一种安吉白茶组织培养快速繁殖的方法

1.本发明属于植物组织培养技术领域，特别涉及一种安吉白茶组织培养快速繁殖的方法。


背景技术：

2.安吉白茶是一种罕见白化茶树品种，叶狭长椭圆,叶片中茶多酚含量低，氨基酸含量高，是普通茶树品种的2倍左右。以安吉白茶芽叶为原料制成的白茶，形态美观，香气优雅，滋味甘醇鲜爽，汤色清澈明亮，叶底色白如玉。
3.褐化现象是组织培养过程中常见的问题之一,酚类物质是造成外植体发生褐变的重要底物，如何有效降低外植体褐化率是目前一个技术难题。
4.安吉白茶为茶树优良品种，常用扦插繁育的方式进行繁殖，但该繁殖方法易受自然条件限制，多年连续无性繁殖和病虫危害会产生良种种性退化问题，影响产量和品质。组织培养技术可以加快优良品种的繁育，并且能够保持良种种性，促进种苗复壮、提高产量和品质。如何建立高效的再生技术体系，实现良种快速繁育，是目前急需解决的一个问题。


技术实现要素：

5.为加快安吉白茶良种繁育，本发明提供了一种安吉白茶的组织培养方法。
6.本发明提供了一种安吉白茶组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：
7.(1)外植体选择，选用当年生枝芽饱满的半木质化新梢作为外植体。
8.(2)外植体消毒，去除外植体叶片，流水清洗后，剪成短茎段，然后用消毒液浸泡，最后在无菌水中漂洗，获得消毒的外植体。
9.(3)抑制外植体褐化，将步骤(2)获得的消毒外植体接种到含抑制外植体褐化的抗氧化剂pvp或ac的基础培养基上。
10.(4)初代诱导培养，将消毒的外植体接种到初代诱导培养基中，诱导外植体腋芽萌发。
11.(5)继代增殖培养，将萌发的外植体转接到增殖培养基中，诱导多丛芽生长。
12.(6)生根培养，将多丛芽切成单芽，接种至生根培养基，诱导出白色根，获得无菌种苗。
13.优选的，步骤(2)所述的茎段含至少1个饱满腋芽，采用酒精和次氯酸钠消毒。
14.优选的，步骤(2)所述的消毒的方法具体指用清水清洗茎段，然后用70％酒精处理，用2％次氯酸钠处理，最后用无菌水清洗。
15.更优选的，步骤(2)所述消毒的方法具体为：将外植体在流水下小心冲洗1-2h，然后在超净台中剪成2-3cm茎段，用无菌水清洗3次；接着用70％酒精处理60s，用无菌水清洗3-4次；再用2％次氯酸钠溶液处理25min，最后用无菌水清洗3-4次。
16.优选的，步骤(3)所述的抑制外植体褐化的抗氧化剂pvp的浓度为1.5g l-1
、2.0g l-1
或2.5g l-1
，活性炭ac的浓度为0.5g l-1
、1.0g l-1
或1.5g l-1
。
17.更优选的，步骤(3)所述的抑制外植体褐化的最适抗氧化剂是浓度为2.0g l-1
的pvp。优选的，步骤(3)所述的基础培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph值为5.8。
18.优选的，步骤(4)所述的初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph值为5.8，用于诱导腋芽萌发。
19.优选的，步骤(5)所述的继代增殖培养基为ms iba0.1mg
·
l-1
6-ba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0
20.g
·
l-1
蔗糖30
·
g l-1
琼脂8
·
g l-1
，ph值为5.8，用于增殖培养。
21.优选的，步骤(6)所述的生根培养基为1/2ms iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蛭石，用于多丛芽生根。
22.优选的，步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)所述的培养条件均为每天光照培养16h，光照强度90μmol
·
m-2
·
s-1
条件下，温度为28℃；黑暗培养8h，温度为23℃。
23.本发明提供了一种安吉白茶组织培养快繁的方法，包括抑制外植体褐化的抗氧化剂筛选，初代诱导培养，继代增殖培养和生根培养。该快繁技术能够快速高效的繁殖安吉白茶植株，在短时间内为生产提供大量优质幼苗，为规模化生产安吉白茶提供种源。因此实用性强、应用前景大。
附图说明
24.图1为安吉白茶腋芽分化。
25.图2为安吉白茶多丛芽增殖。
26.图3为安吉白茶生根。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
28.实施例1
29.(1)外植体预处理
30.选择安吉白茶新萌发无病虫害带腋芽茎段，将采集的茶树带腋芽茎段剪去叶片，保留在叶柄部位，0.5％洗洁精溶液浸泡50min，用流动水冲洗30min。
31.(2)外植体消毒
32.茎段消毒：将预处理的外植体移至超净工作台，用70％酒精消毒1min，无菌水清洗3-4次后，用2％次氯酸钠消毒25min，无菌水清洗5-6次。将消毒后的外植体放入带有滤纸的培养皿内(均灭菌)，吸干表面水分，剪成1.5cm长的茎段，上部平切，下部斜切，上短(1/3)下长(2/3)，插入培养基中。
33.(3)抑制外植体褐化
34.将消毒后的茎段接种于含抑制外植体褐化的抗氧化剂pvp或ac的基础培养基上，20天后统计褐化率，筛选出抑制外植体褐化最适的抗氧化剂为2.0g
·
l-1
的pvp。所述基础培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1 iba 1.5mg
·
l-1 蔗糖30g
·
l-1 琼脂8g
·
l-1，ph为5.8。
35.(4)初代诱导培养
36.将消毒后的茎段接种到初代组织诱导培养基中进行培养，初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养40天。腋芽分化见图1a。
37.(5)继代增殖培养
38.选取的初代培养生长一致的芽，进行继代增殖培养，培养基为ms iba 0.1mg
·
l-1
6-ba1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养30天形成小苗(无根)，见图2a。
39.(6)生根培养
40.将步骤(5)得到的无根小苗转接入生根培养基中培养成健壮小苗，生根培养基为1/2ms iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蛭石，40天后得到完整的植株，见图3a。
41.步骤(3)、(4)、(5)和(6)中培养条件均为每天光照培养16h，光照强度90μmol
·
m-2
·
s-1
条件下，温度为28℃；黑暗培养8h，温度为23℃。
42.实施例2
43.(1)外植体的预处理
44.选择安吉白茶新萌发无病虫害带腋芽茎段，将采集的茶树带腋芽茎段剪去2/3叶片，保留在叶柄部位1/3叶片，在0.5％多菌灵溶液中浸泡30min，冲洗干净后，用流动水冲洗1h。
45.(2)外植体的消毒
46.茎段消毒：将预处理的外植体移至超净工作台，用70％酒精消毒1min，无菌水清洗3-4次后，用4％次氯酸钠消毒15min，期间不断搅拌，用无菌水清洗5-6次。将洗净后的外植体放在带有滤纸的培养皿内(均灭菌)，吸干表面水分，剪成1.5cm长的茎段，上部平切，下部斜切，上短(1/3)下长(2/3)，插入带培养基的组培瓶中。
47.(3)抑制外植体褐化
48.将消毒后的茎段接种于含抑制外植体褐化的抗氧化剂pvp或ac的基础培养基上，20天后统计褐化率，筛选出抑制外植体褐化最适的抗氧化剂为2.0g
·
l-1
的pvp。基础培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8。
49.(4)初代诱导培养
50.将消毒后的茎段接种到初代组织诱导培养基中进行培养，初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养40天
51.(5)继代增殖培养
52.选取初代培养生长一致的芽，进行继代增殖培养，培养基为ms iba 0.1mg
·
l-1
6-ba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养30天后形成小苗。
53.(6)生根培养
54.将步骤(5)得到的小苗转接入生根培养基中培养成健壮小苗，生根培养基为1/2ms iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蛭石。40天后得到完整的植株。
55.步骤(3)、(4)、(5)和(6)的培养条件均为每天光照培养16h，光照强度90μmol
·
m-2
·
s-1
条件下，温度为28℃；黑暗培养8h，温度为23℃。
56.实施例3
57.(1)外植体的预处理
58.选择安吉白茶新萌发无病虫害带腋芽茎段，将采集的茶树带腋芽茎段剪去叶片，保留在叶柄部位，在0.5％洗洁精溶液中浸泡50min，冲洗干净后，用流动水冲洗1h。
59.(2)外植体的消毒
60.茎段消毒：将预处理的外植体移至超净工作台，用70％酒精消毒1min，无菌水清洗3-4次后，用4％次氯酸钠消毒15min，期间不断搅拌，用无菌水清洗5-6次。将洗净后的外植体放在带有滤纸的培养皿内(均灭菌)，将消毒后的外植体放入带有滤纸的培养皿内(均灭菌)，吸干表面水分，剪成1.5cm长的茎段，上部平切，下部斜切，上短(1/3)下长(2/3)，插入培养基中。
61.(3)抑制外植体褐化
62.将消毒后的茎段接种于含抑制外植体褐化的抗氧化剂pvp或ac的基础培养基上，20天后统计褐化率，筛选出抑制外植体褐化最适的抗氧化剂为2.0g
·
l-1
的pvp。基础培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8。
63.(4)初代诱导培养
64.将消毒后的茎段接种到初代组织诱导培养基中进行培养，初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养40天。
65.(5)继代增殖培养
66.选取初代培养生长一致的芽，进行继代增殖培养，培养基为ms iba 0.1mg
·
l-1
6-ba 1.5mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
，ph为5.8，培养30天后形成小苗。
67.(6)生根培养
68.将步骤(4)得到的小苗转接入生根培养基中培养成健壮小苗，生根培养基为1/2ms iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。40天后得到完整的植株(见图3b)。
69.步骤(3)、(4)、(5)和(6)的培养条件均为每天光照培养16h，光照强度90μmol
·
m-2
·
s-1
条件下，温度为28℃；黑暗培养8h，温度为23℃。
70.对比例1
71.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)培养基不添加抗氧剂。
72.对比例2
73.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)抗氧化剂pvp浓度为1.5mg
·
l-1
。
74.对比例3
75.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)抗氧化剂pvp浓度为2.5mg
·
l-1
。
76.对比例4
77.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)抗氧化ac浓度为0.5g
·
l-1
。
78.对比例5
79.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)抗氧化剂ac浓度为1.0g
·
l-1
。
80.对比例6
81.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(3)抗氧化剂ac浓度为1.5g
·
l-1
。
82.观察和统计实施例1和对比例1-6外植体褐化情况，并统计褐化率，结果如表1所示，不同浓度pvp和ac均能不同程度的降低褐化率，其中pvp在2.0g
·
l-1
的浓度下褐化率最低为20％，ac在1.0g
·
l-1
的浓度下褐化率最低为27.27％。选择2.0g
·
l-1
的pvp加入后续培养基中抑制外植体褐化。
83.表1不同种类和浓度的抗氧化剂对外植体褐化的影响
84.编号浓度(g
·
l-1
)褐化率实施例12.020.33
±
1.53e对比例1053.62
±
1.14a对比例21.549.67
±
2.52ab对比例32.539.67
±
1.53c对比例40.527.58
±
3.19d对比例51.045.76
±
2.29b对比例61.536.97
±
1.89c
85.对比例7
86.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 0.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1b。
87.对比例8
88.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 2.0mg
·
l-1
iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1c。
89.对比例9
90.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 0.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1d。
91.对比例10
92.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1e。
93.对比例11
94.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 4.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1f。
95.对比例12
96.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 6.0mg
·
l-1
iba 0.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1g。
97.对比例13
98.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 6.0mg
·
l-1
iba 1.0mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1h。
99.对比例14
100.一种与实施例1相似的组培方法，区别在于，步骤(4)初代诱导培养基为ms 6-ba 6.0mg
·
l-1
iba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。腋芽分化见图1i。观察和统计实施例1和对比例7-14诱导外植体腋芽分化的情况，并统计诱导率和增值倍数，结果如表2所示，不同浓度的6-ba和iba，对安吉白茶的诱导率和增殖倍数有显著影响，安吉
白茶在6-ba浓度为2.0mg
·
l-1
，iba浓度为1.5mg
·
l-1
的培养基中诱导率和增殖倍数最高，分别为67.56％、1.67。在设置的浓度范围内，6-ba和iba能够诱导腋芽分化，但不能促进节间伸长。
101.表2激素诱导安吉白茶腋芽分化
102.编号诱导率(％)增殖倍数生长情况实施例167.56
±
0.68a1.67
±
0.02a芽萌发，叶展开，叶椭圆形对比例733.97
±
0.67c0.62
±
0.01f芽均只萌发，叶不展开对比例856.46
±
1.07ab1.26
±
0.02c大多芽只萌发，少数芽展开对比例951.54
±
0.51b1.07
±
0.06d芽萌发，叶展开，芽叶细长对比例1024.75
±
0.69c0.31
±
0.01g大多芽只萌发，少数叶展开对比例1127.88
±
0.3c0.61
±
0.01f大多芽只萌发，少数叶展开对比例1230.99
±
0.07c0.49
±
0.01g芽萌发，叶展开，芽叶细长对比例1333.48
±
0.61c0.81
±
0.01e芽均只萌发，叶不展开对比例1455.87
±
19.4ab1.5
±
0.02b大多芽只萌发，少数叶展开
103.对比例15
104.一种与实施例2相似的组培方法，区别在于，步骤(5)继代增殖培养基为ms iaa 0.1mg
·
l-1
6-ba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。多丛芽增殖见图2b。
105.对比例16
106.一种与实施例2相似的组培方法，区别在于，步骤(5)继代增殖培养基为ms naa 0.1mg
·
l-1
6-ba 1.5mg
·
l-1
pvp 2.0g
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。多丛芽增殖见图2c。
107.观察和统计实施例2和对比例15-16诱导多丛芽增殖的情况，并统计诱导率和增值倍数，结果如表3所示，不同生长素诱导安吉白茶多丛芽增殖的效果不同，iba诱导的芽叶较大，茎较粗壮，iaa诱导的芽叶较小，茎较细，naa诱导的芽壮、叶大、茎粗壮。iba对安吉白茶的诱导和增殖效果优于iaa和naa，其诱导率和增殖倍数分别为92.5％和7.89。
108.表3不同种类的生长素诱导安吉白茶多丛芽增殖
109.编号诱导率(％)增殖倍数生长情况实施例292.50
±
0.50a7.89
±
0.02a芽叶较大，茎较粗，高3-5cm对比例1562.95
±
0.06c4.71
±
0.02b芽叶较小，茎较细，高3-4cm对比例1673.36
±
0.03b3.22
±
0.01c芽壮、叶大，茎粗壮，高3-4cm
110.对比例17
111.一种与实施例3相似的组培方法，区别在于，步骤(6)生根培养基为1/2ms iaa 1.0mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。多丛芽生根见图3c。
112.对比例18
113.一种与实施例3相似的组培方法，区别在于，步骤(6)生根培养基为1/2ms naa 1.0mg
·
l-1
蔗糖30g
·
l-1
琼脂8g
·
l-1
。多丛芽生根见图3d。
114.观察和统计实施例1和3与对比例17-18诱导多丛芽生根的情况，并统计诱导率和增值倍数，结果如表4所示，不同生长素和培养基诱导安吉白茶多丛芽生根的效果不同，安
吉白茶在琼脂固体培养基中的根量多而短，在蛭石培养基中根的长度增加并有大量的不定根。iba诱导安吉白茶不定芽生根的效果优于iaa和naa。
115.表4生长素和培养基诱导安吉白茶多丛芽生根
[0116][0117]
由表1、2、3和4可知，本发明提供了一种安吉白茶组织培养快繁的方法，筛选出抑制外植体褐化的最适抗氧剂浓度和适合安吉白茶不定芽分化和生根的培养基，将安吉白茶植株的茎段分化为完整的个体，从而可以批量繁殖安吉白茶种苗。
[0118]
以上对本发明的具体实施方案例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。