一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ECL免疫传感器

一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器
技术领域
1.本发明涉及一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器，属于电化学发光分析技术方法领域。


背景技术：

2.电化学发光（ecl）是一种兼具化学发光和电化学发光的技术，具有响应快、灵敏度高和易于控制等优点，已在免疫分析领域获得广泛应用。ecl免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过抗原与抗体之间的特异性结合，具有灵敏度高、选择性好、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点。roche公司采用钌联吡啶作为标记物，发展了一系列总光强测量型ecl免疫传感器，垄断了ecl的体外诊断应用。
3.现有的阳极免共反应剂型ecl传感器通常在较高氧化电位产生光辐射，但电化学干扰严重且对电极的电化学耐受性造成不利影响。中国专利文献cn114371204a公开了一种免共反应剂型近红外电化学发光传感器，以蛋氨酸包被的n型纳米金簇作为发光试剂和标记物，采用在无共反应剂条件下直接电氧化标记物的方式，实施了电化学发光免疫传感，其电化学发光电位为1.1 v，其电位较高，电化学干扰严重。
4.因此，更低电位的免共反应剂型ecl传感对推动相关技术的更广泛应用具有重要价值。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，尤其是免共反应剂型ecl免疫传感的发光电位过高的局限，本发明提供一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器，突破了已报道的免共反应剂型ecl免疫传感器发光电位过高的局限性，发光电位为0.24 v且发光电势窗口窄，避免了电化学干扰，在检测胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp）时具有特异性好、检测范围宽、稳定性好、成本低的优点。
6.术语说明：一抗ab1：指胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp）的对应抗体，本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
7.二抗ab2：指progrp抗原和一抗的对应二抗。
8.1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，简称edc。
9.n-羟基琥珀酰亚胺，简称nhs。
10.抗原指的是胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp）。
11.本发明是通过如下技术方案实现的：一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器的构建方法，包括步骤如下：（1）将progrp标记一抗水溶液（progrp-ab1）滴加在工作电极表面孵育，得到一抗
标记电极；（2）纯化后的水溶性cdte ncs活化，活化后的水溶性cdte ncs分散pb中，得水溶性cdte ncs分散液；（3）向步骤（2）得到的水溶性cdte ncs分散液中加入progrp标记二抗水溶液（progrp-ab2），恒温孵育，使二抗与水溶性cdte ncs表面的羧酸基团反应，加入牛血清蛋白（bsa）封闭，除去未连接的量子点和副产物，得到ab2|cdte ncs；（4）将胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）水溶液滴加到步骤（1）的一抗标记电极表面，室温孵育，得到电极au-mpa|ab1《ag，然后通过抗原-抗体相互作用将ab2|cdte ncs枝接并固定到工作电极表面，得到免共反应剂型ecl传感器。
12.根据本发明优选的，步骤（1）中，工作电极为清洁活化后的au电极，清洁活化具体为：将au电极用氧化铝抛光处理，然后用超纯水清洗，氮气吹干，置于10 mmol/l的巯基丙酸水溶液中浸泡过夜，通过au-s键将mpa键合到电极表面得到au-mpa，向修饰电极au-mpa表面滴加10 μl edc和nhs的混合溶液，活化30 min，然后用10 mmol/l ph =7.4的pb清洗电极，除去未反应的edc以及nhs。
13.根据本发明优选的，edc和nhs的混合溶液中，edc浓度为10 mg/ml，nhs浓度为10 mg/ml。edc和nhs的混合溶液按本领域现有技术进行。
14.根据本发明优选的，步骤（1）中，progrp标记一抗水溶液的浓度为5-15μg/ml，最为优选的，progrp标记一抗水溶液的浓度为10 μg/ml，孵育为室温下孵育2-4 h。
15.根据本发明优选的，步骤（2）中，所述活化具体为：纯化后的水溶性cdte ncs溶解于1 ml含有edc和nhs的磷酸盐缓冲溶液（pb）中，活化30 min，离心纯化。
16.进一步优选的，含有edc和nhs的磷酸盐缓冲溶液（pb）中edc的浓度为10 mg/ml，nhs的浓度为10 mg/ml，磷酸盐缓冲溶液浓度0.1 mol/l，ph= 6。
17.根据本发明优选的，步骤（2）中，水溶性cdte ncs为本领域现有技术。
18.根据本发明优选的，步骤（2）中，水溶性cdte ncs是按如下方法制备得到：1）将0.8 ml 0.2 mol/l的 cdcl
2 溶液加入三口烧瓶中，加水稀释至50 ml；2）在搅拌下，向步骤1）中加入0.2936 g 六偏磷酸钠和34.6 μl巯基丙酸；3）向步骤2）中加入230 μl 6 mol/l的氢氧化钠，调节ph至9.0；4）向步骤3）中加入1.2 ml 0.02 mol/l的亚碲酸钠，加热至100℃持续32 h得到cdte ncs；5）取400 μl步骤4）得到的cdte ncs和600 μl异丙醇，在13300 rpm下洗涤纯化5 min后，重复3次。
19.根据本发明优选的，步骤（2）中，pb为1 ml ph= 7.4，浓度为10 mmol/l的pb缓冲液，水溶性cdte ncs分散液的浓度为1-3μmol/l。
20.根据本发明优选的，步骤（3）中，progrp标记二抗水溶液的浓度5-15μg/ml，最为优选的，progrp标记二抗水溶液的浓度为10 μg/ml，恒温孵育为37℃下孵育3-5 h。
21.根据本发明优选的，步骤（4）中，胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）水溶液的浓度为0.05-5000 pg/ml，室温孵育时间为80-100 min。
22.根据本发明优选的，步骤（4）中，ab2|cdte ncs枝接并固定到工作电极表面为：
将步骤（3）得到的ab2|cdte ncs水溶液滴加到电极au-mpa|ab1《ag上，于37℃下孵育0.5-2 h，基于形成免疫复合物的形式将ab2|cdte ncs枝接并固定到工作电极表面，得到纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器。
23.本发明构建的纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器，最大发光电位位于0.24 v，发光电势窗口窄。
24.根据本发明优选的，为了接枝更充分，progrp标记一抗水溶液（progrp-ab1）、progrp标记二抗水溶液的用量为15-25μl，胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）水溶液的用量为5-15μl。
25.本发明优选的一个实施方案：纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器的构建：a. 将au电极用氧化铝抛光处理，然后用超纯水清洗，氮气吹干，置于10 mmol/l的巯基丙酸水溶液中浸泡过夜，通过au-s键将mpa键合到电极表面得到au-mpa；b. 向a所得的修饰电极表面滴加10 μl edc和nhs的混合溶液，活化30 min，清洗电极，除去未反应的edc以及nhs；c. 将20 μl 10 μg/ml的 progrp一抗（progrp-ab1）水溶液滴加到步骤b所得的活化电极表面，孵育3 h，加入牛血清蛋白（bsa）封闭电极上未反应的活性位点，清洗电极；d. 纯化后的cdte ncs溶解于1 ml含有edc和nhs的磷酸盐缓冲溶液（pb）中，活化30 min，活化后的水溶性cdte ncs分散pb中，得水溶性cdte ncs分散液，100 μl水溶性cdte ncs分散液加入20μl 10μg/ml progrp标记二抗水溶液（progrp-ab2），37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入牛血清蛋白（bsa）封闭30 min，得到ab2|cdte ncs；e. 将10μl胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）水溶液滴加到步骤c处理后的电极表面，室温孵育90 min，清洗电极，再将10 μl步骤d的 ab2|cdte ncs水溶液滴加到电极表面孵育1 h；基于形成免疫复合物的形式将ab2|cdte ncs枝接并固定到工作电极表面，得到共反应剂型的电位分辨型低电位电化学发光免疫传感器。
26.根据本发明优选的，步骤c、d所述的牛血清蛋白的体积分数为1%，用量为20 μl。
27.根据本发明优选的，步骤b、c、e中清洗电极所用冲洗液为10 mm ph=7.4的 pb缓冲液。
28.本发明的目的之二提供一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器。
29.一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器，采用上述构建方法构建得到。
30.所述ecl传感器，其包括ab2|cdte ncs、非特异性结合位点被封闭的progrp-ab1以及分别与ab2|cdte ncs和progrp-ab1通过抗原-抗体间的相互作用连接的progrp；所述ab2|cdte ncs为cdte ncs标记的所述抗原对应的第二抗体。
31.本发明的目的之三，使用上述纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器进行抗原检测的方法。
32.使用上述纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器进行胃泌素释放肽前体重组蛋白检测的方法，步骤如下：构建包含已知浓度胃泌素释放肽前体重组蛋白的ecl免疫传感器，以ph =7-9 pb作为缓冲溶液，在三电极体系中，使用ecl信号检测装置采集ecl信号，建立ecl最大发射强
度与胃泌素释放肽前体重组蛋白浓度的线性关系曲线，然后构建未知浓度胃泌素释放肽前体重组蛋白的ecl免疫传感器，采用上述方法采集ecl信号，根据线性关系曲线获得待测胃泌素释放肽前体重组蛋白的浓度。
33.根据本发明优选的，上述三电极体系中，以构建的纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极；扫描电压范围为0 ~ 1.6v，扫描圈数1 ~ 3圈，扫描速度为40 ~ 60 mv/s。
34.具体的，使用上述纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器进行胃泌素释放肽前体重组蛋白检测的方法，步骤如下：i：配制不同标准浓度的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液，利用不同标准浓度的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液按上述构建方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在pb缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的cdte ncs产生ecl辐射；ii：依据电化学发光强度-电位（时间）曲线图上最大发光电位处的光强信号与胃泌素释放肽前体重组蛋白标准溶液浓度之间的关系，绘制标准工作曲线；iii：利用待测目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液按上述构建方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在pb缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的cdte ncs产生ecl辐射，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步骤(ii)所得工作曲线，得到待测样品溶液中的胃泌素释放肽前体重组蛋白浓度。
35.根据本发明优选的，pb缓冲溶液为0.1 mol/l，ph=7-9的pb缓冲溶液，最为优选的，pb缓冲溶液为0.1 mol/l，ph=9的pb缓冲溶液。
36.本发明构建的ecl免疫传感器以及pb缓冲溶液、pb缓冲溶液的浓度、ph，是产生发光电位为0.24 v且发光电势窗口窄的关键要素，条件缺一不可，替换、增加或去除任何一个条件，均得不到在0.24 v处的强电化学发光信号。
37.一种低电位电化学发光免疫分析检测胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）的方法，其特征在于，采用上述纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器进行。
38.本发明的免疫传感器及检测方法同样适用于甲胎蛋白抗原（afp）、糖类抗原（ca125）或前列腺特异性抗原（psa），但不如对胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp）的特异性好。
39.本发明采用双稳定剂包被的cdte ncs为ecl标记物；cdte ncs表面的羧基可在被edc和nhs活化后枝接第二抗体表面的氨基，实现第二抗体的标记。
40.本发明采用在共价键合方式将巯基丙酸枝接到工作电极金电极表面，并通过采用edc和nhs进一步活化金电极表面巯基丙酸的羧基的方式完成枝接第一抗体。
41.本发明的有益效果：1、本发明成功制备了一种纳米粒子直接发光且发光电位低的ecl免疫传感器，突破了已报道的以纳米量子点为标记物的免共反应剂型ecl免疫传感器发光电位过高的局限性，同时避免了过量共反应剂对测试溶液的影响。
42.2、本发明传感器的电化学发光电势窗口较窄，与现有电位分辨型ecl多组分免疫
分析技术结合后，能够进一步丰富ecl多组分免疫传感的研究内容和检出指标信息，为发展高通量的电位分辨型多组分ecl免疫分析提供技术支持。
43.3、本发明的ecl免疫传感器基于抗原与抗体之间的相互作用构建，灵敏度高、特异性好、检测限低、线性范围宽、制备和操作简单；能够灵敏检测胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp），线性范围0.1 pg/ml ~ 5000 pg/ml，检测限为0.05 pg/ml。
附图说明
44.图1为cdte ncs在0.1 mol/l，ph=9的pb中的电化学发光强度-电位（时间）曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
45.图2为实施例1中所制的ab2|cdte ncs在0.1 mol/l，ph=9的pb中的电化学发光强度-电位（时间）曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
46.图3不同处理在含5mmol/l k3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1 mol/l kcl中的循环伏安图；电势窗口为-0.2 ~ 0.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电流；曲线a为裸金电极，b为au-mpa|ab1，c为au-mpa|ab1《ag，d为胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为1 pg/ml时所制的au|mpa-ab1《ag》ab2|cdte ncs；图4为不同处理在0.1 mol/l，ph=9的中的电化学发光强度-电位（时间）曲线图；电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度；曲线a为裸金电极，b为au-mpa|ab1，c为au-mpa|ab1《ag，d为胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为1 pg/ml时所制的au|mpa-ab1《ag》ab2|cdte ncs；图5为不同胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度构建的免共反应剂型低电位电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度，曲线a为0.05 pg/ml，b为0.1 pg/ml，c为1 pg/ml，d为10 pg/ml，e为100 pg/ml，f为500 pg/ml，g为2000 pg/ml，h为5000 pg/ml。
47.图6为实施例4中不同胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag），以cdte ncs为标记物的免疫传感器的工作曲线；横坐标为待测物抗原浓度，纵坐标为电化学发光强度。
48.图7为实验例1电化学发光免疫传感器对抗原的特异性电化学发光响应图；横坐标为待测物种类，纵坐标为电化学发光强度。
49.图8为传感器在0.1 mol/l、不同ph的pb缓冲溶液的电化学发光响应图；图中的a
×
10代表，图中所绘制的a曲线是在实验测得的基础上乘以10后得到的，以便更好的区分，如果采用实验所得原曲线，由于其光强较弱，无法直观判断a曲线的发光电位、光强信息；同理，b
×
10代表，图中所绘制的b曲线是在实验测得的基础上乘以10后得到的；f
×
10代表，图中所绘制的f曲线是在实验测得的基础上乘以10后得到的；g
×
10代表，图中所绘制的g曲线是在实验测得的基础上乘以10后得到；图9为对比例1中所制的胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为0时，以cdte ncs为标记物的免共反应剂型低电位电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线；横坐标为电位，纵坐标为电化学发光强度。
具体实施方式
50.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
51.同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
52.cdte ncs的制备：（1）将0.8 ml 0.2 mol/l的 cdcl
2 溶液加入三口烧瓶中，加水稀释至50 ml；（2）在搅拌下，向步骤（1）中加入0.2936 g 六偏磷酸钠和34.6 μl巯基丙酸；（3）向步骤（2）中加入230 μl 6 mol/l的氢氧化钠，调节ph至9.0；（4）向步骤（3）中加入1.2 ml 0.02 mol/l的亚碲酸钠，加热至100℃持续32 h得到cdte ncs；（5）取400 μl步骤（4）得到的 cdte ncs和600 μl异丙醇，在13300 rpm下洗涤纯化5 min后，重复3次。
53.将最终产物溶于100 μl去离子水，得到2 μmol/l cdte ncs的单分散溶液。
54.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，100 μl浓度为2 μmol/l的 cdte ncs单分散液为发光试剂，4 ml浓度为0.1 mol/l、 ph=9.0 的pb为缓冲溶液，组成电化学发光体系，采用三电极体系与循环伏安扫描方法驱动该体系电化学发光辐射；采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图1所示，如图1可知，cdte ncs在0.1 mol/l、 ph=9.0 的pb缓冲液中可在0.21 v产生氧化-还原型电化学发光。
55.实施例1ab2|cdte ncs的制备：纯化后的cdte ncs溶解于1 ml含有edc和nhs的磷酸盐缓冲溶液（pb）中，活化30 min，离心纯化，活化后的水溶性cdte ncs分散于1 ml ph= 7.4，浓度为10 mmol/l的pb缓冲液，得水溶性cdte ncs分散液，取100 μl浓度为2 μmol/l的水溶性cdte ncs分散液加入20 μl 10 μg/ml progrp标记二抗水溶液（progrp-ab2），37 ℃下恒温孵育 3-5 h，加入牛血清蛋白（bsa）封闭30 min，得到ab2|cdte ncsab2|cdte ncs分散于1 ml 10 m mol/l ph 7.4 pb中，4 ℃保存备用。
56.以金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，4 ml浓度为0.1 mol/l、 ph=9.0 的pb为缓冲溶液，100 μl浓度为2 μmol/l的 ab2|cdte ncs分散液作为发光试剂。
57.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图2所示，如图2可知，ab2|cdte ncs在0.1 m ph 9 pb缓冲液中可在0.24 v产生氧化-还原型电化学发光。虽然电化学发光强度低于cdte ncs，归因于蛋白抗体的位阻效应，发光电位会稍往高偏移，变至0.24 v，同时也证明了二抗已被成功枝接到cdte ncs上。
58.实施例2纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器的构建：
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(a)将au电极用氧化铝抛光处理后，用超纯水清洗，氮气吹干得到au电极；(b)将au电极放置于10mmol/l巯基丙酸中浸泡过夜，通过au-s键将mpa键合到电极表面得到au-mpa；向修饰电极au-mpa表面滴加10μledc和nhs的混合溶液，混合溶液中，edc浓度为10mg/ml，nhs浓度为10mg/ml，活化30min，用10mmol/lph=7.4pb清洗电极，除去未反应的edc以及nhs；将20μl10μg/ml的progrp一抗（progrp-ab1）水溶液滴加到步骤b所得的活化电极表面，孵育3h，加入牛血清蛋白（bsa）封闭电极上未反应的活性位点，用10mmol/lph7.4pb清洗电极得到au-mpa|ab1； (c)将10μl浓度为1pg/ml的progrp-ag水溶液滴加到au-mpa|ab1表面，室温孵育90min，用10mmol/lph=7.4pb清洗电极，得到au-mpa|ab1《ag；(d)将10μl实施例1制得的浓度为10μg/mlab2|cdtencs水溶液滴加到au-mpa|ab1《ag表面孵育1h，基于形成免疫复合物的形式将ab2|cdtencs枝接并固定到工作电极表面，即可得到免共反应剂型的低电位电化学发光免疫传感器，记作：au-mpa|ab1《ag》ab2|cdtencs。
59.实验例1以实施例2步骤a得到的金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以含5mmol/lk3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1mol/lkcl溶液为电解液。
60.采用循环伏安法驱动，电势窗口为-0.2~0.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为-0.2v，初扫向正）进行扫描，裸金电极在铁氰化钾中的循环伏安曲线如图3中的曲线a所示，由图3中的曲线a可知，金电极显示出一对fe(cn)
63-/fe(cn)
64-的可逆的氧化还原峰，峰电位差为70mv；证明现有氧化还原性需采用三价铁、二价铁离子对作为辅助，否则没有对应的氧化还原峰。
61.以实施例2步骤b得到的au-mpa|ab1作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以含5mmol/lk3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1mol/lkcl溶液为电解液。
62.采用循环伏安法驱动，电势窗口为-0.2~0.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为-0.2v，初扫向正）进行扫描。au-mpa|ab1在铁氰化钾中的循环伏安曲线如图3中的曲线b所示，由图3中的曲线b可知，氧化还原峰的峰电位相对变大，这是由于连接mpa|ab1后的位阻效应引起的。
63.以实施例2步骤c得到的au-mpa|ab1《ag作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以含5mmol/lk3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1mol/lkcl溶液为电解液。
64.采用循环伏安法驱动，电势窗口为-0.2~0.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为-0.2v，初扫向正，进行扫描。au-mpa|ab1《ag在铁氰化钾中的循环伏安曲线如图3中的曲线c所示，由图3中的曲线c可知，免疫复合物的形成导致了氧化还原峰的峰电位相对变大。
65.以实施例2步骤d得到的au-mpa|ab1《ag》ab2|cdtencs作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，以含5mmol/lk3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1mol/lkcl溶液为电解液。
66.采用循环伏安法驱动，电势窗口为-0.2~0.6伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为-0.2v，初扫向正，进行扫描。au-mpa|ab1《ag》ab2|cdtencs在铁氰化钾中的循环伏安曲线如图3中的曲线d所示。由图3中的曲线d可知，免疫复合物的形成导致了氧化还原峰的
峰电位相对变大。
67.实验例2同实验例1，不同的是，将电解液由5mmol/l k3fe(cn)6/k4fe(cn)6的0.1 mol/l kcl溶液替换为0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液。
68.以实施例2步骤a得到的的金电极作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、ph=9.0的pb作为缓冲溶液。
69.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图4中的曲线a所示，如图4中的曲线a可知，裸金电极在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中不产生氧化-还原电化学发光信号。
70.以实施例2步骤b得到的au-mpa|ab1作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、ph=9.0的pb作为缓冲溶液。
71.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图4中的曲线b所示，如图4中的曲线b可知，au-mpa|ab1在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中不产生氧化-还原电化学发光信号。
72.以实施例2步骤c得到的au-mpa|ab1《ag作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、 ph=9.0 的pb作为缓冲溶液。
73.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图4中的曲线c所示，如图4中的曲线c可知，au-mpa|ab1《ag在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中不产生氧化-还原电化学发光信号。
74.以实施例2步骤d得到的au-mpa|ab1《ag》ab2|cdte ncs作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、ph=9.0的pb作为缓冲溶液。
75.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图4中的曲线d所示，如图4中的曲线d可知，au-mpa|ab1《ag》ab2|cdte ncs在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可在0.24 v产生氧化-还原型电化学发光，证明了免疫传感器的成功构建。
76.综上实验例1、实验例2，说明本发明在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中成功构建了最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器，且传感器的信号基于cdte ncs探针信号。
77.实施例3使用纳米粒子直接发光且最大发光电位为0.24 v的ecl免疫传感器进行胃泌素释放肽前体重组蛋白检测的方法，步骤如下：i：配制不同标准浓度的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液，利用不同标准浓度的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液按实施例2的构建方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲溶液中，采用循环伏安法驱动工作电极表面的cdte ncs产生ecl辐射；ii：依据电化学发光强度-电位（时间）曲线图上最大发光电位处的光强信号与胃泌素释放肽前体重组蛋白标准溶液浓度之间的关系，绘制标准工作曲线；
iii：利用待测目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液按上述构建方法制备传感器电极；以所得传感器电极作为工作电极、铂丝电极为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在0.1 mol/l、ph=9.0的pb，采用循环伏安法驱动工作电极表面的cdte ncs产生ecl辐射，得到目标电化学发光曲线；根据所得电化学发光曲线上最高光强和步骤(ii)所得工作曲线，得到待测样品溶液中的胃泌素释放肽前体重组蛋白浓度。
78.实施例4同实施例3，不同的是，不同标准浓度的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白水溶液分别为0.05 pg/ml，0.1 pg/ml，1 pg/ml，10 pg/ml，100 pg/ml，500 pg/ml，2000 pg/ml，5000 pg/ml，得到不同浓度胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原（progrp-ag）的免共反应剂型的低电位电化学发光免疫传感器；以上述不同免共反应剂型的低电位电化学发光免疫传感器作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，在0.1 mol/l、ph=9.0的pb作为缓冲溶液。
79.采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的不同浓度胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5所示；胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为0.05 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线a所示，如图5中的曲线a可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
80.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为0.1 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线b所示，如图5中的曲线b可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
81.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为1 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线c所示，如图5中的曲线c可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
82.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为10 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线d所示，如图5中的曲线d可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
83.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为100 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线e所示，如图5中的曲线e可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
84.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为500 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线f所示，如图5中的曲线f可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低
电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
85.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为2000 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线g所示，如图5中的曲线g可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
86.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为5000 pg/ml时，构建的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图5中的曲线h所示，如图5中的曲线h可知，该电化学发光免疫传感器在0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液中可产生免共反应剂型的低电位电化学发光信号，最大发光电位位于0.24 v。
87.依据电化学发光强度-（电位）时间曲线最大发光电位处光强与胃泌素释放肽前体重组蛋白标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；电化学发光免疫传感器对胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原的工作曲线如图6所示，由图可知，随着胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原浓度的增大，电化学发光信号逐渐增强，电化学发光强度与胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原浓度成正比，表明构建的电化学发光免疫传感器灵敏度很高，检测范围宽，线性范围0.1 pg/ml ~ 5000 pg/ml，检测限为0.05 pg/ml；具有很大的实际应用潜力。
88.实验例3同实施例2所述的构建方法，不同之处在于：将胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）替换为空白、甲胎蛋白抗原、前列腺特异性抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白抗原、前列腺特异性抗原、癌胚抗原、胃泌素释放肽前体重组蛋白的混合物。
89.不同胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原的电化学发光免疫传感器的电化学发光响应如图7所示。由图7所示，本发明的传感器为对胃泌素释放肽前体重组蛋白选择性良好，其他抗原蛋白不对该发明的目标胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原传感检测产生干扰，表明电化学发光免疫传感器对胃泌素释放肽前体重组蛋白的特异性高。
90.实验例4同实验例2，不同之处在于：将0.1 mol/l、 ph=9.0 的pb缓冲液的ph分别替换为5、6、7、8、10、11；以实施例2步骤d得到的au-mpa|ab1《ag》ab2|cdte ncs作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、不同ph的pb作为缓冲溶液；传感器在0.1 mol/l、不同ph的pb缓冲溶液的电化学发光响应如图8所示。由图8所示，本发明的传感器在0.1 mol/l，ph=7-9的pb缓冲溶液中电化学发光信号强，尤其是ph=9的pb缓冲溶液中，最大发光电位位于0.24 v，并且发光信号强。
91.对比例1同实施例2电化学发光免疫传感器的构建，不同之处在于：将滴加在au-mpa|ab1表面的胃泌素释放肽前体重组蛋白抗原去除，制备得到电化学发光免疫传感器au-mpa|ab1《ag》ab2|cdte ncs。
92.以au-mpa|ab1《ag》ab2作为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，0.1 mol/l、ph=9.0的pb作为缓冲溶液。采用循环伏安法驱动，电势窗口为0 ~ 1.6 伏，扫描速度为50 毫伏/秒，起始电位为0 v，初扫向正，得到的不同抗原浓度下的电化学发光强度-（电
位）时间曲线。
93.胃泌素释放肽前体重组蛋白（progrp-ag）浓度为0时，以cdte ncs为标记物的电化学发光免疫传感器的电化学发光强度-（电位）时间曲线如图9所示，如图9可知，该电化学发光免疫传感器在，0.1 mol/l、ph=9.0的pb缓冲液不产生任何电化学发光信号。