂苷，收集到容器中后，按照下文中的具体给药量称重即得到的以人参果总皂苷为有效成分的药物。
30.动物实验方法和数据
31.1实验方法
32.建立c57bl/6小鼠急性心肌梗死模型，给予人参果总皂苷连续灌胃4周，心脏超声检测小鼠心脏功能后取材，进行组织病理学检测，采用elisa法检测小鼠血清学指标，通过western blot和qrcr技术检测小鼠心脏相关蛋白和基因的表达。
33.1.1小鼠急性心肌梗死模型制备
34.根据课题组前期造模方法，采用结扎左冠状动脉前降支的技术制备小鼠急性心肌梗死模型诱导心肌纤维化的发生，具体步骤如下：
35.(1)麻醉、消毒：用脱毛膏对小鼠的颈胸部进行脱毛，异氟烷持续通气麻醉，小鼠仰卧位固定于手术操作台上，用75％酒精进行颈胸部消毒。
36.(2)开胸：于左侧第3-4肋间心尖搏动最强处剪开皮肤，长度1-2cm，逐层钝性分离皮下组织、胸壁肌肉，暴露肋骨。用止血钳轻轻撑开肋间隙，破开胸膜，充分暴露心脏，轻轻挤压右胸，顺着心尖方向快速挤出心脏。
37.(3)结扎：平行于左心耳的前下角，于左冠状动脉前降支上1/3投影处，用8-0带线缝合针结扎前降支，进针深度控制在1-2mm，宽度在1.5mm左右。
38.(4)复位、缝合：迅速将心脏复位，排出胸腔内空气，逐层关胸，用6-0带线缝合针缝合皮肤。将小鼠置于30℃的环境中复苏。
39.假手术组除穿针后不结扎前降支外，其余操作与模型组相同。
40.1.2动物分组与给药
41.将造模成功的急性心肌梗死小鼠随机分为3组：模型组(m)、人参果总皂苷低剂量组(l)，人参果总皂苷高剂量组(h)，每组10只。假手术组(s)10只。术后第二天开始灌胃给
药，低剂量组给以19.5mg/kg/d人参果总皂苷灌胃，高剂量组给以39mg/kg/d人参果总皂苷灌胃(人参果总皂苷为振源胶囊中的粉末)，假手术组和模型组给以相同体积的生理盐水灌胃。连续灌胃4周，每周测量体重。4周后，用异氟烷麻醉小鼠后于眼眶静脉丛采血，pbs灌注后取出心脏，剥离结缔组织。部分固定于4％多聚甲醛中，其余暂时保存于液氮中，后转至-80℃保存，用于蛋白和基因的检测。
42.1.3超声心动图检测
43.采用vevo 2100高分辨率成像系统分别于ami后2周和4周对小鼠进行心脏超声检测，按照公式计算左室射血分数(left ventricular ejection fraction，lvef)和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，lvfs)。lvef＝(左心室舒张末容积-左心室收缩末容积)/左心室舒张末容积
×
100％，lvfs＝(左心室舒张末期内径-左心室收缩末期内径)/左心室舒张末期内径
×
100％。评估心脏功能。
44.1.4血清学检测
45.用异氟烷将小鼠麻醉后，眼眶静脉丛取血，室温下血液静置20min。4℃条件下以3000转/分的转速离心，分离血清后，-80℃保存待测。采用elisa法检测血清肌酸激酶mb亚型(creatine kinase-mb，ck-mb)观察心肌缺血情况；血清肌酐(serum creatinine，s-cr)、血清谷丙转氨酶(alanine transaminase，alt)观察肝肾功能情况。
46.1.5组织病理学检测
47.通过苏木素-伊红染色(he)观察缺血心肌组织排列和炎症细胞的浸润情况；马松染色(masson)观察缺血心肌纤维胶原蛋白沉积情况。
48.1.6蛋白质印迹法(western blot)检测
49.通过western blot检测缺血心肌中心肌纤维化相关蛋白：胶原蛋白ⅰ(collagenⅰ)、胶原蛋白ⅲ(collagenⅲ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-sma)的表达情况。
50.2实验数据
51.2.1人参果总皂苷改善急性心肌梗死后心脏功能
52.小鼠急性心肌梗死术后第2周和第4周分别进行心脏超声检测。两次检测结果均发现，与sham组比较，model组lvef和lvfs显著降低(p＜0.01)，说明急性心肌梗死模型造模成功。与model组比较，给予人参果总皂苷低、高剂量治疗后，lvef和lvfs显著升高(p＜0.01)，但低高浓度人参皂苷re之间无统计学差异(p＞0.05)(表1a-1b和图1a-1b)，说明人参果总皂苷能够显著改善急性心肌梗死诱导的心功能障碍。
53.表1a各组小鼠amia术后2周心脏超声检测结果(n＝8)
[0054][0055]
注：与sham组比较，
*
p＜0.01；与model组比较，
#
p＜0.01。
[0056]
(表1a中model组用m表示，sham组用s表示，低剂量组用l表示，高剂量组用h表示，下同。)
[0057]
表1b各组小鼠急性心肌梗死术后4周心脏超声检测结果(n＝8)
[0058][0059]
注：与sham组比较，
*
p＜0.01；与model组比较，
#
p＜0.01。
[0060]
2.2人参果总皂苷减轻急性心肌梗死后心肌损伤，且未发现肝肾毒副作用
[0061]
各组小鼠血清心肌损伤标记物ck-mb，以及肝肾功能标记物alt和s-cr的检测结果如表2和图2。与sham组比较，model组血清ck-mb水平明显升高(p＜0.01)，说明急性心肌梗死术后4周，仍存在着心肌损伤。给予低、高浓度人参果总皂苷干预后，ck-mb水平明显降低(p＜0.05)，且低、高浓度人参皂苷re之间无显著差异(p＞0.05)，说明人参果总皂苷可以减轻缺血引起的心肌损伤。血清alt的含量在各组之间无统计学差异(p＞0.05)，说明人参果总皂苷在39mg/kg/d的剂量下无肝脏毒性。与sham组相比，model组血清s-cr水平明显升高(p＜0.05)，说明心肌梗死引起了肾功能损伤，而低、高剂量人参果总皂苷组与model组相比无统计学差异(p＞0.05)，说明人参果总皂苷在39mg/kg/d的剂量下无肾脏毒性。
[0062]
表2各组小鼠ck-mb、alt和s-cr表达水平(
±
s，n＝6)
[0063][0064]
注：与sham组比较，*p＜0.01；与sham组比较，
§
p＜0.05；与model组比较，
#
p＜0.01；与model组比较，
&
p＜0.05。
[0065]
2.3人参果总皂苷改善心肌梗死后心脏组织病理学改变
[0066]
采用he染色评估急性心肌梗死后心肌组织病理改变，结果如图3。sham组心肌组织结构正常，肌纤维走向规则，纹理清晰，胞浆丰满，肌丝间隙均匀一致。model组心肌结构紊乱，肌丝较粗，呈波形改变，纹理不清，大量炎症细胞浸润。低、高剂量人参果总皂苷组心肌组织病理学改变明显好转。
[0067]
采用masson染色评估急性心肌梗死后心肌纤维化程度，结果如图4。masson染色后，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。model组心肌组织中存在大量胶原纤维沉积，给予人参果总皂苷干预后，胶原沉积明显减少。通过image j软件测量胶原容积分数(collagen volume fraction，cvf)，结果发现与sham组相比，model组cvf明显升高(p＜0.01)，人参皂苷re干预组cvf较model组明显减轻(p＜0.05)(图5)，说明人参果总皂苷能够改善急性心肌梗死诱导的心肌组织病理损伤。
[0068]
2.4人参果总皂苷抑制急性心肌梗死后纤维化相关蛋白的表达
[0069]
心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，cfs)是心肌纤维化的主要效应细胞，在病理条件刺激下(如缺血、压力超载、炎症)，cfs被激活转分化为具有分泌和收缩功能的肌成纤维细胞。活化的肌成纤维细胞能够分泌大量细胞外基质蛋白，并且可以通过产生蛋白
酶及其抑制剂来调控基质重构。α-sma是cfs分化为肌成纤维细的特异性蛋白。心肌纤维化主要是由于collagenⅰ和collagenⅲ在间质的弥漫性堆积引起的，因此，通过测量它们的含量可以推测心肌纤维化的程度。本研究采用western blot法检测心肌α-sma、collagenⅰ和collagenⅲ的表达情况，结果如图6。与sham组相比，model组α-sma表达明显升高(p＜0.01)，说明心肌缺血激活了肌成纤维细胞；低、高剂量人参果总皂苷干预后，α-sma表达显著降低(p＜0.01)，两组人参果总皂苷之间无统计学差异(p＞0.05)，说明人参果总皂苷能够抑制缺血诱导的肌成纤维细胞活化。同样，急性心肌梗死导致心肌组织中collagenⅰ和collagenⅲ过度表达，而人参果总皂苷能够明显抑制这种趋势，且两组人参果总皂苷之间无统计学差异(p＞0.05)。
[0070]
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。