一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法与流程

技术特征：
1.一种3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)先后采用第一消化液和第二消化液对羊膜组织进行消化，消化结束后除去所述第二消化液，分离得到原代羊膜间充质干细胞；(2)对经步骤(1)处理得到的所述原代羊膜间充质干细胞进行培养，待细胞融合度达到80％-90％时，采用胰酶替代物消化，得到p0代羊膜间充质干细胞；(3)对所述p0代羊膜间充质干细胞进行3d生物反应器培养，得到p1代羊膜间充质干细胞；(4)对所述p1代细胞进行冻存，即得所述种子库；所述第一消化液包括胰酶替代物和分散酶；所述第二消化液包括胶原酶a和脱氧核糖核酸酶i。2.根据权利要求1所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述胰酶替代物为tryple select，浓度为1x；所述分散酶的浓度为1-3mg/ml。3.根据权利要求1所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述第二消化液中，胶原酶a的浓度为1-3mg/ml，脱氧核糖核酸酶i的浓度为50-200u/ml。4.根据权利要求1所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述生物反应器内含有微载体；所述生物反应器中接种的细胞浓度为(1-3)
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107cells/g微载体。5.根据权利要求4所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，步骤(3)中：培养结束后，先采用微载体裂解液裂解所述微载体，释放细胞；再采用tryple select对所得细胞进行消化；所述微载体裂解液的浓度为1.5x；所述tryple select的浓度为1x。6.根据权利要求5所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述生物反应器的培养条件为：ph7.3-7.4，温度36.8-37.2℃。7.根据权利要求5所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，所述p0代羊膜间充质干细胞接种于生物反应器后，搅拌条件为：a.d0先35-40rpm搅拌5-10min，再0-1rpm搅拌50-70min，循环24次；b.d1-d2 35-40rpm恒速搅拌；c.d3-d5 40-45rpm恒速搅拌；步骤b中，还包括向所述生物反应器中补加培养基的步骤；步骤c中，还包括更换培养基的步骤：若所述生物反应器中，葡萄糖含量降低至初始葡萄糖含量的2/3，更换1/3培养基；若所述生物反应器中，葡萄糖含量降低至初始葡萄糖含量的1/2，更换1/2培养基。8.根据权利要求1所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化在37℃恒温摇床中进行，所述恒温摇床的转速为100-200rpm；所述第一消化液消化的时间为1-2h，除去所述第一消化液的步骤包括过100目筛和pbs漂洗；所述第二消化液消化的时间为1.5-2h，除去所述第二消化液的步骤包括离心，所述离
心的离心力为400g，离心时间为5-10min。9.根据权利要求1所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，步骤(1)之前还包括采用清洗液对羊膜进行清洗并剪成所述羊膜组织的步骤；所述清洗液为含0.2％-0.6％庆大霉素的磷酸盐缓冲液；步骤(1)中，所述第一消化液与所述羊膜组织的体积比为1:1；所述第二消化液与经所述第一消化液处理所得产物的体积比为1:1；所述羊膜组织为(1-3)cm
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(1-3)cm的组织块。10.根据权利要求1-9任一项所述的3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中所采用的培养基为t4完全培养基；所述t4完全培养基包括t4间充质干细胞基础培养基和终浓度为1-10％的血小板裂解液。

技术总结
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法。本发明的一种3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法包括下述步骤：(1)先后采用第一消化液和第二消化液对羊膜组织进行消化，分离得到羊膜间充质干细胞；(2)对经步骤(1)处理得到的羊膜间充质干细胞进行培养，得到P0代羊膜间充质干细胞；(3)对P0代羊膜间充质干细胞进行3D生物反应器培养，得到P1代羊膜间充质干细胞；(4)对P1代细胞进行冻存，即得种子库。本发明的3D培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法可在较短的体外培养时间下，得到传代次数少(P1代细胞)的种子库细胞，可保持较好的干性和归巢性，有助于发挥其临床效果。有助于发挥其临床效果。有助于发挥其临床效果。


技术研发人员：黄莹之 沈甜甜 闫占海 梅寒 禹雨
受保护的技术使用者：宁波希诺赛生物科技有限公司
技术研发日：2022.08.18
技术公布日：2022/11/11