芸香柚皮苷在制备SortaseA分选酶和PLY溶血素抑制剂中的应用

芸香柚皮苷在制备sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明公开了芸香柚皮苷在制备肺炎链球菌溶血素（ply）和srta分选酶抑制剂中的应用，通过荧光共振能量转移实验、ldh检测试验、侵袭试验和生物被膜试验等进一步验证了芸香柚皮苷在缓解肺炎链球菌诱导的感染中的医用用途，属于医学制药技术领域。


背景技术：

2.芸香柚皮苷（narirutin）是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科柑橘属植物油及其栽培变种的果实中。从化学结构上讲，芸香柚皮苷属于一种黄酮类化合物，目前大多数黄酮类化合物都具有抗炎、抗过敏、抗氧化和抗癌特性。药理研究表明，芸香柚皮苷具有抗癌、解痉和利胆的药理作用。但尚未有用于治疗肺炎链球菌肺炎的相关报道。
3.肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)是一种重要的人兽共患致病菌，是引起肺炎、脑膜炎等侵袭性疾病的病原菌，每年能够引起将近200万人死亡。肺炎链球菌能产生和分泌多种促进机体致病的毒力蛋白，肺炎链球菌溶血素(ply)是肺炎链球菌与宿主相互作用的主要毒力因子。分选酶a（srta）在肺炎链球菌致病过程中也发挥着重要的作用。因此将ply和srta作为抗肺炎链球菌细菌感染的药物研发的潜在靶标是一条可行的策略。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的芸香柚皮苷在制备sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂中的医用用途。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：芸香柚皮苷在制备sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂中的医用用途。
6.优选的，所述的芸香柚皮苷为以芸香柚皮苷为活性成分制成的药学上可接受的任何一种剂型。
7.优选的，所述的应用为芸香柚皮苷在制备用于治疗肺炎链球菌感染性疾病的药物中的应用。
8.优选的，所述的肺炎链球菌感染是指以sortasea分选酶和ply溶血素为主要毒力因子之一的肺炎链球菌引发的感染。
9.本发明的有益效果为：本发明发现了芸香柚皮苷抑制肺炎链球菌生物被膜的形成。
10.本发明发现了芸香柚皮苷能够有效保护a549细胞免受肺炎链球菌溶血素（ply）的损害。
11.本发明发现了芸香柚皮苷抑制肺炎链球菌对a549细胞的侵袭。
12.本发明发现了芸香柚皮苷对肺炎链球菌引起的小鼠感染具有较好的治疗作用。
13.本发明与用抗生素治疗相比较，使用芸香柚皮苷治疗具有无耐药性，治愈率高的优点
通过肽酶活性抑制试验、细菌侵袭抑制试验、感染细胞保护试验以及小鼠感染实验治疗学试验，证明芸香柚皮苷可以同时抑制肺炎链球菌溶血素ply的成孔活性和分选酶srta的肽酶活性，抑制肺炎链球菌对细胞的侵袭和感染，并对肺炎链球菌引起的小鼠感染有较好的治疗作用。
附图说明
14.图1为芸香柚皮苷对srta酶活性的抑制作用，与对照组相比，**表示p《0.01；图2 为芸香柚皮苷对肺炎链球菌生物被膜形成的抑制作用，与对照组相比，*表示p《0.05，**表示p＜0.01；图3 为芸香柚皮苷对肺炎链球菌溶血素ply损伤a549细胞的保护作用，与对照组相比**表示p＜0.01；图4 为芸香柚皮苷对肺炎链球菌侵袭a549细胞的抑制作用，与对照组相比**表示p＜0.01；图5 为芸香柚皮苷对肺炎链球菌感染模型的治疗率分析，与对照组相比**表示p＜0.01。
15.具体实施方式
16.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
17.实施例1芸香柚皮苷作为肺炎链球菌sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂用于医药学上可接受的任何载体。
18.实施例2芸香柚皮苷作为肺炎链球菌sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。
19.实施例3芸香柚皮苷作为肺炎链球菌sortasea分选酶和ply溶血素抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，尤其是以sortasea分选酶和ply溶血素为主要毒力因子的细菌引起的感染。
20.试验例1荧光共振能量转移实验肺炎链球菌按1:100的比例扩菌，静置培养过夜，第二天收菌液上清用于做荧光共振能量转移试验，含有肺炎链球菌分选酶srta的上清和不同浓度的芸香柚皮苷混合加入黑底96孔板中，放置于37℃培养箱中孵育30 min，取出后每孔中加入10 ul的荧光肽底物，最后一排加10 ul的buffer，混合均匀在37℃培养箱中孵育1 h。使用酶标仪在激发波长350 nm，发射波长为520 nm处检测荧光强度。肽酶活性越高，检测到的荧光强度也越强。
21.表1. 芸香柚皮苷抑制肺炎链球菌分选酶srta的肽酶活性
芸香柚皮苷（μg/ml）srta蛋白肽酶活性抑制率（%）086.33477.33874.003243.33结论：芸香柚皮苷显著抑制了肺炎链球菌分选酶的活性。
22.试验例2芸香柚皮苷对肺炎链球菌生物被膜的抑制试验过夜培养的肺炎链球菌（d39）调od600nm=0.1，每孔加入10 μl od600nm =0.1的菌液与不同浓度的芸香柚皮苷在24孔板中，静置在37℃培养箱中，培养24 h，弃掉培养基，用0.1%的结晶紫染色1 h，最后用33%的冰醋酸溶解，在酶标仪570 nm下检测吸收波长。值越高代表形成的生物被膜越多。
23.表2. 芸香柚皮苷对肺炎链球菌生物被膜的抑制作用芸香柚皮苷（μg/ml）570nm波长下光吸收值02.58222.19442.07981.687161.628结论：芸香柚皮苷显著抑制了肺炎链球菌生物被膜的形成。
24.试验例3芸香柚皮苷对肺炎链球菌诱导的a549细胞损伤的保护作用试验a549细胞铺板于96孔板中（每孔3
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104个），使用高糖dmem培养基在37℃，5% co2的条件下培养12h后，孔中加入肺炎链球菌溶血素ply（1μm）同时加入不同梯度的化合物芸香柚皮苷，继续培养7h，离心（1000 rpm，10 min）取上清，检测上清中乳酸脱氢酶（ldh）的活性以检测细胞的存活率。
25.表3. 芸香柚皮苷抑制肺炎链球菌溶血素对a549细胞介导的细胞毒性作用芸香柚皮苷（μg/ml）存活率（%）042.33863.131676.47结论：芸香柚皮苷显著抑制肺炎链球菌溶血素ply对a549细胞介导的细胞毒性作用，且这一作用呈现浓度依赖性。
26.试验例4芸香柚皮苷抑制肺炎链球菌对a549细胞的侵袭试验肺癌人类肺泡基底上皮细胞a549接种至24孔板中，每孔2
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105个细胞，37℃，5% co2条件下培养12 h。肺炎链球菌d39过夜培养。向孔中加入肺炎链球菌d39感染6 h，使moi=30:1（细菌数：细胞数=30:1）。用无菌pbs轻柔洗去未与细胞黏附的细菌后，用去离子水将孔中的细胞裂解。取上清液涂布在固体培养基（tsb）上计数。
27.表4. 芸香柚皮苷对肺炎链球菌对a549细胞侵袭的抑制作用结论：不同浓度的芸香柚皮苷能够使肺炎链球菌对a549细胞的侵袭率显著下降，结果（表4）表明芸香柚皮苷显著抑制肺炎链球菌对细胞的侵袭。
28.试验例5小鼠肺炎链球菌感染的实验治疗学试验小鼠肺炎链球菌感染模型的建立体重在18-22g的雌性c57小鼠，经左侧鼻腔吸入50μl（1.5
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108cfu/ml）肺炎链球菌悬液，建立小鼠肺炎链球菌肺炎感染模型。
29.治疗率试验小鼠吸入肺炎链球菌后经由皮下给予40 mg/kg的芸香柚皮苷（溶解于dmso中），每8h给药一次。不给药对照组给与50μl的dmso，每组6只小鼠。按给药方案给药后，48 h后取肺组织研磨做菌落计数。结果表明（表5），经芸香柚皮苷给药治疗后，能够显著降低肺部组织小鼠肺炎链球菌菌落定植量。
30.表5. 芸香柚皮苷降低小鼠肺炎链球菌菌落计数值分组菌落计数（log）阳性6.26芸香柚皮苷3.88结论：经过芸香柚皮苷治疗后，显著降低感染小鼠肺部组织的菌落定植数，综合得出芸香柚皮苷的治疗效果显著。