三七皂苷R1在制备治疗胆汁性肾损伤药物中的应用

三七皂苷r1在制备治疗胆汁性肾损伤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于天然产物的应用领域，具体涉及三七皂苷r1对胆汁性肾损伤的治疗作用。


背景技术：

2.胆汁酸是胆固醇代谢的最终产物，在体内发挥着重要的生理作用。当发生胆汁淤积时，胆汁停止流动并积累胆汁酸，导致一系列临床疾病。未经治疗的胆汁淤积可能导致不可逆的组织纤维化和肝、肾功能衰竭。胆汁淤积引起的肾损伤被称为胆汁性肾病，严重者可能导致肾功能衰竭，甚至需要肾移植，寻找针对胆汁性肾病的治疗方案可能具有重要的临床价值。
3.大多数胆汁酸通常在近肾小管通过顶端钠依赖的ba转运子 (asbt) 重吸收，并通过门静脉血液循环输送回肝脏。而每天未经过重吸收的胆汁酸通过血液循环进入肾脏，再通过尿液排出，每天约有1-2μmol胆汁酸从尿液中排出。在发生胆汁淤积性疾病（如梗阻性黄疸、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎）时，血液中胆汁酸增多进而导致进入肾脏的胆汁酸增多，并在肾脏积累无法排出，给肾脏造成持续性损伤。
4.三七皂苷r1（notoginsenosider1）的分子式为 c
47h80o18
，是天然植物药材三七中具有代表性的特征化合物，有抗凝血、抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。
5.目前尚未发现三七皂苷r1具有治疗胆汁性肾损伤的研究报道。


技术实现要素：

6.本发明提供了三七皂苷r1的一种新用途，本发明首先通过胆管结扎诱导小鼠胆汁性肾损伤模型，然后使用三七皂苷r1对胆汁性肾损伤小鼠进行治疗，结果表明三七皂苷r1主要通过降低肾组织促胆汁排出mrp-2的表达来缓解小鼠胆汁性肾损伤，本发明首次将三七皂苷r1应用在制备治疗胆汁性肾损伤药物中，具有独创性。
7.本发明治疗胆汁性肾损伤是以三七皂苷r1为活性成分，用于制备治疗胆汁性肾损伤药物，还可以加入一种或多种药物制剂上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等；或者与其他活性成分复配发挥协同治疗胆汁性肾损伤的作用；可以制成药剂学上适宜的使用剂型，例如胶囊、丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
8.三七皂苷r1，一般经三七提取分离获得，其提取分离过程属于现有技术。本发明实验中所使用的三七皂苷r1为市场上购买得到，纯度在95 %以上。
9.在三七皂苷r1对胆汁性肾损伤的治疗作用的药理活性研究中，本发明通过动物实验对其活性加以证明，实验小鼠分为空白对照组、模型组、ng-r1的低、中、高剂量治疗组，实验采用胆管结扎手术建立胆汁性肾损伤小鼠模型，术后3天开始给药，各治疗组每天灌胃给药连续给药两周后，处死所有实验小鼠，取血及肾组织，根据处死时小鼠体重和肾重计算其
肾指数；肾组织经h&e染色后观察其组织病理学变化；检测肾组织中的mda、sod、gsh、tba含量；检测血清中cr、bun、tba；检查尿液中tba含量；实时荧光定量pcr检测炎症因子il-1β、il-6、tnf-α以及促胆汁酸排出因子mrp-2表达。
10.结果表明，在肾脏形态学上，相比正常组小鼠，模型组小鼠肾脏明显变黄，组织病理切片结果也表明模型组小鼠肾脏细胞结构遭到破坏，呈现大量的炎性细胞侵润；与模型组相比，治疗组小鼠肾脏变黄得到明显改善，肾脏细胞逐渐趋于正常小鼠，肾脏炎性坏死明显减少；同时，治疗组小鼠肾脏氧化应激水平较模型组小鼠显著下调，血液、肾脏及尿液中总胆汁酸含量明显减少；在基因水平上，治疗组小鼠肾脏炎症因子tnf-α、il-6及il-1β表达也显著下调（p《0.05）；促胆汁酸排出因子mrp-2表达明显上调。
11.以上研究结果表明，三七皂苷r1主要通过促进胆汁酸的排出来有效治疗胆管结扎导致的胆汁性肾损伤。
12.本发明为三七皂苷r1的应用提供了新途径，本发明通过三七皂苷r1对胆管结扎诱导的胆汁性肾损伤小鼠的治疗实验证明了三七皂苷r1能够促进胆汁酸排出，并有效缓解胆汁酸诱导的胆汁性肾损伤，本发明三七皂苷r1来源于天然产物，安全性高，适用于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
13.图1为小鼠组织病理学切片的h&e染色（200
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）结果，其中a图为空白组，b图为模型组，c图为三七皂苷r1治疗低剂量组，d图为三七皂苷r1治疗中剂量组，e图为三七皂苷r1治疗高剂量组；图2为三七皂苷r1对胆汁淤积小鼠肾组织氧化应激水平的影响；
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p《0.05，
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p《0.01；与模型组比较，
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p《0.05，
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p《0.01，其中a图为mda；b图为sod，c图为gsh；图3为三七皂苷r1对胆汁淤积小鼠肾功能指标的影响；
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p《0.01；与模型组比较，
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p《0.01，其中a图为cr；b图为bun；图4为三七皂苷r1对胆汁淤积小鼠血清及肾脏总胆汁酸含量；
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p《0.01；与模型组比较，
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p《0.01，其中a图为血清tba；b图为肾脏tba；图5为三七皂苷r1对胆汁淤积小鼠炎症反应的影响；
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p《0.01；与模型组比较，
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p《0.01，其中a图为炎症相关因子il-1β表达结果，b图为炎症相关因子il-6表达结果，c图为炎症相关因子tnf-α表达结果；图6为三七皂苷r1对胆汁淤积小鼠促胆汁酸排出因子的影响；
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p《0.05，
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p《0.01；与模型组比较，
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p《0.05，
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p《0.01。
具体实施方式
14.以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
15.实施例1：动物实验的分组及模型构建50只c57bl/6雄性小鼠，随机分为5组（每组10只）：空白组、模型组、三七皂苷r1治疗低剂量组（50mg/kg）、三七皂苷r1治疗中剂量组（100mg/kg）、三七皂苷r1治疗高剂量组
（200mg/kg）。通过胆管结扎方式构建胆汁性肾损伤，空白组开腹后缝合进行假手术，其余组开腹后将胆总管与血管分离，利用6-0非吸收手术线对胆总管进行结扎两次，将脏器归位后对腹腔进行缝合，并涂碘伏进行消毒处理，造模后第三天，开始给药治疗，空白组和模型组每天灌胃蒸馏水，治疗组每天分别灌胃给予三七皂苷r1 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，连续给药14天。
16.实施例2：样本收集及肾脏形态学观察14天后处死所有实验小鼠，处死前称量小鼠体重，取血，取出小鼠肾组织，生理盐水洗涤，擦去表面多余的水分，观察小鼠肾脏形态学变化，在肾脏形态学上，相比空白组小鼠，模型组小鼠肾脏明显变黄，与模型组相比，三七皂苷r1治疗组肾脏形态逐渐趋于正常红色，且高剂量更为明显。
17.实施例3：小鼠肾脏病理学检测肾脏经10%中性甲醛溶液固定后进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度4μm），切下的组织切片轻轻放在30%乙醇上进行第一次展片，然后用载玻片转移至45℃水浴锅中，第二次舒展，待切片完全展开时附于载玻片上；将切片立于支架上置于37℃烘箱烘干，用于后面的h&e染色。
18.h&e染色的具体操作步骤为：将烘干的切片两次放入二甲苯中，每次处理5-8min，对切片上的石蜡进行溶解；从二甲苯中取出切片后，按顺序移入无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各停留2min，最后流水清洗5min；将切片移入harris苏木素溶液中浸泡5min，流水冲洗5min后，擦干切片上残余的染液；再在75%盐酸乙醇浸泡10s，流水冲洗片刻；将切片放置50℃水浴锅中保持5min，置于95%乙醇1min脱水，放入75%盐酸乙醇2min；按95%乙醇、无水乙醇的顺序进行脱水，各级2min；将切片于二甲苯中透明5min；取出切片，晾干，在玻片中滴加树胶，然后用慑子加盖盖玻片，切片封好后，待其干燥后在光学显微镜下进行观察。由图1可看出，模型组与空白组相比肾脏受到病理损伤，呈现大量的炎性细胞侵润，无完整细胞结构，经三七皂苷r1给药后降低病理损伤，且高剂量效果更佳。
19.实施例4：小鼠肾组织氧化应激指标的检测从-80℃冰箱取出保存的小鼠肾组织样本，置于冰上化冻，然后用已灭菌处理的匀浆器将小鼠肾与生理盐水按质量比1：9的比例混合进行研磨，获得的匀浆液在4000rpm/min、4℃下离心15min，取上清；然后分别按照mda、sod、gsh试剂盒（购于南京建成生物公司）操作说明分别检测肾组织中mda、sod、gsh的含量，结果如图2所示，mda作为过氧化产物，在模型组小鼠中的水平明显上升，且远高于空白组小鼠；在三七皂苷r1治疗组中mda水平均有不同程度的下降，其中高剂量组最为显著（p《0.01）；sod和gsh是两种重要的抗氧化酶，可以维持体内的氧化与抗氧化的平衡，但模型组中sod和gsh的含量较正常组均大幅度降低，与模型组相比，三七皂苷r1组中二者的水平均有不同程度的回升。
20.实施例5：小鼠血清肾损伤指标的检测将小鼠血液在4000rpm/min、4℃下离心15min，取上清；然后分别按照cr、bun试剂盒（购于南京建成生物公司）操作说明分别检测肾组织中cr与bun的含量；结果见图3，图中显示在模型组小鼠中，cr与bun的含量明显上升，且远高于正常小鼠；在三七皂苷r1治疗组中cr与bun含量均有不同程度的下降，其中高剂量组最为显著（p《0.01）；cr和bun是两种衡量肾功能的重要指标，模型组中cr和bun含量较正常组显著上升，与模型组相比，三七皂苷
r1组中二者的水平均有不同程度的下降。
21.实施例6：小鼠血清及肾脏总胆汁酸含量的检测。
22.肾脏中胆汁酸检测取实施例4中肾脏匀浆，血液中胆汁酸检测取实施例5中血清，以上两种样品分别按照tba试剂盒（购于南京建成生物公司）操作说明检测肾脏及血液中tba的含量；结果见图4，图中显示在模型组小鼠中的tba含量明显上升，且远高于空白组小鼠；在三七皂苷r1治疗组中血液与肾脏的tba含量均有不同程度的下降，其中高剂量组最为显著（p《0.01）；胆汁淤积表征显示为血液与肾脏中胆汁酸剧增，模型组中肾脏与血液含量较正常组显著上升，与模型组相比，三七皂苷r1组中二者的水平均有不同程度的下降。
23.实施例7：小鼠肾组织促炎因子和促胆汁酸排出表达水平的检测利用rna提取试剂盒（购于上海生工生物公司）提取小鼠肾组织rna，按照goscripttmreverse transcriptase system逆转录合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μg total rna，依次加入50ng oligo（dt）、2μl dntp（2.5mm each）、depc水加至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl 5
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first-stand buffer、0.5μlrnasin（200u）、1μl m-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应；以合成的第一链cdna为模板进行rt-pcr分析，反应条件：95℃ ，15s；60℃，30s；72℃，30s；42个循环。每个样品3个重复，以β-actin作为内参基因，根据荧光定量pcr测量出的内参基因和目的基因的ct值，采用实验组/对照组= 2-δδct
为基因表达量计算il-6 、il-1β、tnf-α及mrp-2的基因表达水平，其中δct=实验组（目的基因ct值
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内参基因ct值）
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对照组（目的基因ct值
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内参基因ct值），使用spss软件进行分析；通过 primer premier 5. 0 软件设计引物如下：tnf-α上游引物为：gtgctaatggtggaccgc aacaa，下游引物为：tagggaaagtgccagcctct；il-1β上游引物为：tgactgtgagca tccacttctg，下游引物为：gtgacttcttttgtgattgggtta；il-6上游引物为：gag gtggaatctcagggttgtttt，下游引物为：caactgaggaatactgaatggctga；mrp-2上游引物为：gagattgacttttgtgcccagc，下游引物为：gagagagcagacagacgg acgg；β-actin上游引物为：gatcattgctcctcctgagc，下游引物为：acatctgctgga aggtggac。
24.实时荧光定量pcr结果如下图5、图6所示，其中图5为三七皂苷r1对胆汁性肾损伤小鼠体内炎症因子的影响，可以看出模型组小鼠肾组织中炎症相关因子il-1β、il-6与tnf-α的表达上升，表明其炎症水平显著上升（p《0.01）；经三七皂苷r1治疗可以下调炎症因子的表达，其中高剂量组最显著（p《0.01）；由图6可以看出，模型组mrp-2表达对比正常组有所上升，三七皂苷r1治疗组中mrp-2对比模型组上升更为明显，其中高剂量组最显著（p《0.01）表明经三七皂苷r1治疗后促进肾脏对胆汁酸的排出。