枳壳药材的质量双标可视化质量控制技术

1.本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及以枳壳对照药材为基准物质，建立一套不依赖于对照品，较为全面控制药材质量的方法，该方法稳定性、精密度良好，可以弥补目前枳壳药材质量控制的不足，能够为枳壳药材质量提升提供新思路。


背景技术：

2.枳壳药材为芸香科植物酸橙citrus aurantium l.及其栽培变种的干燥未成熟果实，主产于四川、江西和浙江，在湖北、湖南和重庆等地也有分布。枳壳的基原植物在历史上变迁复杂，曾有青皮、陈皮和枸橘等伪品作为枳壳入药，影响中药枳壳的临床合理使用。
3.随着现代中药分析手段的进步，枳壳药材质量控制方法主要包括单指标含量测定法、多指标含量测定法和指纹图谱与含量测定结合法，以上方法具有灵敏度高、重复性好的优点，能够为控制枳壳药材提供量化数据，但存在着单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种枳壳药材质-量双标控制方法。以枳壳对照药材为定性、定量的基准物质，采用高效液相色谱结合q-tof-ms技术，建立一套不依赖于对照品，较为全面科学地控制药材质量的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
6.本发明提供了一种枳壳药材质量控制标准的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1 基于对照药材的枳壳药材定性研究；步骤2 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究；步骤3 方法学考察。
7.进一步地，所述步骤1的具体步骤包括：（1）溶液的制备：取枳壳对照药材及供试药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50倍量的50%甲醇，称定重量，加热回流1 h，放冷，补足失重，摇匀，滤过；续滤液挥干，50%甲醇定容，摇匀，过0.22 μm滤膜，即得；（2）色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent ec-c
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色谱柱，色谱柱规格为3.0
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100 mm，2.7-micron；以0.1%甲酸水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速1.0 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长330 nm下进行检测；进样量5 μl；（3）特征图谱的建立：每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将330 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出获得10批供试药材的hplc叠加图谱；10批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对；
（4）相似度评价：以特征峰的相似度明确枳壳药材真伪。除湖北孝感枳壳样品以外，其余样品与对照药材的相似度均大于0.98；（5）特征峰化学成分解析：采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，鉴定出9个化学成分；（6）中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序：利用visual basic编程语言设计包含1个oel控件和4个command控件的适用于枳壳药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制程序。
8.更进一步地，所述（5）中鉴定出9个化学成分分别为：3号峰为圣草次苷，4号峰为新北美圣草苷，6号峰为芸香柚皮苷，7号峰为柚皮苷，9号峰为橙皮苷，10号峰为新橙皮苷，12号峰为枸橘苷，15号峰为川陈皮素，16号峰为橘皮素。
9.进一步地，所述步骤2的具体步骤包括：以步骤1中确定的7号峰“柚皮苷”作为内标物质，通过内标物质化学成分准确定量，计算除湖北孝感枳壳外，其余9批供试药材特征峰化学成分的相对含量，取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限。
10.进一步地，所述步骤2的特征峰均为枳壳发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。
11.进一步地，所述步骤3的具体步骤包括：（1）精密度实验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.0%，表明仪器精密度良好；（2）稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.4 %，表明供试品溶液在24 h内稳定；（3）重复性实验：按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.9 %，表明方法重复性良好；（4）线性关系考察：配制“柚皮苷”的6个质量浓度溶液，按“2.1.2”项下色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=1327.2x 87.58）、相关系数（r=0.999 1）。结果表明“柚皮苷”在0.6800
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5.7800 μg范围内线性关系良好。
12.进一步地，所述方法通过枳壳药材特征图谱中的特征峰作为枳壳药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。
13.进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分枳壳的优劣。
14.进一步地，所述方法通过visual basic编程语言设计的可视化的质-量双标质量控制程序适用于枳壳药材（饮片）。
15.与现有技术相比本发明的有益效果。
16.（1）本发明首次公开枳壳药材质-量双标控制方法，可以弥补目前枳壳药材质量控
nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出。10批供试药材的hplc叠加图谱，见图1；10批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对，见图2。
32.1.4 相似度评价。
33.除湖北孝感枳壳样品以外，其余样品与对照药材的相似度均大于0.98。
34.1.5 特征峰化学成分解析。
35.采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出9个特征峰。
36.本发明所述的枳壳药材质量控制方法，得到的枳壳药材特征图谱可以用于判断枳壳药材的真伪。
37.2.基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究。
38.7号峰“柚皮苷”分离效果好、峰面积大且保留时间稳定居中，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰相对定量研究。根据2020版《中华人民共和国药典》枳壳“含量测定”项下方法检测，10批产地供试品中，除来自于湖北孝感的供试品以外，其余供试品均符合药典规定。通过内标物质化学成分准确定量，计算除湖北孝感枳壳外，其余9批供试药材特征峰化学成分的相对含量。取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，见表1。
39.表1 基于内标物质的特征峰相对定量结果。
40.3.方法学考察。
41.3.1 精密度试验。
42.精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.0%，表明仪器精密度良好。
43.3.2 稳定性试验。
44.精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.4 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。
45.3.3 重复性实验。
46.按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积
rsd值均小于1.9 %，表明方法重复性良好。
47.3.4 线性关系考察。
48.配制“柚皮苷”的6个质量浓度溶液，按色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=1327.2x 87.58）、相关系数（r=0.999 1）。结果表明“柚皮苷”在0.6800
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5.7800 μg范围内线性关系良好。
49.实施例2湖北孝感枳壳供试品的鉴别。
50.湖北孝感枳壳样品与对照药材的相似度为0.776，小于0.90。通过本发明所设计的中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序（01版），可以直观的判定湖北孝感枳壳样品为伪品，见图3。
51.实施例3江西宜春枳壳供试品的鉴别。
52.湖北孝感枳壳样品与对照药材的相似度为0.984。通过本发明所设计的中药材（饮片）可视化的“质-量”双标质量控制方法程序（01版），可以直观的判定湖北孝感枳壳样品为“真”，质量为“优”，见图4。