一种植物组织微阵列MALDI-MSI高通量分析方法

electrospray ionization msi,desi-msi)中。当样品被挤压，其立体结构被压扁成平面结构时，不可避免的存在代谢物移位的情况。此外，在maldi-msi的植物材料的高分辨率实验中，采用印迹法进行样品处理少有报道。因此，在maldi-msi的实验中，为了获得足够质量的成像图像，可操作性和电离效率仍有待提高，亟需一种高通量的能将maldi-msi广泛应用于植物组织样本的分析方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种植物组织微阵列maldi-msi高通量分析方法，具有高通量、可控制、易操作等优点，为植物体内代谢物的生物合成提供了新的信息，是植物代谢研究、指导组织培养的前期植物生长调节剂使用的有效工具，有助于为植物组织培养、植物代谢研究和植物资源开发提供参考。
7.本发明所提供的植物组织微阵列maldi-msi高通量分析方法，包括如下步骤：
8.1)将植物组织进行均质得到植物组织匀浆；
9.2)将所述植物组织匀浆填充于模具的若干阵列排布的通孔中，冷却成型后进行切片，得到植物组织切片；将所述植物组织切片融裱在导电玻片上；
10.3)向所述植物组织切片上喷涂基质，进行maldi-msi成像分析。
11.上述的分析方法中，所述植物组织为岩青兰(d.rupestre)的叶片。
12.上述的分析方法中，将所述植物组织置于设有瓷珠的均质管中进行均质处理，条件如下：
13.7500～15000rpm转速下均质30～60s，重复2～3次，每次间隔15s；
14.可将所述植物组织匀浆暂存于0℃(或冰水中)备用
15.上述的分析方法中，所述模具的材质可为明胶、石蜡或琼脂；
16.所述通孔的内径可为0.5～1.5mm；
17.所述模具可按照下述方法制备：
18.在一盒体中加入明胶溶液、石蜡溶液或琼脂溶液，然后向所述明胶溶液中布置若干阵列排布的细管，冷却成型，移除所述细管即得到所述模具；
19.所述细管的外径为1.0～2.0mm，移除所述细管后即在所述明胶内形成阵列排布的通孔。
20.上述的分析方法中，所述细管由移液枪枪头切除粗端和细端得到；
21.所述细管粘贴于所述盒盖上。
22.上述的分析方法中，所述植物组织切片的厚度可为10～30μm，如20μm。
23.上述的分析方法中，步骤2)中，可于4℃下进行冷却成型；
24.将成型后的所述样品阵列模具固定在低温冷冻切片机的样品靶托上，可在-20℃条件下冷冻30min定型后进行切片。
25.上述的分析方法中，所述基质可为2-巯基苯并噻唑(2-mbt)、2,5-二羟基苯甲酸(dhb)或α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)；
26.采用甲醇、水与甲酸或三氟乙酸的混合液配制所述基质的溶液。
27.上述的分析方法中，所述基质的溶液的浓度为12～25mg/ml，可为12mg/ml；
28.所述喷涂的条件为：
29.喷涂器与所述导电玻片的距离可为10～30cm，如20cm；
30.喷涂程序为：每次喷涂基质3～5s，孵育10～20s，干燥10～20s。
31.喷涂基质后，即可进行maldi-msi成像分析，在常规条件下进行检测分析即可，如使用bruker autoflex speed maldi-tof/tof质谱仪进行数据采集及质谱成像实验，maldi离子源为2000hz的固态nd:yag紫外激光器。
32.本发明将植物组织匀浆后冷冻于模具中切片，植物组织直接匀浆操作简单，还可以很大程度上减少表面蜡质层、细胞壁等的影响。除此之外，样品切片的厚度也可以通过切片机准确控制，一般为20μm左右。并且，将组织切片直接融裱在导电玻片上的操作也可以排除掉导电胶带带来的检测负面影响，如离子化效率降低。
33.本发明方法结合了maldi-msi无标记、高灵敏度、高通量的优点与组织微阵列高效率，快速和低消耗的优点，能高通量、快速地同时检测不同植物生长调节剂处理的植物组织培养样品，为植物组织培养的分析提供了一种有前景的方法。从采样角度来看，采集同一批样品的不同个体放在同一个均质管内，相比于单片叶片切片，排除了样品个体的差异，使实验样本更具有广泛性和代表性。从模具的角度来看，由于明胶模具的孔是由移液枪枪头倒模出来的，其排布和数量具有灵活性，可以根据实验实际的需求进行调整。同一块模具里填充的样品可以是相同处理的叶片，也可以是不同植物生长调节剂处理或者不同生长阶段的叶片，这样就能高通量、快速地同时检测不同处理的植物组织培养样品。
34.现有方法根据植物不同部位(如叶片、茎段、愈伤组织等)的组织结构不同，在制备植物样品切片过程中需采用不同的切片技术，而本发明方法简单易操作，直接进行匀浆切片不必考虑以上的问题，极大促进了质谱成像技术在植物领域更为广泛的应用。并且切片的均一性和方法的稳定性都十分良好，可以应用到植物组织培养材料的快速检测中，具有应用前景。maldi-msi技术具有较高的检测灵敏度及较强的分子鉴定能力，测定时可在组织切片中同时检测获得多种分子，为寻找、阐明和鉴定重要分子等提供了快速、可视化的结果。
35.本发明方法可为植物体内代谢物的生物合成提供了新的信息，是植物代谢研究、指导组织培养的前期植物生长调节剂使用的有效工具，为植物组织培养、植物代谢研究和植物资源开发提供参考。
附图说明
36.图1为模具制作流程图。
37.图2为岩青兰(图2(a)-图2(c))种子苗叶片不同制备方法maldi-ms质谱图。
38.图3为样品均一性考察结果，其中，图3(a)为单一切片的五点取样法示意图，图3(b)为单一切片五次采样maldi-ms检测结果及局部放大谱图。
39.图4为植物组织微阵列日内日间稳定性考察结果，其中图4(a)为连续三天随机取样示意图，图4(b)为15片微阵列切片maldi-ms检测结果及局部放大谱图。
40.图5为各实验材料的形态学比较，其中，图5(a)为45d，由种子在ms基本培养基得到的岩青兰无菌实生苗；图5(b)为45d，由顶芽在ms 6-ba 1.0mg/l培养得到的岩青兰丛生芽；图5(c)为45d，由顶芽在ms tdz 1.0mg/l培养得到的岩青兰丛生芽。
41.图6为岩青兰无菌实生苗、6-ba诱导苗、tdz诱导苗检测到的代谢物maldi-ms谱图
比较，其中，图6(a)为背景干扰峰；图6(b)为岩青兰无菌实生苗检测到236个代谢物离子信号谱图；图6(c)为6-ba诱导苗检测到215个代谢物离子信号谱图；图6(d)为tdz诱导苗检测到241个代谢物离子信号谱图。
42.图7基于maldi-ms和lc-ms对不同pgrs诱导岩青兰苗代谢物pca分析结果及主要差异代谢物(vip》1)。
43.图8为岩青兰无菌实生苗和6-ba、tdz诱导丛生苗主要差异代谢物maldi-msi结果。
具体实施方式
44.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
45.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.下述实施例中所用的实验材料及试剂：6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-ba)、苯基噻二唑基脲(thidiazuron，tdz)，2-巯基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole，2-mbt)、3,5-二羟基苯甲酸(3,5-dihydroxybenzoic acid，dhb)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，chca)、甲酸(formic acid，fa)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，tfa)、舒缓激肽片段1-7、明胶购买自美国sigma-aldrich公司；质谱级甲醇(methanol，meoh)、乙腈(acetonitrile，acn)购买自德国merck公司；超纯水(milli-q h2o，mq h2o)由纯水仪制得。
47.下述实施例中所用的植物材料为岩青兰(dracocephalum rupestre hance，d.rupestre)、种子，采自北京东灵山(北纬n40
°1′
49.75
″
，东经115
°
27
′
18.60
″
)海拔约1700m的山坡草地，采集时间为2020年9月。培养方法如下：
48.将采集的种子置于小烧杯中，用蒸馏水浸泡，每8～10h换一次蒸馏水，24h后用纱布搓洗掉表面绒毛直至表面不黏滑。然后转至超净工作台，先用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3遍后再选用10％～12％h2o2消毒15～30min。最后将种子用无菌水冲洗4～5遍，接种于ms(murashige和skoog)基本培养基，加入3％(w/v)蔗糖和0.7％(w/v)琼脂，ph值为5.6～5.8。随后，将其移入温度为24
±
3℃、光强为30～40mmol/(m2·
s)、光照时间为12h/d的无菌培养室中，保持相对湿度为70％。
49.为了获得不定芽，将培养30d的岩青兰种子苗在无菌条件下用手术刀取下顶芽，然后用镊子将以上外植体接种至含有6-ba(1.0mg/l)或tdz(1.0mg/l)的ms培养基上。随后，将其移入温度为24
±
3℃、光强为30～40mmol/(m2·
s)、光照时间为12h/d的无菌培养室中，保持相对湿度为70％。
50.分别取新鲜叶片备用，每种材料均从30个重复中取样。
51.下述实施例中数据处理和统计分析方法：数据采集的分析使用仪器配套的flexanalysis3.4软件进行初步质谱观测和处理。质谱成像结果使用fleximaging 2.l软件提取并分析，通过dataanalysis 4.0软件对质谱图进行处理和数据提取。
52.a、化合物鉴定
53.首先采用内部校准法对质谱图m/z 100～1500质量范围进行校正，将同时满足信噪比》3并具有可靠同位素峰的离子峰暂定为有效化合物。在相关数据库如metlin(http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php)、hmdb(http://www.hmdb.ca)和lipid maps(http://www.lipidmaps.org/tools/index.html)的基础上，根据测量的m/z值进行搜
索匹配(质量误差《
±
10ppm)。数据库搜索针对三种离子加合形式，即[m h]

、[m na]

和[m k]

。同时，结合同位素匹配结果、二级质谱鉴定结果以及部分标准品对照对化合物的结构进行鉴定。
[0054]
b、组间差异表达化合物的鉴别
[0055]
首先用matlab软件将数据对齐，使数据标准化，从而消除实验因素对数据的影响。然后使用软件ibm spss statistics 25.0进行处理，采用单因素方差分析(one-way anova)对组间的相对峰强度进行数据统计分析，组间的差异显著性分析使用ducan法进行比较，p＜0.05时，表示化合物在不同组之间差异显著，即可鉴别出组间差异表达化合物。
[0056]
c、主成分分析
[0057]
首先将maldi-ms和lc-ms的数据原始数据分别导入数据分析软件(如excel，spss等)，通常以m/z为自变量，峰强度为因变量，对其进行归一化处理，然后将处理后的数据导入开源网站metaboanalyst(https://www.metaboanalyst.ca/metaboanalyst/)，进行主成分分析(principal component analysis，pca)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis，opls-da)，对各个主成分进行综合评价并导出各代谢物的变量投影重要性(variable importance for the projection，vip)值。然后利用spss软件对导出差异代谢物进行t检验。最后和已知的该植物的相关研究以及相关数据库进行对比，分析出含量较高的几个主要的物质。
[0058]
下述实施例中lc-ms样品制备及仪器参数：
[0059]
样品前处理：称取三种植物材料的新鲜叶片各300mg，分别置于2ml均质管中，每管加入3粒瓷珠，均质管内加入500μl甲醇：h2o(80:20,v/v)。用均质器在2℃条件下，用7500rpm转速匀质30s，重复两次，每次间隔15s。然后在15000rpm，2℃条件下离心4分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后，取200μl备用。
[0060]
仪器分析条件：使用仪器为acquity超高效液相色谱仪(acquity uplc i-class plus system,waters corp.,milford,ma,usa)串联静电场轨道阱三合一质谱仪(orbitrap fusion lumos tribrid，thermo scientific,bremen,germany)。
[0061]
色谱条件：waters acquity uplc beh c
18
柱(2.1mm
×
50mm，1.7μm)；流动相0.1％甲酸水(a)-0.1％甲酸乙腈(b)，洗脱梯度(0～30min，5％～100％b；30～35min，100％b；35.1～40min，5％b)；柱温为25℃；体积流量0.3ml/min；进样量10μl。
[0062]
质谱条件：waters uplc串联thermo orbitrap fusion lumos tribrid电场轨道阱三合一质谱仪；离子源为电喷雾esi全扫描正离子模式；电喷雾电压为4500v；离子源温度220℃；干燥器流速为8l/min；辅助气体为氮气。一级质谱扫描范围设定为30～2000da，模式选择二级质谱自动扫描模式，选择响应值最高的5个质谱碎片进行二级质谱扫描，将二级扫描范围设定为30～2000da，并开启动态背景扣除以减少干扰。
[0063]
下述实施例中样品均一性及方法稳定性方法：
[0064]
为验证匀浆切片是均匀的，即从单一切片的任何位置采集数据都没有显著性差异，利用对角线五点取样法对岩青兰无菌实生苗的一个切片的5个代表区域进行数据采集。具体取样过程为：过圆心画两条相互垂直的直径，圆心为第一个区域，在直径上距离圆心0.6mm分别取剩余4个代表区域，按上述方法每个区域重复3次采集，数据处理后比较得到的谱图。
[0065]
对于五个区域间的相对峰强度，使用软件ibm spss statistics 25.0进行处理，采用单因素方差分析(one-way anova)进行数据统计分析，组间的差异显著性分析使用ducan法进行比较，p＜0.05时，表示相对峰强度在不同组之间差异显著。
[0066]
为考察本发明方法日内日间的稳定性，在同1天内重复5次数据采集、连续采集3天，测得各物质母离子及其碎片离子的离子丰度。计算各离子丰度的日内相对标准偏差(relative standard deviation，rsd)和日间相对标准偏差。
[0067]
实施例1、植物材料的微阵列maldi-msi高通量分析方法
[0068]
1、组织匀浆
[0069]
称取植物材料的新鲜叶片各300mg，分别置于2ml均质管中，每管加入3粒瓷珠，均质管内不加任何溶剂。用precellys 24多功能低温样品均质器在2℃条件下，用7500rpm转速匀质30s，重复两次，每次间隔15s，即得到植物组织匀浆，暂存于0℃(或冰水中)备用。
[0070]
2、模具的制作
[0071]
制作流程图如图1所示：(a)取10μl白色枪头，切去粗端及细端1cm，中间部分用薄双面胶固定在盖子上；(b)往盒子里加入预先准备好的10％明胶溶液(w/v，mg/ml，50℃)，盖上带枪头的盖子，置于4℃冷却成型；(c)1h后将明胶取出，内部孔径约为1mm，即植物匀浆组织的模具；(d)将匀浆后的植物组织填充到模具当中，尽量避免有气泡存留；(e)随后把带有植物材料的模具固定在低温冷冻切片机的样品靶托上，在-20℃条件下冷冻30min定型后进行切片，切片厚度为20μm；(f)将载物台上的组织切片小心地融裱在导电玻片上。
[0072]
3、组织切片及基质喷涂
[0073]
将2-mbt溶于甲醇:h2o:fa(80:18:2,v/v)的混合溶液中，此时基质浓度为12mg/ml。使用基质喷涂装置(get-sprayer(iv)，hit co.,ltd,beijing,china)在组织切片上喷涂上约300μl的ddh2o使组织湿润，喷涂程序为：2
×
10s，每次间隔10s，喷涂器与导电玻片保持20cm的距离。随后立即喷涂配置好的基质溶液，喷涂程序为：每次喷涂基质3s，孵育15s，干燥15s。喷涂结束后将带有样品的导电玻片放置真空干燥罐中抽真空10～20min。结束后取出放入maldi-ms准备进行检测。组织切片的光学图像由扫描仪(olympus bx53 microscope)扫描获得。
[0074]
4、仪器分析条件
[0075]
4.1一级数据扫描
[0076]
将带有样品的导电玻片放置在靶板上，使用bruker autoflex speed maldi-tof/tof质谱仪进行数据采集及质谱成像实验。maldi离子源为2000hz的固态nd:yag紫外激光器。
[0077]
数据采集在100～1500da的质量范围内获得正离子反射模式谱图，每个谱图记录了10次激光扫描的积累，每一次扫描积累了500次激光，累计共5000次激光。质谱成像是在使用bruker的fleximaging 4.1软件的基础上，使用一支校正笔在组织切片周围标记3个“校准点”以正确定位激光进行采集。采样时选择正离子反射模式，85％激光能量，每个像素点随机扫描500次，成像分辨率为150μm
×
150μm，质量检测范围为100～1500da。每次检测前，均使用基质(dmca)和标准品(舒缓激肽片段1-7[m h]

，m/z 757.3992)进行质荷比校准。
[0078]
4.2二级数据扫描
[0079]
采集一级谱图数据后，以响应强度较高的信号峰作为母离子，对其进行子离子二级数据采集。扫描模式为lift模式，碰撞能为20ev～40ev。
[0080]
实施例2、考察本发明方法的可行性
[0081]
目前maldi-msi的植物叶片样品前处理多为取单一叶片进行切片，这样切片的成功率低，仪器检测出来的有效峰个数少，并且信号峰的强度也不理想。因此，本发明将植物叶片样品制备的方法进行优化，从而建立一种基于maldi-msi的植物组织微阵列分析的新方法。下面将从方法的构建、验证与应用这三个方面来证明本发明方法的可行性。
[0082]
一、样品前处理方法的优化
[0083]
为优化实验条件，采取了三种不同的样品制备方法，第一种处理是将未经过任何处理的叶片直接用导电胶带固定在导电玻片上；第二种是使用冷冻切片机将叶片表面的蜡质层去除掉，再用导电胶带固定在导电玻片上，此亦为多数研究者会采用的方法；第三种是将叶片匀浆后冷冻于模型中切片，然后直接融裱在导电玻片上，即本发明采用的方法。
[0084]
以上三种方法得到的样本同时进行2-mbt基质喷涂，然后放入仪器中进行数据采集，获得质谱图及相关数据。图2为岩青兰无菌实生苗叶片不同制备方法下获得的maldi-ms质谱图。
[0085]
(1)未经处理的叶片
[0086]
由图2(a)可以看到，未经过任何处理的植物叶片效果很差，仪器能检测到的物质非常有限。对比2-mbt基质的谱图，两者在有效峰数目及峰强度方面相差不大，可以证明此种条件下未经处理叶片内的物质不能被检测到。
[0087]
maldi-ms是必须依赖基质进行辅助，基质与样本形成共晶体后才能从激光中吸收能量使样本解吸。以上情况认为是因为受到叶片表面的蜡质层、植物细胞壁等的影响，导致基质无法与样本有效地发生共结晶，从而无法很好地离子化，因此检测到的基本上只有基质峰。
[0088]
(2)去除表面蜡质层的叶片
[0089]
为解决上述的问题，maldi-msi样品制备一般会采用冰冻切片，即在低温条件下去除掉影响实验效果的蜡质层。
[0090]
图2(b)是去除表面蜡质层后叶片的质谱图，比较与基质峰和未经过处理叶片的谱图后发现，只有在m/z 607.08处附近有一些较为明显的有效峰。然而，受植物细胞壁、细胞间隙大、含水量高等影响，基质与样本代谢物仍不能很好的形成共结晶，检测效果仍不理想。此外，对于扁平不规则植物样本，获得高质量的植物组织冰冻切片难度也较大。
[0091]
除此之外，组织切片厚度也是影响maldi-msi分析的重要影响因素。沿叶片上表皮刮除蜡质层后的叶片依然比较厚。较厚的切片虽然能保证组织结构的完整性，但是maldi-ms仪器的内部结构多数是固定的，难以根据样品的厚度调节激光光路以及样品表面到离子聚焦装置的距离，因此容易导致激光聚焦偏移和质谱响应信号降低，从而影响maldi-msi的分析结果。
[0092]
(3)叶片匀浆后切片直接融裱
[0093]
为提高可操作性及离子化效率，本发明将叶片匀浆后冷冻于明胶模具中切片，植物组织直接匀浆操作简单，还可以很大程度上减少表面蜡质层、细胞壁等的影响。除此之外，样品切片的厚度也可以通过切片机准确控制，一般为20μm左右。并且，将组织切片直接
融裱在导电玻片上的操作也可以避免导电胶带带来的负面影响。
[0094]
由图2(c)整体来看，仪器能检测到的分子离子数目大大增多，信号峰的强度也大大增强，图2(c)中m/z 445.20、m/z 607.08和m/z 871.51附近分子均能被检测，且信号较高。以上结果可以认为是经过匀浆之后，去除了叶片表面蜡质层和内部细胞壁的阻碍，并且样品切片较薄使激光能很好聚焦，从而使离子化效率提高，质谱响应信号增强，利于仪器的检测。
[0095]
综上所述，本发明方法结合了maldi-msi无标记、高灵敏度、高通量的优点与组织微阵列高效率，快速和低消耗的优点，能高通量、快速地同时检测不同植物生长调节剂处理的植物组织培养样品，为植物组织培养的分析提供了一种有前途的工具。从采样角度来看，采集同一批样品的不同个体放在同一个均质管内，相比于单片叶片切片，排除了样品个体的差异，使实验样本更具有广泛性和代表性。从模具的角度来看，由于明胶模具是利用移液枪枪头倒模出来的，其排布和数量具有灵活性，可以根据实验实际的需求进行调整。同一块模具里填充的样品可以是相同处理的叶片，也可以是不同植物生长调节剂处理或者不同生长阶段的叶片，这样就能高通量、快速地同时检测不同处理的植物组织培养样品。
[0096]
二、样品均一性及方法稳定性
[0097]
本发明利用对角线五点取样法对岩青兰无菌实生苗的一个切片的5个代表区域进行信息采集(检测范围为100～1500da)，数据处理后得到的比较谱图，见图3。由图3(b)可以看到，能检测到的信号峰基本一致，其信号峰的强度也无明显差异。550～660da区间的视图窗口经过放大后，可见这5次检测的谱图峰型也十分相似，基本一样。
[0098]
选取5个有效信号峰(m/z 559.14、m/z 593.29、m/z 607.08、m/z 621.45、m/z 645.26)进行差异显著性分析，结果见表1。由表1可知，相同质核比不同区域的差异不显著，即这5个区域的信号峰强度无明显差异，切片是均匀的。
[0099]
由上述可认为每个组织匀浆切片都是均一的，数据采集时激光打在单一切片的任何一个区域得到的结果都是无显著性差异的，保证了信息采集时的准确性。并且在样品采集阶段选取了大范围的样品一起进行匀浆，可以消除样品个体间的差异，更具有代表性。
[0100]
表1日内五点取样差异显著性分析
[0101][0102]
为考察该方法日内日间的稳定性，对岩青兰无菌实生苗切片在同一天内重复5次数据采集、连续采集3天，以相对峰强度的变化为依据，对其进行稳定性分析(图4)。实验结果表明(表2)，日间的相对标准偏差均小于5％，分析结果表明该方法具有很好的稳定性和重现性，植物生长调节剂和喷涂的基质均不干扰测定，稳定性足以满足在植物组织培养领
域的应用。
[0103]
表2日内日间稳定性考察
[0104][0105]
综上所述，本发明方法具良好稳定性，并且制备的样品切片具有均一性，可以应用到植物组织培养材料的快速检测中，是一种有应用前景的分析方法。
[0106]
三、实生苗和pgrs诱导丛生芽的差异
[0107]
传统的组织培养研究方法是利用不同植物生长调节剂进行处理，诱导出愈伤组织或丛芽，通过鲜重、出芽率、诱导率、增值系数生物特性等方面进行判断。从形态学来看，岩青兰的无菌实生苗及分别用植物生长调节剂诱导获得的丛生芽非常类似难以明显区分(图5)，可根据本发明建立的实验方法，比较不同调节剂处理的样品所含化合物的差异。将以下材料的叶片分别经过匀浆切片后融裱在一张导电玻片上，然后进行2-mbt基质喷涂后放入maldi-ms中进行分析。
[0108]
3.1不同pgrs处理间组培材料内源性化合物的质谱图比较
[0109]
图6为正离子模式下岩青兰三种植物材料的质谱谱图(已归一化)，检测到的化合物质核比主要集中在100～300da和400～700da范围内。整体上看，三种植物材料的质谱谱图的峰型总体相似，但也有明显差别。
[0110]
图6(a)为2-mbt的基质谱图，作为空白对照；图6(b)为岩青兰无菌实生苗的质谱图，有效峰根据相对峰强度由高到低分别为m/z 607.08、m/z 167.99、m/z 334.97和m/z 559.14等；图6(c)为6-ba诱导丛生芽的质谱图，有效峰根据相对峰强度由高到低分别为m/z 607.08、m/z 167.99、m/z 334.97和m/z 871.55等；图6(d)为tdz诱导丛生芽的质谱图，有效峰根据相对峰强度由高到低分别为m/z 167.99、m/z 607.08、m/z 334.97和m/z 459.18等。经鉴定，m/z 167.99和m/z 334.97为2-mbt基质峰；m/z 607.08为neobignonoside([m k]

)，属于类黄酮化合物，具有抗氧化活性；m/z 459.18为多肽(his-thr-ser-asp，[m h]

)；m/z 559.14为阿尔巴诺b(albanol b，[m h]

)，属于香豆酮类化合物，具有抗老年痴呆症、抗菌和抗氧化活性；m/z 871.55为pg(44:10)，属于脂类分子。
[0111]
针对以上实验材料，共检测到312个化合物，并且根据文献及数据库共鉴定出228个化合物。其中，在岩青兰无菌实生苗中共检测到236个化合物，鉴定175个化合物：包括脂类化合物67个、氨基酸类化合物5个、酚酸类化合物15个、酚类化合物5个、有机酸类化合物4个、生物碱类化合物1类、萜类化合物21个、黄酮类化合物18个、植物激素类化合物2个、寡肽类化合物26个和其他化合物11个等(表3)。6-ba诱导的岩青兰丛生芽共检测到215个化合物，鉴定157个化合物：包括脂类化合物49个、氨基酸类化合物9个、酚酸类化合物12个、酚类化合物6个、有机酸类化合物5个、生物碱类化合物3类、萜类化合物15个、黄酮类化合物19个、植物激素类化合物4个、寡肽类化合物23和其他化合物12个等(表3)。tdz诱导的岩青兰
丛生芽共检测到241个化合物，鉴定177个化合物：包脂类化合物60个、氨基酸类化合物10个、酚酸类化合物18个、酚类化合物5个、有机酸类化合物5个、生物碱类化合物1类、萜类化合物20个、黄酮类化合物15个、植物激素类化合物3个、寡肽类化合物25和其他化合物15个等(表3)。
[0112]
表3 maldi-tof msi法在岩青兰实生苗叶片、6-ba和tdz诱导的岩青兰不定芽叶片中检测并鉴定的化合物
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[0123][0124]
3.2基于maldi-ms和lc-ms的pca结果
[0125]
根据本发明实验方法，选取了岩青兰不同植物生长调节剂处理的样品，比较同种植物的三种样品所含的重要化合物的差异，每个点代表一次实验，每种植物材料都进行三次平行重复实验，点与点之间的距离代表各个样品之间存在的特征差异程度。
[0126]
由图7以看出，无论是利用maldi-ms还是lc-ms进行检测，岩青兰植物的三种材料都可以很好地区分开。其中，图7(a)显示岩青兰maldi-ms的pca分析结果，pc1和pc2分别表示了87.6％和12.4％的组间差异；图7(b)显示岩青兰lc-ms的pca分析结果，pc1和pc2分别表示了82.3％和16.8％的组间差异，能极好地反映样本的绝大部分信息。
[0127]
比较maldi-ms和lc-ms同一材料三次重复的样品点，组内的三个点之间都十分接近甚至重叠在一起，说明组内差异小，具有非常好的重复性。其中，利用maldi-ms检测得到
数据的pca结果中，尽管岩青兰实生苗样本之间在没有明显差异性的前提下略有离散，然而两种pgrs诱导的岩青兰样本在maldi-ms检测组中明显较lc-ms更为集中，进一步证明了植物组织微阵列分析新方法的稳定性，体现了该新方法的优势。
[0128]
上述表明基于maldi-ms的植物组织微阵列分析新方法得到的数据信息真实可靠，而且通过pca分析可以很好地区分岩青兰的三种材料，基本上能媲美lc-ms分析效果，具有良好的可靠性和准确性。基于opls-da分析可以得到所有离子峰对分类的贡献，其中贡献最大的一些离子在三种材料中的强度均具有较大差异(vip》1)，即内源性差异化合物，分析研究这些差异化合物有利于了解植物生长调节剂对植物代谢和形态变化的影响(7(c))。
[0129]
3.3微阵列maldi-msi结果
[0130]
岩青兰组织切片经一次成像即可获得大量的数据信息，且微阵列使该次成像能同时呈现多种不同实验材料的结果，能直观地、高效率地展现出不同植物生长调节剂处理的材料内源性化合物变化。本发明选取具有代表性的15种内源性差异化合物进行成像，maldi成像结果见图8。
[0131]
由此可见，本发明方法可以直观地、高通量地检测到岩青兰不同材料的植物内源性化合物变化，可在微观角度对最佳人工培育条件优化提供坚实且有效的分子依据。