透明质酸产生促进剂的制作方法

1.本发明涉及透明质酸产生促进剂和使用该透明质酸产生促进剂的化妆、美容或非治疗的方法。


背景技术：

2.近年来，与老化有关的研究不断进行。皮肤老化的原因如果从宏观上来看则年龄增长是重要的因素，但除此以外还可举出由干燥、氧化、太阳光(紫外线)等带来的影响作为与皮肤老化有关的直接因素。作为皮肤老化的具体现象，已知以透明质酸为代表的粘多糖类的减少、胶原的交联反应、由紫外线引起的细胞的损伤等。
3.尤其是透明质酸具有水分对细胞间隙的保持、基于在组织内形成胶状的基质的细胞的保持、组织的润滑性和柔软性的保持、对机械损伤等外力的抵抗、和细菌感染的防止等很多功能。例如，皮肤的透明质酸量随着年龄增长而减少，与此相伴，一般认为出现小皱纹、干燥等皮肤老化。因此，作为这样的老化了的皮肤的改善剂，提出了大量混配了透明质酸、胶原的化妆料。然而，这些以往的化妆料仅发挥皮肤表面中的保湿效果，本质上不能够改善老化肌肤。此外，作为皮肤细胞活化剂，提出了混配了各种维生素类、生药类的化妆料，但现状是它们也仍然不能够改善、治疗老化肌肤。
4.进一步，关节液中包含的透明质酸覆盖关节软骨的表面，有益于关节功能的顺利工作。正常人关节液中的透明质酸浓度为约2.3mg/ml，但在慢性类风湿性关节炎的情况下，关节液中的透明质酸浓度降低到约1.2mg/ml，同时关节液的粘度也显著降低(非专利文献1)。此外，已知对于化脓性关节炎、痛风性关节炎等，也与慢性类风湿性关节炎的情况同样，发生透明质酸含量的降低(非专利文献2)。在上述疾病中，为了润滑功能的改善、关节软骨的被覆/保护、疼痛抑制和病关节液的改善或正常化，考虑使关节液中的透明质酸量增加。例如，报导了如果对慢性类风湿性关节炎患者进行透明质酸钠的关节注入疗法则确认到上述改善(非专利文献3)。同样地，在创伤性关节炎、骨关节炎、变形性关节炎中，也通过透明质酸的关节注入疗法而报导了上述改善效果。(非专利文献4)。
5.然而，上述疾病的治疗需要长期，而且需要医师的处方。因此，期望可以在日常生活之中简便地治疗含有透明质酸产生促进剂的皮肤外用剂。
6.此外，已知在灼伤受伤后的治愈过程中，在从坏死组织的下方增生出来的肉芽组织的初期到组织整体被置换为肉芽组织的期间，在肉芽中透明质酸显著增加(非专利文献5)，作为灼伤的初期治疗药，也期待透明质酸产生促进剂。
7.另一方面，作为促进人细胞的透明质酸产生的药剂，已知胰岛素样生长因子-1、上皮生长因子(非专利文献6)和白介素-1(非专利文献7)等细胞因子、或佛波酯(非专利文献8)等，但都不能作为化妆品、入浴用制剂、药品等而简便并且安心地使用。
8.另一方面，报导了通过由镁盐和钙盐构成的皮肤屏障功能恢复促进剂使皮肤屏障功能在极其短时间内恢复，从而防止由皮肤的表皮功能的降低引起的表皮增殖性异常等(专利文献1)。然而，迄今为止还未知镁化合物具有在人细胞中使透明质酸量增加的作用。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.专利文献1：日本特开2000-290135号公报
12.非专利文献
13.非专利文献1：“arthritis rheumatism”，vol.10，p.357(1967)
14.非专利文献2：“結合組成”，金原出版，481页，1984年
15.非专利文献3：“炎症”，日本炎症学会，11卷，16页，1991年
16.非专利文献4：“結合組織
と
疾患”，讲谈社，246页，1980年
17.非专利文献5：“結合組織
と
疾患”，讲谈社，153页，1980年
18.非专利文献6：“biochemica biophysica acta”，1014，p.305(1989)
19.非专利文献7：“日本産科婦人科学会”杂志，41卷，1943页，1989年
20.非专利文献8：“experimental cell research”，vol.148，p.377(1983)


技术实现要素：

21.发明所要解决的课题
22.本发明是鉴于上述情况而提出的，其目的是提供促进透明质酸产生能力而使透明质酸量增加的透明质酸产生促进剂。
23.用于解决课题的方法
24.本发明人等使用来源于人角质形成细胞的hacat细胞，研究了镁对与皮肤的分化、保湿有关的因子的基因表达的效果，结果发现镁化合物具有优异的透明质酸产生促进作用。进而，发明了以含有镁化合物作为有效成分为特征的透明质酸产生促进剂。
25.因此，本发明涉及以下发明：
26.[1]一种透明质酸产生促进剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。
[0027]
[2]根据项目1所述的透明质酸产生促进剂，镁化合物为氯化镁、乳酸镁或硫酸镁。
[0028]
[3]根据项目1或2所述的透明质酸产生促进剂，其为了促进表皮细胞和/或角质形成细胞中的透明质酸的产生而使用。
[0029]
[4]一种美容方法或非治疗的方法，其包含：应用含有镁化合物作为有效成分的透明质酸产生促进剂。
[0030]
[5]用于促进透明质酸的产生的镁化合物的用途。
[0031]
[6]一种促进透明质酸的产生的皮肤外用剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。
[0032]
[7]一种用于治疗由透明质酸的异常分解或透明质酸产生能力的降低引起的疾病的治疗剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。
[0033]
[8]一种促进透明质酸的产生的化合物的筛选方法，其包含下述工序：
[0034]
使细胞与该化合物接触的工序；
[0035]
测定细胞内镁浓度的工序；
[0036]
确定由该化合物的有无引起的细胞内镁浓度的增加的有无的工序。
[0037]
[9]根据项目8所述的方法，其进一步包含测定透明质酸的产生量的变化的工序。
[0038]
发明的效果
[0039]
可以使用镁化合物来促进细胞内的透明质酸的产生。进一步，通过促进透明质酸的产生，因而能够有效地应用于防止人皮肤的老化(皮肤的弹性、弹力保持)、关节炎等的预防/治疗、灼伤的初期治疗等。
附图说明
[0040]
图1显示通过镁化合物的摄取而促进细胞内的透明质酸合成酶(has)的表达和透明质酸产生的机制。
[0041]
图2显示通过镁化合物的摄取而促进细胞内的透明质酸合成酶(has)的表达和透明质酸产生的机制。
[0042]
图3显示由镁化合物引起的透明质酸合成酶(has)的表达的促进。显示出如果将hacat细胞暴露于高镁培养基则促进has2和has3的表达，如果暴露于低镁培养基则has2和has3的表达降低。
[0043]
图4显示通过镁化合物而定量地促进透明质酸合成酶(has)的表达量的结果。显示出如果将hacat细胞暴露于高镁培养基则has2和has3的相对蛋白质量增加，如果暴露于低镁培养基则has2和has3的相对蛋白质量降低。图的横轴的c表示对照，h表示高镁浓度，l表示低镁浓度。
[0044]
图5的a显示通过镁化合物而促进透明质酸的合成的结果。显示出如果将hacat细胞暴露于高镁培养基则细胞外透明质酸量增加，如果暴露于低镁培养基则细胞外透明质酸量降低。横轴的c表示对照，h表示高镁浓度，l表示低镁浓度。b显示对细胞表面的nipal2和nipal4的镁化合物的摄取带来的影响进行了调查的结果。显示出通过nipal2sirna和nipal4sirna的导入而抑制镁化合物的摄取，抑制细胞外透明质酸的产生。横轴的neg表示阴性对照、暴露于5mm mgcl2时的阴性对照，n2表示nipal2sirna导入样品，n4表示nipal4 sirna的导入样品的结果。
[0045]
图6显示测定了添加了各镁化合物时的has2和has3mrna增加量的结果。氯化镁(mgcl2)、乳酸镁(mg-lac)、硫酸镁(mgso4)都观察到has2、has3的mrna量的增加。
具体实施方式
[0046]
在本发明的一个方案中，本发明涉及一种透明质酸产生促进剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。
[0047]
在遗传性的鱼鳞癣患者中鉴定出作为镁通道起作用的nipal4的基因变异，指出了皮肤损伤与镁输送的异常的相关。然而，皮肤屏障的维持中的镁化合物的作用、作用机理未阐明。本发明人等使用来源于人角质形成细胞的hacat细胞，研究了镁对与皮肤的分化、保湿有关的因子的基因表达的效果，结果由于透明质酸合成酶(has)的表达量变化了，因此研究了其作用机理。
[0048]
本发明人等首次发现了通过使用镁化合物，可以促进透明质酸合成酶(has)的表达量和透明质酸的产生。研究了has与nipal2和nipal4的关系，结果发现，通过nipal2/4sirna的导入，has2/3mrna量降低，抑制了由对高镁培养基的暴露引起的has2/3mrna量的增加。因此，暗示出nipal2和nipal4作为镁流入通道起作用。可以认为通过镁离子经由细胞表面的nipal2/4而被摄取，从而促进细胞内的has2/3的表达和透明质酸的产生(图1)。
[0049]
为了阐明由镁引起的has2/3的表达调节机理，研究了细胞信号转导因子对磷酸化的效果。进一步调查了报告活性等，结果发现，图2的机制参与由mg引起的ha产生。
[0050]
因此，通过使用镁化合物，可以促进透明质酸的产生。
[0051]
在本说明书中，所谓透明质酸产生促进剂，是指具有促进细胞的透明质酸的产生和/或透明质酸的产生能力的效果。
[0052]
促进透明质酸的产生和/或透明质酸的产生能力的效果通过测定将细胞用包含透明质酸产生促进剂的培养液进行了培养后的细胞外的透明质酸产生量来评价。
[0053]
作为本发明的透明质酸产生促进剂所使用的镁化合物，可举出卤化物和多卤化物、氧化物和氧化物的相关化合物、硫化物、氮化物、碳化物、含氧酸盐、有机镁化合物等含有镁的化合物。特别优选为氯化镁、乳酸镁或硫酸镁。
[0054]
本发明的透明质酸产生促进剂例如为了促进表皮细胞、皮肤成纤维细胞和/或角质形成细胞中的透明质酸的产生而使用，但不限定于此。在本发明中，特别是，在表皮细胞和/或角质形成细胞中具有效果。
[0055]
本发明的一个方案涉及一种促进透明质酸的产生的皮肤外用剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。
[0056]
本发明的透明质酸产生促进剂通过使用镁化合物，促进透明质酸的产生，能够有效地应用于防止人皮肤的老化(皮肤的弹性、弹力保持)、关节炎等的预防/治疗、灼伤的初期治疗等。因此，提供促进透明质酸的产生的皮肤外用剂(包含药品、准药品、化妆料)和/或用于治疗由透明质酸的异常分解或透明质酸产生能力的降低引起的疾病的治疗剂。
[0057]
此外，本发明的一个方案涉及用于治疗由透明质酸的异常分解或透明质酸产生能力的降低引起的疾病的治疗剂，其特征在于，含有镁化合物作为有效成分。在疾病中，包含例如，肝炎、牙龈炎、风湿病、变形性关节炎、恶性肿瘤、肝硬化、移植排斥、硬皮病、肝硬化、动脉硬化、纤维化、干皮病、干燥肌肤、粗糙肌肤、肾炎、瘢痕瘤、过修复、败血症等，但不限定于它们。进一步，本发明的一个方案涉及一种方法，是用于治疗对象中的由透明质酸的异常分解或透明质酸产生能力的降低引起的疾病的方法，其包含：将含有镁化合物作为有效成分的组合物施与对象。对象能够为包含人的哺乳动物、或非人哺乳动物，但优选为人。
[0058]
在将本发明的镁化合物混配于皮肤外用剂或治疗剂的情况下，镁化合物在外用剂总量中，例如，可以以1～20mm、0.000001～1.0质量％的量包含。
[0059]
在将本发明应用于皮肤外用剂或治疗剂(组合物)的情况下，除了上述成分以外，进一步根据需要，在不损害本发明的效果的范围内，可以根据需要适当混配通常用于化妆品、药品等皮肤外用剂的成分，例如抗氧化剂、油分、紫外线防御剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色料、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
[0060]
进一步，也可以适当混配乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂、咖啡因、丹宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜的果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素c、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类等。
[0061]
皮肤外用剂能够广泛应用于被应用于外皮的化妆料、准药品等、特别适合为化妆
料，其剂型也只要可以应用于皮肤，就可以为任何剂型，应用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二层系、水-油-粉末三层系、软膏、化妆水、凝胶、气雾剂等任意的剂型。
[0062]
使用形态也是任意的，可以用于例如化妆水、乳液、霜、面膜等面部化妆料、粉底、口红、眼影等彩妆化妆料、芳香化妆料、浴用剂等。
[0063]
此外，如果为彩妆化妆品，则能够广泛应用于粉底等、作为日化制品的美体皂、肥皂等形态。进一步，如果为准药品，则能够广泛应用于各种软膏剂等形态。而且，本发明的透明质酸产生促进剂能够采用的形态不限定于这些剂型和形态。
[0064]
在将本发明的透明质酸产生促进剂混配于饮食品、饲料等的情况下，镁化合物的混配量可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等来适当确定，例如，在饮食品总量中在片剂、胶囊剂等的情况下可以以1～90质量％，在其它饮食品中可以以0.001～50质量％的量包含。优选以成人每一天镁化合物的摄取量成为约1～370mg左右的方式调制。特别是，在作为保健用饮食品等而利用的情况下，优选使本发明的有效成分以充分发挥规定的效果那样的量含有。
[0065]
作为饮食品、饲料的形态，可以任意地成型为例如，颗粒状、粒状、糊状、凝胶状、固体状、或液体状。可以使它们适当含有被确认含有于饮食品等的公知的各种物质，例如粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、ph调制剂等赋形剂。
[0066]
在使用本发明的透明质酸产生促进剂作为医药制剂的情况下，该制剂经口地或非经口地(静脉施与、腹腔内施与等)适当使用。剂型也是任意的，可以通过公知的方法适当调制为例如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等经口用固体制剂、内服液体制剂、糖浆剂等经口用液体制剂、或注射剂等非经口用液体制剂等任一形态。在这些医药制剂中，可以适当使用通常使用的粘合剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、ph调制剂等赋形剂。
[0067]
在使用本发明的透明质酸产生促进剂作为皮肤外用剂、饮食品、饲料、医药制剂等的情况下，有益于蛋白质非酶糖化作用参与的各种症状、疾病、病态等的治疗、预防、改善等。作为具体的应用例，适合用于例如，防止人皮肤的老化(皮肤的弹性、弹力保持)、关节炎等的预防/治疗、灼伤的初期治疗等。此外可以将上述症状、疾病、病态等的治疗、预防、改善等生理功能作为概念，而应用于显示该主旨的皮肤外用剂、功能性饮食品、疾病者用食品、特定保健用食品等。
[0068]
本发明的一个方案涉及一种美容方法或非治疗的方法，其包含：应用含有镁化合物作为有效成分的透明质酸产生促进剂。
[0069]
本说明书所公开的透明质酸产生促进剂、皮肤外用剂或治疗剂可以在用于防止人皮肤的老化(皮肤的弹性、弹力保持)、关节炎等的预防/治疗、灼伤的初期治疗等美容或非治疗的方法中使用。在本发明涉及的美容或非治疗的方法中，将上述皮肤外用剂组合物应用于想要获得所希望的效果的部位例如脸、颈、手、腕、脚等。应用可以通过手、涂抹工具等以涂抹等任意方式进行。应用的次数、频率、量等根据所希望的效果等来适当设定。另外，本发明涉及的美容或非治疗的方法不包含所谓的医疗行为。
[0070]
进一步，本发明的一个方案涉及用于促进透明质酸的产生的镁化合物的用途。本说明书所公开的数据证实了镁化合物具有优异的透明质酸产生能力。因此，可以使用镁化
合物，来调制透明质酸产生促进剂、促进透明质酸的产生的皮肤外用剂、治疗由透明质酸产生能力的降低引起的疾病的治疗剂。即，本发明的一个方案也涉及这些皮肤外用剂和治疗剂的制造中的镁化合物的使用。
[0071]
进一步，本发明的一个方案涉及一种方法，是促进透明质酸的产生的化合物的筛选方法，其包含下述工序：
[0072]
使细胞与该化合物接触的工序；
[0073]
测定细胞内镁浓度的工序；
[0074]
确定由该化合物的有无引起的细胞内镁浓度的增加的有无的工序。
[0075]
透明质酸的产生能力可以通过测定细胞内镁化合物浓度来测定。具体而言，如果镁离子浓度增加，则透明质酸浓度增大，因此在促进透明质酸的产生的化合物的筛选中，通过确定由候选化合物的有无引起的细胞内镁浓度的增加的有无，从而可以进行候选化合物的选择。
[0076]
镁浓度通过测定将细胞用包含候选化合物的培养液进行了培养后的细胞内的镁浓度来评价。
[0077]
成为筛选的对象的化合物，能够使用例如化合物库、微生物/动植物等的提取物的库所包含的物质。细胞内镁浓度的测定，例如可以通过使用了镁荧光探针等的荧光测定法来进行。作为镁荧光探针，能够使用例如，能够由富士
フイルム
和光純薬(株)购入的kmg-20-am、能够由thermo fisher scientific购入的mag-fura-2、magnesium green(商标)等，但不限定于它们。
[0078]
进一步，本发明的一个方案涉及上述筛选方法，其进一步包含：测定透明质酸的产生量的变化的工序。在上述筛选方法中，通过测定透明质酸的产生量的变化，可以进行候选化合物的选择。
[0079]
透明质酸的产生量的变化，例如能够通过使用elisa等公知的手法测定细胞外的透明质酸(ha)量来确定。或者，透明质酸的产生量的变化可以基于透明质酸合成酶(has)的表达量(has2/3mrna量或has2/3蛋白质量)的变化来测定。
[0080]
在本说明书中提及的全部文献的整体通过引用而引入到本说明书中。
[0081]
以下说明的本发明的实施例，仅以例示作为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅受专利权利要求书的记载限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更，例如本发明的构成要件的追加、删除和置换。
[0082]
实施例
[0083]
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不限定于以下实施例。
[0084]
实施例1：由镁化合物引起的has2和has3的表达量的鉴定
[0085]
通过荧光测定法而测定了细胞内镁浓度([mg2 ])，结果如果将hacat细胞暴露于高镁培养基则细胞内镁浓度变高，进一步观察到has2、has3mrna量增加。对于低镁浓度，细胞内镁浓度变低，观察到has2和has3mrna量的降低。
[0086]
将结果示于图3和4中。由图3的结果可知，高镁浓度促进了has2和has3的表达。图4同样地，高镁浓度也显示出has2和has3的相对蛋白质量的增加。
[0087]
实施例2：由镁浓度引起的透明质酸量的测定
[0088]
将在细胞外(培养基中)产生的透明质酸使用透明质酸测定试剂盒(pg
リサーチ
社)
通过elisa(竞争法)进行了测定。图5a显示出如果将hacat细胞暴露于高镁培养基，则细胞外透明质酸量增加，如果暴露于低镁培养基，则细胞外透明质酸量降低。
[0089]
研究了has的表达与nipal2和4的关系，结果nipal2sirna和nipal4sirna的导入使has2/3mrna量降低，抑制了由对高镁培养基的暴露引起的has2/3mrna量的增加。图5b显示出通过nipal2 sirna和nipal4sirna的导入而抑制镁化合物的摄取，抑制细胞外透明质酸的产生。暗示出nipal2和nipal4作为镁流入通道起作用。
[0090]
实施例3：镁化合物对has2/3mrna量的影响
[0091]
在将hacat细胞培养4天后，用添加了5mm氯化镁(mgcl2)、乳酸镁(mg-lac)、硫酸镁(mgso4)的培养基培养了6小时。在提取rna后，通过实时pcr法，测定了has2/3mrna量。将其结果示于图6中。氯化镁(mgcl2)、乳酸镁(mg-lac)、硫酸镁(mgso4)都观察到has2、has3的mrna量的增加。
[0092]
由图3～6的结果明确地确认了通过镁离子的摄取而促进has2/3的表达和透明质酸产生的效果。