一种抗肝素干扰的HBDH检测试剂盒的制作方法

一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒。


背景技术：

2.hbdh全称为α-羟丁酸脱氢酶，与ld、ast、ck和ckmb共同组成心肌酶谱，广泛存在于哺乳动物体内的心肌红细胞、白细胞及肾脏中，其中在心肌中含量最多，临床上hbdh测值升高常见于急性心肌梗塞、肌肉损害、红细胞破损、急性肝炎、白血病及恶性肿瘤等，hbdh实际上代表的是 ld1、ld2的活性当诊断心肌疾病时比ld更具有特异性，收集大部分的心肌炎病例发现其阳性明显比其他酶高当别的心肌酶指标正常时hbdh测值仍然会随着心肌细胞的病理改变而上升所以当患者出现体征和心电图不明显的疑似症状时，再或者对那些就诊时间晚、治疗时间长的心肌炎患者来说，hbdh检测指标就变得十分重要了。
3.用于检测hbdh的活性的方法主要有比色法和连续监测法，其中最常用的方法是连续检测法，该方法通过血清中的α-羟丁酸脱氢酶（hbdh）催化试剂中的α
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酮丁酸生成α-羟丁酸，同时nadh氧化成nad ，在340nm波长下测定其吸光率的下降，样本中α-羟丁酸脱氢酶含量与吸光率减少速率成正比。
4.α-羟基丁酸脱氢酶（hbdh）测定试剂盒现已成为大多数体外诊断试剂厂家注册的常规项目，但是大多数试剂盒却存在以下不足：当使用肝素管作为采血管时，所离心分离的血浆比相同分离条件下的血清管测值结果偏高，鉴于此，研发一种准确度高、稳定性好、抗干扰能力强的试剂盒成为许多ivd厂家的产品质量追求目标。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，使肝素采血管所测定结果与血清管相比，结果不再出现异常偏高值，与血清管测值结果的偏差和相关性均在合理范围内。
6.本发明的具体技术方案如下：一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：缓冲液1 100～150mmol/l、α-酮丁酸10～15mmol/l、可溶性镁盐0.5～1 g/l、防腐剂1 1～1.5 g/l，所述试剂r2包括如下组分：缓冲液2. 100～150mmol/l、hedp 2～3g/l、乙二醇10～15ml/l、甘露醇5～8g/l、无水葡萄糖5～10g/l、nadh 1.1～1.5mmol/l、防腐剂2. 1～1.5g/l。
7.优选的，所述缓冲液1为ph值5～6.5的tris-hcl缓冲液。
8.优选的，所述防腐剂1和防腐剂2均为叠氮钠。
9.优选的，所述缓冲液2为ph值8～10的tapso缓冲液。
10.优选的，所述可溶性镁盐选自六水合氯化镁、七水硫酸镁、四水乙酸镁中的一种。
11.优选的，彼此独立的试剂r1和试剂r2的体积比是2:1。
12.本发明的相对于现有技术具有的技术效果：1. 在许多临床生化项目的检测中，肝素是一个常见的假阳性干扰因素，因为肝素分子是由n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸交替组成的硫酸脂黏多糖，携带大量的负电荷，会与携带正电荷的肝素抗凝管中分离血浆的纤维蛋白原结合成大分子造成吸光度的上升，而带正电荷的镁离子与同样带正电荷的纤维蛋白原会产生竞争性拮抗作用，相对于纤维蛋白原镁离子会更容易附着在肝素分子的表面，避免了对吸光度造成影响的大分子的形成，但是这种结合不够稳定，加入hedp后，由于hedp对镁离子具有很强的特异性络合作用，可以定向捕捉附着了镁离子的肝素分子，与肝素分子一起形成稳定的络合物，同时这种络合物由于分子结构小不会对吸光度和生化反应造成影响，使hbdh测值恢复正常。
13.2. 创造性地选择hedp与镁离子作为络合配位对象，通过大量的实验发现，在所有的络合剂与金属离子组成的络合配位对象中，既特异性好又稳定性强同时又不影响试剂性能的，hedp与镁离子是最优的选择。
14.3. 不同于其他厂家的试剂，将hedp络合剂放在试剂r2中，让镁离子先与肝素分子结合，使镁离子全面地附着在肝素分子上，实现充分的定位，然后试剂r2中的hedp络合剂再对其进行捕捉，避免了hedp络合剂过早加入导致的肝素分子定位不彻底，影响捕捉效果。
具体实施方式
15.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：缓冲液1 100～150mmol/l、α-酮丁酸10～15mmol/l、可溶性镁盐0.5～1 g/l、防腐剂1 1～1.5 g/l，所述试剂r2包括如下组分：缓冲液2. 100～150mmol/l、hedp 2～3g/l、乙二醇10～15ml/l、甘露醇5～8g/l、无水葡萄糖5～10g/l、nadh 1.1～1.5mmol/l、防腐剂2. 1～1.5g/l。
17.作为本发明的一个具体实施例，所述缓冲液1为ph为5～6.5的tris-hcl缓冲液。
18.作为本发明的一个具体实施例，所述防腐剂1和防腐剂2均为叠氮钠。
19.作为本发明的一个具体实施例，所述缓冲液2为ph为8～10的tapso缓冲液。
20.作为本发明的一个具体实施例，所述可溶性镁盐选自六水合氯化镁、七水硫酸镁、四水乙酸镁中的一种。
21.作为本发明的一个具体实施例，彼此独立的试剂r1和试剂r2的体积可以根据进行任意配比，优选的彼此独立的试剂r1和试剂r2的体积比是2:1。
22.试剂r1和试剂r2的制备方法采用本领域内的常规方法，在此不再详述。
23.实施例1一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：ph为6 tris-hcl缓冲液100mmol/l、α-酮丁酸10mmol/l、六水合氯化镁0.5g/l、叠氮钠1g/l，所述试剂r2包括如下组分：ph为9 tapso缓冲液.100mmol/l、hedp 2g/l、乙二醇
10ml/l、甘露醇5g/l、无水葡萄糖5g/l、nadh 1.1mmol/l、叠氮钠1g/l。
24.实施例2一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：ph为5 tris-hcl缓冲液125mmol/l、α-酮丁酸15mmol/l、七水硫酸镁0.7g/l、叠氮钠1.5g/l，所述试剂r2包括如下组分：ph为8 tapso缓冲液.125mmol/l、hedp 3g/l、乙二醇13ml/l、甘露醇8g/l、无水葡萄糖7g/l、nadh 1.1mmol/l、叠氮钠1.5g/l。
25.实施例3一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：ph为6.5 tris-hcl缓冲液150mmol/l、α-酮丁酸13mmol/l、四水乙酸镁1g/l、叠氮钠1.3g/l，所述试剂r2包括如下组分：ph为10 tapso缓冲液.150mmol/l、hedp 2.5g/l、乙二醇15ml/l、甘露醇6g/l、无水葡萄糖10g/l、nadh 1.1mmol/l、叠氮钠1.2g/l。
26.对比例1一种抗肝素干扰的hbdh检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分：ph为6 tris-hcl缓冲液100mmol/l、α-酮丁酸10mmol/l、六水合氯化镁0.5g/l、叠氮钠1g/l，所述试剂r2包括如下组分：ph为9 tapso缓冲液.100mmol/l、edta二钠 2g/l、乙二醇10ml/l、甘露醇5g/l、无水葡萄糖5g/l、nadh 1.1mmol/l、叠氮钠1g/l。
27.采用本发明实施例1的试剂盒检测样品中的α-羟丁酸脱氢酶的步骤如下：在检测过程中以全自动生化分析仪日立7100为例，速率法，主波长340nm（或附近），副波长410nm（或附近），比色杯光径为1.0cm。
28.表1 实施例1试剂检测方法计算：hbdh活力（u/l）=（
△
a/min测定
÷△
a/min标准）
×
c标准为了证明本发明的试剂盒与市售的hbdh假阳性试剂盒出假阳性值的概率，使用国家食品药品监督管理局认可的迈瑞公司的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒进行对照检测。
29.使用的试剂分别为：试剂
①
：市售的hbdh假阳性试剂盒；试剂
②
：迈瑞公司的α-羟丁酸脱氢酶测定试剂盒；试剂
③
：试剂r1中加入实施例1中相同浓度的hedp，试剂r2不加hedp，其他组分与本实施例1相同；试剂
④
：与实施例1中各组分浓度都相同的试剂盒；试剂
⑤
：与实施例2中各组分浓度都相同的试剂盒；试剂
⑥
：与实施例3中各组分浓度都相同的试剂盒；试剂
⑦
：与对比例1中各组分浓度都相同的试剂盒，七种试剂的参考范围均是74～
199u/l。
30.七组试剂同时检测40个采用市售的肝素钠真空采血管采集来的临床血清样本，检测结果如表2和表3所示。
31.表2：表3：序号试剂
④
试剂
⑤
试剂
⑥
试剂
⑦
序号试剂
④
试剂
⑤
试剂
⑥
试剂
⑦
115215015115721112113112120213112913013822138136137144316016316217223107108108115
41301271281372420821021021751261291271372515915916016961301311301342619119119219771231251241362719419319320681551541541602819619719720591821811811912914013914015410119120119129301691681691831112712612413031163164164176121331321321413216316516418213130132131143332642642652741413013112914134198197196196151581571571623514214314315516110111111117361701711721761714314314416237170169168176181141141151203816616416517519145146144154392402412412542014114314316140150150149159对表2和表3七组试剂所测结果进行统计汇总，得到表4数据。
32.表4：通过对比检测结果发现，本发明提供的试剂与迈瑞的α-羟丁酸脱氢酶试剂相比相关性好，检测结果基本一致，市售的hbdh假阳性试剂盒在测试加了肝素的血浆时，检测结果假阳性率很高，同时通过对比试剂
③
的测试结果，就会发现，如果采用市场上普遍使用的技术，将络合剂与络合对象想当然的放在r1中，虽然有一定的抗干扰效果，但是由于hedp过早地加入到生化反应中，络合对象难以对肝素分子实现充分的定位，导致肝素分子难以被全部捕捉，所以才出现测值介于市售的假阳性试剂与实施例1试剂之间的现象；同时也证明了hedp对镁离子具有很强的特异性络合作用，可以定向捕捉附着了镁离子的肝素分子，与肝素分子一起形成稳定的络合物，同时这种络合反应又不影响试剂性能，使hbdh测值恢复正常。
33.以上所述的具体实施方式，进一步详细说明了本发明的内容和技术效果，本行业的专业人士应该了解，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，在不脱离本发明的精神和范围的前提下所做的任何变化和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。