一种适于丹参组织培养的丹参种子消毒方法

1.本发明涉及丹参种子组织培养技术领域，更具体地说是涉及一种适于丹参组织培养的丹参种子消毒方法。


背景技术：

2.丹参(salvia miltiorrhiza)又名紫丹参、血参、大红袍等，为唇形科(labiatae)鼠尾草属植物，其有效成分为丹参酮、隐丹参酮、鼠尾草酚、丹参新酮等。丹参收录于2020年版《中国药典》，以干燥根和根茎入药，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈等功效，用于治疗胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛等症。
3.近代医学临床证明，丹参有扩张血管与增进冠状动脉血流量的作用，对冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心动过速等症有显著的疗效；还可用于慢性肝炎、早期肝硬变等症的治疗。丹参为医药工业的重要原料，需要量大，因此丹参的种植和栽培受到人们的重视。生产上丹参主要采用种子繁殖，但丹参花期较长，种子成熟度不一致，导致自然萌芽率低，一般仅为30％-40％，且出苗不整齐；种子不耐储藏，常温下种子寿命仅为7个月，低温储藏需严格控制种子含水量以避免种子失活。通过种子进行组织培养，可以提高种子发育成苗过程中的增殖倍数，此外，不同时间采收的种子可以通过调整其不同生长阶段的培养时间，最终获得统一规格的组培苗。
4.现有的报道中，丹参主要通过幼茎、幼叶、花蕾、腋芽、叶柄、根等为外植体进行组织培养。丹参种子不易作为外植体进行组培，主要是与其快速吸水的特性有关。丹参种子表面有黏液细胞层，吸水后黏液细胞破裂会释放出胶状物。胶状物具有保持水分的特性，有益于种子保持含水量，但同时也易于吸附到细菌、真菌、细菌芽孢和真菌孢子等污染源，因此只有尽量去除黏液层及其产生的胶状物并采取合适的消毒措施，才能为后续组织培养提供无菌的种子材料。
5.因此，如何提供一种适于丹参组织培养的丹参种子消毒方法是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种适于丹参组织培养的丹参种子消毒方法，摒弃传统的消毒方法，以次氯酸钠和吐温20联合，提高了种子的萌发率，降低了污染率。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种适于丹参组织培养的丹参种子消毒方法，过程包括：
9.1)取大小一致、颗粒饱满的丹参种子装在纱网袋中，于自来水中浸泡24h；
10.2)将装有丹参种子的纱网袋取出，用手揉搓20min，用自来水冲洗10min，再放入自来水中浸泡1h；
11.3)重复步骤2)2次；
12.4)将丹参种子取出，吸干水分；
13.5)将步骤4)处理的丹参种子在乙醇中浸泡45-60s；
14.6)将乙醇倒掉，用灭菌蒸馏水清洗，然后以吐温20和质量分数为8％的次氯酸钠溶液消毒10-12min，最后用灭菌蒸馏水清洗4-5次。
15.作为上述技术方案优选的技术方案，步骤5)中，将步骤4)处理的丹参种子放入容积50ml的离心管中，丹参种子体积不超过离心管容积的1/3，然后加入体积分数为75％的乙醇。
16.作为上述技术方案优选的技术方案，步骤5)中，浸泡时间为45s。
17.作为上述技术方案优选的技术方案，步骤6)中，消毒时间为10min
18.本发明所述方法与现有的丹参种子组织培养中丹参种子消毒方法采用的氯化汞相比，具有提高种子萌发率和不延长种子发芽时间等优点。
具体实施方式
19.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1
21.1)挑选大小一致、颗粒饱满的丹参种子备用。
22.2)取步骤1)挑选的丹参种子装在纱网袋中，于自来水中浸泡24h。
23.3)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，用手揉搓20min，然后用自来水冲洗10min，放入自来水中浸泡1h。
24.4)重复步骤3)2次。
25.5)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，把丹参种子置于滤纸上，通过滤纸吸收丹参种子表面水分。
26.6)在超净工作台上，将步骤5)处理的丹参种子放入容积50ml的离心管中，丹参种子体积不超过离心管容积的1/3，加入体积分数为75％的乙醇浸泡30秒钟。
27.7)将乙醇倒掉，用灭菌蒸馏水清洗，然后加入1滴吐温20和质量分数为8％次氯酸钠溶液进行消毒处理。8％次氯酸钠溶液消毒时间为8min。最后用灭菌蒸馏水清洗3次。
28.实施例2
29.1)挑选大小一致、颗粒饱满的丹参种子备用。
30.2)取步骤1)挑选的丹参种子装在纱网袋中，于自来水中浸泡24h。
31.3)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，用手揉搓20min，然后用自来水冲洗10min，放入自来水中浸泡1h。
32.4)重复步骤3)2次。
33.5)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，把丹参种子置于滤纸上，通过滤纸吸收丹参种子表面水分。
34.6)在超净工作台上，将步骤5)处理的丹参种子放入容积50ml的离心管中，丹参种子体积不超过离心管容积的1/3，加入体积分数为75％的乙醇浸泡45秒钟。
35.7)将乙醇倒掉，用灭菌蒸馏水清洗，然后加入1滴吐温20和质量分数为8％次氯酸钠溶液进行消毒处理。8％次氯酸钠溶液消毒时间为10min。最后用灭菌蒸馏水清洗4次。
36.实施例3
37.1)挑选大小一致、颗粒饱满的丹参种子备用。
38.2)取步骤1)挑选的丹参种子装在纱网袋中，于自来水中浸泡24h。
39.3)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，用手揉搓20min，然后用自来水冲洗10min，放入自来水中浸泡1h。
40.4)重复步骤3)2次。
41.5)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，把丹参种子置于滤纸上，通过滤纸吸收丹参种子表面水分。
42.6)在超净工作台上，将步骤5)处理的丹参种子放入容积50ml的离心管中，丹参种子体积不超过离心管容积的1/3，加入体积分数为75％的乙醇浸泡1min。
43.7)将乙醇倒掉，用灭菌蒸馏水清洗，然后加入1滴吐温20和质量分数为8％次氯酸钠溶液进行消毒处理。8％次氯酸钠溶液消毒时间为12min。最后用灭菌蒸馏水清洗5次。
44.实施例4
45.1)挑选大小一致、颗粒饱满的丹参种子备用。
46.2)取步骤1)挑选的丹参种子装在纱网袋中，于自来水中浸泡24h。
47.3)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，用手揉搓20min，然后用自来水冲洗10min，放入自来水中浸泡1h。
48.4)重复步骤3)2次。
49.5)将装有丹参种子的纱网袋从自来水中取出，把丹参种子置于滤纸上，通过滤纸吸收丹参种子表面水分。
50.6)在超净工作台上，将步骤5)处理的丹参种子放入容积50ml的离心管中，丹参种子体积不超过离心管容积的1/3，加入体积分数为75％的乙醇浸泡45秒钟。
51.7)将乙醇倒掉，用灭菌蒸馏水清洗，然后加入1滴吐温20和质量分数为0.1％氯化汞溶液进行消毒处理。0.1％氯化汞溶液消毒时间为10min。最后用灭菌蒸馏水清洗5次。
52.发芽试验：选用的丹参品种为紫花丹参，该丹参种子购买于安徽省亳州市中药材批发市场，分别按照实施例1-4的方法进行处理，每个实施例设置3个重复，每个重复在ms培养基上(具体成分参见表2)接入60粒种子；统计种子发芽数据和污染数据，结果见表1。
53.表1各组丹参种子萌发率、发芽时间和污染率
[0054][0055]
从上表统计可知，对于发芽数量和发芽时间，实施例1，2，3之间没有显著性差异，它们与实施例4存在显著性差异；对于污染数量，实施例2，3，4之间没有显著性差异，它们与实施例1存在显著性差异。结果说明，就实施例1，2，3而言，用质量分数8％次氯酸钠消毒8-12min，实施例1-3对丹参种子发芽数量的影响没有明显区别；消毒时间在10-12min范围，实施例2和实施例3相比于实施例1能把污染率降低至10％左右。就实施例2和实施例4而言，用质量浓度0.1％氯化汞替代质量分数8％次氯酸钠进行消毒，虽然实施例4污染率降低，但是相较于实施例2发芽数量明显下降，同时发芽时间明显变长。
[0056]
处理丹参种子的关键环节之一是各实施例中的步骤2)、3)、4)。去除种子黏液层及其形成的胶状物是影响污染率的关键因素。如果黏液层及其形成的胶状物明显残留，后续实施例1，2，3，4都不能达到降低污染率的效果。
[0057]
用0.1％氯化汞进行消毒，其灭菌效果要好于8％次氯酸钠 吐温20，但是容易导致灭菌材料死亡，推测原因为氯化汞毒性和残留高于次氯酸钠，吐温20仅作为表面活性剂，促
进试剂与材料表面接触。使用8％次氯酸钠 吐温20 的方式相对于使用0.1％氯化汞对种子萌发的负面影响较小。
[0058]
根据文献报道，丹参种子的自然萌芽率一般仅为30％-40％。本次实施例中采用的丹参种子，在滤纸上萌发时萌发率高达90％。因此，出于组织培养的目的，各实施步骤主要目标为降低污染率，同时减少灭菌试剂对种子萌发的影响，最终获得无菌材料。
[0059]
本发明各实施例中所使用ms培养基(1l)配方见表2；
[0060]
表2使用ms培养基成分
[0061]
[0062][0063]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0064]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。