基于反相微乳液的分子印迹及包覆聚合物、制备方法及用途

1.本发明属于仿生分子识别纳米材料与分子印迹技术领域，具体涉及一种基于反相微乳液的分子印迹聚合物、其制备方法和用途。


背景技术：

2.抗体由于其独特的特异性，被广泛的用于生物分子靶向的识别，目前在疾病诊断、生物医学领域有十分广泛的应用。然而，抗体存在明显的局限性，如制备工艺复杂、成本高昂、筛选周期长等，其稳定性和重现性也存在一定的问题。特别是糖类化合物的免疫原性差，相应的抗体难以制备。同时，对于糖链和一些特定的蛋白质或多肽，其纯品难以获得，这也限制了其相应的抗体的制备。因此，开发抗体的替代物具有重要的实际应用价值。
3.分子印迹技术(molecular imprinting technology，mit)是制备具有类似抗体对抗原的识别能力的仿生分子识别材料(即，分子印迹聚合物，mip)的重要方法。该技术的基本原理是，先将模板分子与功能单体按一定比例形成配合物，再加入交联剂，并使用合适方式诱导功能单体与交联剂发生聚合，使其形成聚合物，然后采用合适的方法将模板分子去除后，在聚合物中留下形状与模板分子互补、能高选择性结合模板分子的印迹空腔(g.wulff,a sarhan,angew.chem.int.ed.,1972,11,341-345；g.vlatakis,l.i.andersson,r.m
ü
ller,k.mosbach,nature,1993,361,645-647；h.nishino,c.s.huang,k.j.shea,angew.chem.int.ed.,2006,45,2392-2396)。所制得的分子印迹聚合物(mip)和抗体相比，具有制备过程简单、成本低廉、稳定性好和可以重复使用等优点，已被广泛用于色谱分离、化学传感、药物递送及纳米医学等领域。
4.尽管目前分子印迹技术已经取得了显著的进步，现有的分子印迹技术仍存在许多缺陷。在制备过程中，功能单体的使用可以在与交联剂共同聚合构成印迹空腔的同时，形成与模板分子相互作用的位点，所得印迹空腔在形状、大小和相互作用位点等方面刚好和模板分子互补，从而得到能高特异性和强亲和力的结合空腔。然而，本发明人发现，由于印迹空腔外的非印迹表面也是由与构建印迹空腔的种类和比例相同的单体和交联剂构建的，因而存在显著的非特异相互作用位点，从而在实际使用中会导致明显的交叉反应性。


技术实现要素：

5.针对目前的分子印迹技术在制备分子印迹聚合物时会在非印迹表面存在明显的非特异性吸附位点这一瓶颈问题，本发明人基于反相微乳液法提供了一种分子印迹及包覆聚合物的制备方法，其中，在与模板分子互补的多种功能单体(包括单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂)聚合形成印迹空腔后，通过利用不含与模板分子作用的功能基团的包覆试剂的聚合，在所述印迹空腔上形成一层很薄且化学惰性的包覆层，由此使得到的分子印迹及包覆聚合物在获得高亲和力的同时降低交叉反应性。
6.一方面，本发明提供了一种分子印迹及包覆聚合物，其中，所述聚合物包括：
7.印迹空腔，所述印迹空腔包括单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的
聚合物；以及
8.包覆层，所述包覆层位于所述印迹空腔的非印迹表面上，且所述包覆层包括聚合的包覆试剂，所述包覆试剂为原硅酸四乙酯。
9.另一方面，本发明提供了一种制备上述的分子印迹及包覆聚合物的方法，其中，所述方法包括：
10.(1)将亲水模板进行疏水修饰后，得到两亲性的印迹模板，或者选择两亲性分子作为印迹模板；
11.(2)制备反相微乳液，所述反相微乳液包含表面活性剂、助表面活性剂、油相以及水相；
12.(3)向所述反相微乳液中加入所述印迹模板，得到模板锚定的反相微乳液；
13.(4)向所述模板锚定的反相微乳液中加入单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的溶液进行反应，得到分子印迹材料；
14.(5)向所述分子印迹材料中加入包覆试剂进行反应，得到包覆印迹的分子印迹材料，所述包覆试剂为原硅酸四乙酯；
15.(6)将所述包覆印迹的分子印迹材料进行破乳处理，然后通过洗脱去除所述印迹模板，得到所述分子印迹及包覆聚合物。
16.又一方面，本发明涉及上述的分子印迹及包覆聚合物在制备用于识别靶分子或靶细胞的制剂中的用途。
17.本发明上述的制备方法涉及两次不同作用的聚合反应：第一次聚合反应利用相互作用位点与印迹模板分子互补的单体硅烷化试剂，以构建识别模板分子的高亲和力和高专一性的印迹空腔；而第二次聚合反应利用不含与模板分子作用的功能基团的包覆试剂，形成薄且化学惰性的包覆层，将第一次聚合反应得到的非印迹表面覆盖，而不显著影响第一次聚合反应形成的印迹空腔，从而在获得高亲和力的同时降低交叉反应性。
18.由于印迹模板的分子尺寸很小，以上两个聚合反应过程必须是高可控性的；若不可控，难以获得良好的印迹空腔和包覆层，从而难以获得良好的分子识别性能。为了实现可控的聚合反应，本发明的方法将两次聚合反应控制在由反相微乳液形成的纳米级的限域空间内进行，特别是将形成印迹空腔和包覆层的聚合反应过程限定在反相微乳液表面胶束约束的水-油界面进行。因此，本发明对亲水模板分子进行了疏水修饰以使模板分子含有疏水链或者直接选择含有疏水链的天然两亲性分子作为模板分子，从而将模板分子锚定在反相微乳液的水-油界面。由此，本发明的制备方法能够高度可控地得到具有良好的印迹空腔和包覆层的分子印迹及包覆聚合物，从而能够在提供高亲和力的同时降低交叉反应性。
19.本发明的分子印迹及包覆聚合物能够特异性地识别、结合和富集目标蛋白质及其特征片段。印迹模板可为疏水碳链修饰的表位多肽、单糖或聚糖，而无需完整的目标蛋白。与现有蛋白质的印迹技术相比，对于多肽，本发明采用蛋白表位碳链修饰，突破了表位选取的局限性，即使是有翻译后修饰的表位也可以很容易地用碳链对其进行修饰；对于单糖或聚糖，既可以通过化学合成获得模板，也可以选择天然的两亲性物质如糖脂。针对蛋白特征片段进行分子印迹及包覆印迹，首先采用不同种类和比例的单体硅烷化试剂进行第一次聚合，然后采用原硅酸四乙酯进行第二次聚合，不仅使得到的分子印迹及包覆聚合物具有很强的亲和力，而且提高了特异性。本发明的制备方法通用性好，实用性强，所用碳链修饰的
印迹模板方便易得，所制备的分子印迹及包覆聚合物特异性更高、亲和力更强，在分离纯化、生化分析、癌细胞靶向识别及生物成像等领域具有重要的应用潜力。
附图说明
20.图1为本技术的示例性的制备分子印迹及包覆聚合物的方法的原理示意图，其中，a示出了不引入纳米内核的制备过程，b示出了引入纳米内核的制备过程。
21.图2为示出了对表位进行的碳链修饰的路线图。
22.图3为对单糖或聚糖进行的疏水链修饰的路线图。
23.图4为目标肽段(即，表位)的化学结构，其中，a为β
2-微球蛋白(b2m)的c端表位的化学结构；b为含有一个来自信号肽的氨基酸a的非转移性黑色素瘤糖蛋白b(gpnmb)的n端表位的化学结构；c为gpnmb的n端表位的化学结构；d为人表皮生长因子受体2(her2)的n端表位的化学结构。
24.图5示出了表征分子印迹及包覆聚合物的透射电子显微镜(tem)照片(a)以及以量子点为内核的分子印迹及包覆聚合物的tem照片(b)。
25.图6示出了选择性表征的结果，其中a和c分别示出了常规分子印迹聚合物在肽段和蛋白水平的选择性，印迹条件：aptes/uptes/ibtes/bntes＝20:20:50:10，单体硅烷化试剂/teos＝20:80；b和d分别示出了分子印迹及包覆聚合物在肽段和蛋白水平的选择性，印迹条件：aptes/uptes/ibtes/bntes＝20:20:50:10，单体/teos＝30:70。
26.图7示出了qd520@cmip的选择性表征的结果，其中a示出了肽段水平的选择性，b示出了蛋白水平的选择性；qd520是最大发射波长为520nm的量子点，cmip为分子印迹及包覆聚合物，cnip为包覆的非印迹聚合物。
27.图8为qd620@cmip的选择性表征的结果，其中a示出了肽段水平的选择性，b示出了蛋白水平的选择性；qd620是最大发射波长为620nm的量子点，cmip为分子印迹及包覆聚合物，cnip为包覆的非印迹聚合物。
28.图9为细胞成像照片，其中qd520是最大发射波长为520nm的量子点，qd620是最大发射波长为620nm的量子点，cmip为分子印迹及包覆聚合物，cnip为包覆的非印迹聚合物；用hoechst 33342对细胞核进行染色。
29.图10示出了用于糖链印迹的硼酸功能化硅烷化试剂的结构。
30.图11示出了以神经节苷脂gm1a为印迹模板的具有单个量子点内核的分子印迹及包覆聚合物的选择性表征结果。
具体实施方式
31.在下文中，通过示例性的各实施方式对本发明的方案进行解释，但是本发明的保护范围并不限于此。
32.在本文中，为了便于同常规的分子印迹聚合物(mip)和非印迹聚合物(nip)区分，由本发明的方法制备得到的分子印迹及包覆聚合物和包覆的非印迹聚合物的英文缩写分别用cmip和cnip表示。
33.本发明涉及一种基于反相微乳液的以疏水链修饰的亲水模板或天然的两亲性模板为印迹模板的分子印迹技术，不需要目标蛋白的纯品，只需要知道蛋白的氨基酸序列信
息或糖的表达情况，对于亲水模板可利用化学合成手段获得疏水链修饰的印迹模板，通过对亲水部分进行印迹和包覆，制备得到高特异性、强亲和力的分子印迹及包覆聚合物。本发明的制备方法通用性好、应用性强，对于多肽，模板可通过固相合成容易获得，且碳链修饰的方法基本上适用所有的表位多肽(即，目标蛋白的c端或n端多肽序列)，包括含有翻译后修饰的表位多肽。对于单糖或聚糖，既可以通过化学合成获得模板，也可以选择天然的两亲性物质如糖脂。特别是，在本发明的方法中涉及对印迹模板进行两次聚合反应，第一次聚合反应为模板提供了相互作用强的印迹空腔，第二次聚合反应形成惰性的包覆层以覆盖所述印迹空腔外表面的非特异性吸附位点，可显著提高得到的分子印迹及包覆聚合物的特异性。此外，本发明的方法还可以进一步制备基于各种纳米材料内核的复合结构，大大拓展了其应用性。目前该方法尚未有类似文献和专利报道。
34.在一个实施方式中，本发明提供了一种分子印迹及包覆聚合物，其中，所述聚合物包括：
35.印迹空腔，所述印迹空腔包括单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的聚合物；以及
36.包覆层，所述包覆层位于所述印迹空腔的非印迹表面上，且所述包覆层包括聚合的包覆试剂，所述包覆试剂为原硅酸四乙酯。
37.在一些优选的实施方式中，所述分子印迹及包覆聚合物还包括位于所述印迹空腔内的纳米内核；优选地，所述分子印迹及包覆聚合物包括单个纳米内核。在本文中，纳米内核的大小可根据印迹空腔确定，而并不受特别的限定。仅作为优选的示例，所述纳米内核的大小为0-30nm。
38.在进一步优选的实施方式中，所述纳米内核可选自量子点、上转换纳米材料、磁性纳米材料和贵金属纳米颗粒，但不限于此。
39.本领域已知的所有量子点均可用于本文中，所述量子点例如可为球形量子点。
40.在本文中，上转换纳米材料可为本领域已知的任意的能够用于制备纳米内核的材料，例如球形上转换纳米颗粒。同时，贵金属纳米颗粒可为由本领域已知的能够合成纳米颗粒的任何贵金属得到的纳米颗粒，例如金银纳米颗粒。
41.在一些优选的实施方式中，所述单体硅烷化试剂可包括但不限于氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、脲丙基三乙氧基硅烷(uptes)、苄基三乙氧基硅烷(bntes)、异丁基三乙氧基硅烷(ibtes)和原硅酸四乙酯(teos)等。
42.在一些优选的实施方式中，所述硼酸功能化硅烷化试剂选自dffpba-aptes、apba-gptes，但不限于此。
43.在一个实施方式中，本发明提供了一种制备上述的分子印迹及包覆聚合物的方法，其中，所述方法包括：
44.(1)将亲水模板进行疏水修饰后，得到两亲性的印迹模板，或者选择两亲性分子作为印迹模板；
45.(2)制备反相微乳液，所述反相微乳液包含表面活性剂、助表面活性剂、油相以及水相；
46.(3)向所述反相微乳液中加入所述印迹模板，得到模板锚定的反相微乳液；
47.(4)向所述模板锚定的反相微乳液中加入单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅
烷化试剂的溶液进行反应，得到分子印迹材料；
48.(5)向所述分子印迹材料中加入包覆试剂进行反应，得到包覆印迹的分子印迹材料，所述包覆试剂为原硅酸四乙酯；
49.(6)将所述包覆印迹的分子印迹材料进行破乳处理，然后通过洗脱去除所述印迹模板，得到所述分子印迹及包覆聚合物。
50.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为目标蛋白的c端或n端多肽序列、单糖或聚糖。对于单糖和聚糖，可根据目标物的表达情况(例如目标蛋白的糖型表达信息)，选择相应的糖型。
51.在进一步优选的实施方式中，所述亲水模板为目标蛋白的c端或n端的含9-15个氨基酸残基的多肽序列。
52.在进一步优选的实施方式中，所述目标蛋白可选自b2m、trf、tfr、afp、cea、gpnmb或her2，但不限于此。
53.在进一步优选的实施方式中，所述亲水模板可选自b2m、trf或tfr的c端多肽序列，或者afp、cea、gpnmb或her2的n端多肽序列，但不限于此。
54.在一些优选的实施方式中，所述两亲性分子为天然的两亲性物质，优选糖脂，包括甘油糖脂和鞘糖脂(例如神经节苷脂)。对该两亲性分子的亲水部分进行印迹，而其疏水部分仅用于模板的界面固定。
55.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为目标蛋白的c端多肽序列，通过使所述多肽序列的起始氨基酸的氨基经缩合反应与单链脂肪酸结合，对所述亲水模板进行所述疏水修饰。
56.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为目标蛋白的n端多肽序列，通过在所述多肽序列的末端先连接赖氨酸残基，然后使赖氨酸残基经缩合反应与单链脂肪酸结合，对所述亲水模板进行所述疏水修饰。
57.在本文中，单链脂肪酸的碳链长度可根据目标物的亲疏水性质来进行常规选择。在进一步优选的实施方式中，所述单链脂肪酸为c5至c20的单链脂肪酸，例如c13单链脂肪酸。
58.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为单糖或聚糖，通过化学合成在其还原端修饰单链脂肪酸或疏水基团。优选地，通过糖苷化反应或点击化学反应，在所述单糖或聚糖的还原端修饰疏水基团(例如烃类、苯环等)。
59.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为目标蛋白的c端或n端的含9个氨基酸残基的多肽序列，采用c13单链脂肪酸对所述亲水模板进行所述疏水修饰，从而能够更佳地保证经疏水修饰的亲水模板具有更合适的两亲性，以便能够更好的锚定在水-油界面上。
60.在一些优选的实施方式中，所述油相可选自环己烷、正己烷或甲苯，但不限于此。
61.在一些优选的实施方式中，所述表面活性剂可选自曲拉通x-100(triton x-100)、igepal co-520或igepal co-720等，但不限于此。
62.在一些优选的实施方式中，所述助表面活性剂可选自正己醇或正丁醇等，但不限于此。
63.在一些优选的实施方式中，所述水相可选自水或氨水，但不限于此。优选地，所述氨水的浓度为25w/v％～28w/v％。
64.在进一步优选的实施方式中，所述反相微乳液由环己烷、曲拉通x-100、正己醇、水和氨水构成。
65.在一些优选的实施方式中，在步骤(2)中，通过将分散在油相或者水相中的纳米材料加入到由所述表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相形成的溶液中来制备具有纳米内核的反相微乳液。由此，本发明的制备方法可以进一步制备基于各种纳米材料为内核的分子印迹及包覆聚合物，极大拓展了分子印迹的应用局限。
66.在一些优选的实施方式中，所述纳米材料包括但不局限于量子点、上转换纳米材料、磁性纳米材料和贵金属纳米颗粒等。
67.在进一步优选的实施方式中，所述纳米内核的大小为0-30nm。
68.在本领域中，通常在不影响反相微乳液稳定性的前提下向所述反相微乳液中加入所述印迹模板。
69.在一些优选的实施方式中，所述单体硅烷化试剂可根据作为表位的多肽序列的氨基酸种类进行选择，包括但不限于氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、脲丙基三乙氧基硅烷(uptes)、苄基三乙氧基硅烷(bntes)、异丁基三乙氧基硅烷(ibtes)和原硅酸四乙酯(teos)等。
70.在一些优选的实施方式中，所述亲水模板为单糖或聚糖，在步骤(4)中，向所述模板锚定的反相微乳液中加入所述单体硅烷化试剂和硼酸功能化硅烷化试剂的溶液进行反应。在该印迹过程中，单体硅烷化试剂可根据情况水解形成二氧化硅。
71.在一些优选的实施方式中，向所述模板锚定的反相微乳液中加入单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的环己烷溶液进行反应。
72.在一些优选的实施方式中，所述硼酸功能化硅烷化试剂选自dffpba-aptes、apba-gptes，但不限于此。
73.在一些优选的实施方式中，在步骤(6)中，通过丙酮或者乙醇将所述包覆印迹的分子印迹材料进行破乳处理，并用乙醇和水进行清洗。在一些优选的实施方式中，在步骤(6)中，通过选自如下的洗脱溶液进行所述洗脱：包含乙腈、水和醋酸的洗脱溶液，或冰醋酸溶液。在进一步优选的实施方式中，所述洗脱溶液由体积比为(30-70):(69-29):1(例如50:49:1)乙腈、水和醋酸组成。
74.在一些优选的实施方式中，所述分子印迹及包覆聚合物还包括纳米内核。优选地，所述分子印迹及包覆聚合物包括单个纳米内核。
75.本文所述的方法可将不同的目标物制备成两亲性的印迹模板，从而在反相微乳液体系内通过两次聚合反应得到具有高特异性和亲和力的分子印迹聚合物。在此，仅作为示例，基于不同的目标物，在下文中对本发明的分子印迹聚合物的制备过程进行说明，但本发明的保护范围不限于此。
76.以肽段为目标物
77.本发明中，可选用目标蛋白的c端或n端的多肽片段作为表位，然后经过碳链修饰后作为两亲性的印迹模板，利用该模板的两亲性使其锚定于反相微乳液体系的水-油界面上，然后采用单体硅烷化试剂进行第一次印迹，得到印迹空腔，其中单体硅烷化试剂的种类和比例可根据表位序列选择；再采用非特异相互作用弱、生物兼容性好的包覆试剂进行第二次印迹，主要起包覆印迹空腔的作用，所得的分子印迹及包覆聚合物能够特异性识别目
标蛋白及其表位。该技术不需要目标蛋白质纯品，而且表位多肽片段经疏水链修饰处理后，可以满足任意序列的印迹，能够适用于各种各样的目标蛋白质，制备的分子印迹及包覆聚合物特异性更高、亲和力更强。具体而言，以肽段为目标物制备分子印迹及包覆聚合物的示例性过程如下：
78.(1)表位序列的确定及碳链修饰
79.通过蛋白质数据库(如uniprot，protein date bank等)找出目标蛋白的氨基酸序列信息，选择目标蛋白的c端或n端多肽序列作为表位。
80.为了便于将表位多肽锚定于反相微乳液体系中的水-油界面上，需要对表位多肽修饰碳链，由此得到两亲性的印迹模板。修饰方法可为：对于c端表位，利用其起始氨基酸的氨基通过缩合反应与单链脂肪酸结合；对于n端表位，通过在该表位的末端先连接赖氨酸残基，然后所述赖氨酸残基通过缩合反应与单链脂肪酸结合。该步骤如图2所示。
81.(2)反相微乳液体系的构建
82.根据需要，可以选择不同的反相微乳液体系，包括本领域已知的众多反相微乳液体系。
83.作为示例，此处，反相微乳液体系可由表面活性剂、助表面活性剂、油相以及水相构成。具体而言，选择环己烷作为油相；选择曲拉通x-100作为表面活性剂；选择正己醇作为助表面活性剂；以及选择水和氨水作为水相，通过如下操作制备反相微乳液体系：取曲拉通x-100溶解到环己烷中，向其中加入正己醇，紧接着加入水和氨水，搅拌至体系从浑浊变为澄清透明，反相微乳液体系构建成功。
84.如果需要引入纳米内核，在构建上述反相微乳液体系的时候，向上述溶液中加入溶解在油相或者水相中的纳米材料的溶液即可。
85.(3)印迹溶液的制备
86.将例如100μl的氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷溶解在例如1ml的环己烷中，涡旋例如1分钟，得到溶液1；将例如100μl的原硅酸四乙酯溶解在例如1ml的环己烷中，涡旋例如1分钟，得到溶液2；最后，将例如300μl的溶液1和例如700μl的溶液2混合，得到1ml的印迹溶液。
87.(4)印迹模板的锚定
88.构建好反相微乳液体系后，向该体系中加入两亲性的印迹模板，然后搅拌，得到模板锚定的反相微乳液。
89.(5)基于反相微乳液的印迹聚合
90.将上述的印迹溶液缓慢滴加到模板锚定的反相微乳液中，反应后得到分子印迹材料。
91.(6)包覆印迹
92.向上述的分子印迹材料中滴加非特异相互作用弱、生物兼容性好的聚合试剂原硅酸四乙酯，继续反应以形成包覆层，得到包覆印迹的分子印迹材料。
93.(7)破乳
94.加入丙酮或者乙醇，离心，并用乙醇和水清洗多次，得到破乳后的包覆印迹的分子印迹材料。
95.(8)印迹模板的去除
96.将破乳后的包覆印迹的分子印迹材料加入到洗脱溶液中反应，去除模板，得到分子印迹及包覆聚合物。
97.以单糖或聚糖为目标物
98.本发明中，还可选用目标单糖或聚糖的糖型作为特征片段，然后经过碳链或其它疏水基团(如苯环)修饰后作为两亲性的印迹模板，利用印迹模板的两亲性使其锚定于反相微乳液体系的水-油界面上，然后采用单体硅烷化试剂和硼酸功能化硅烷化试剂进行第一次印迹，得到印迹空腔，再采用非特异相互作用弱、生物兼容性好的包覆试剂进行第二次印迹，主要起包覆印迹空腔的作用，所得的分子印迹及包覆聚合物能够特异性识别目标蛋白及其糖。该技术同样不需要目标蛋白质纯品，对于能获得其纯品的糖型，也可以用此方法进行印迹，此外，还可以选择天然两亲性物质如糖脂来作为印迹模板，使得该方法能够适用于各种各样的目标物，制备的分子印迹及包覆聚合物特异性更高、亲和力更强。具体而言，以单糖或聚糖为目标物制备包覆的分子印迹及包覆聚合物的示例性过程如下：
99.(1)糖型的确定及疏水链修饰
100.通过蛋白质数据库(如uniprot，protein date bank等)找出目标蛋白的糖型表达信息。为了便于将单糖或聚糖锚定于反相微乳液体系中的水-油界面上，需要对其修饰疏水链或疏水基团，其步骤如图3所示。也可以选择可商购获得的天然两亲性物质如糖脂作为印迹模板。
101.(2)反相微乳液体系的构建
102.根据需要，可以选择不同的反相微乳液体系，包括本领域已知的众多反相微乳液体系。
103.作为示例，此处，反相微乳液体系可由表面活性剂、助表面活性剂、油相以及水相构成。具体而言，选择环己烷作为油相；选择曲拉通x-100作为表面活性剂；选择正己醇作为助表面活性剂；以及选择水和氨水作为水相，通过如下操作制备反相微乳液体系：取曲拉通x-100溶解到环己烷中，向其中加入正己醇，紧接着加入水和氨水，搅拌至体系从浑浊变为澄清透明，反相微乳液体系构建成功。
104.如果需要引入纳米内核，在构建上述反相微乳液体系的时候，向上述溶液中加入溶解在油相或者水相中的纳米材料的溶液即可。
105.(3)印迹溶液的制备
106.将例如100μl的氨丙基三乙氧基硅烷和脲丙基三乙氧基硅烷以及硼酸功能化硅烷化试剂(dffpba-aptes)溶解在例如1ml的环己烷中，涡旋例如1分钟，得到溶液1；将例如100μl的原硅酸四乙酯溶解在例如1ml的环己烷中，涡旋例如1分钟，得到溶液2；最后，将例如300μl的溶液1和例如700μl的溶液2混合，得到1ml的印迹溶液。
107.(4)印迹模板的锚定
108.构建好反相微乳液体系后，向该体系中加入印迹模板，然后搅拌，得到模板锚定的反相微乳液。
109.(5)基于反相微乳液的印迹聚合
110.将上述的印迹溶液缓慢滴加到模板锚定的反相微乳液中，反应后得到分子印迹材料。
111.(6)包覆印迹
112.向上述的分子印迹材料中滴加非特异相互作用弱、生物兼容性好的聚合试剂原硅酸四乙酯，继续反应以形成包覆层，得到包覆的分子印迹材料。
113.(7)破乳
114.加入丙酮或者乙醇，离心，并用乙醇和水清洗多次，得到破乳后的包覆印迹的分子印迹材料。
115.(8)印迹模板的去除
116.将所述破乳后的包覆印迹的分子印迹材料加入到洗脱溶液中反应，去除模板，得到分子印迹及包覆聚合物。
117.在一个实施方式中，本发明涉及上述的分子印迹聚合物在制备用于识别靶分子或靶细胞的制剂中的用途。
118.在一些优选的实施方式中，所述制剂用于分离纯化、生化分析、靶向识别(例如癌细胞靶向识别)和生物成像分析中。在一些优选的实施方式中，所述靶分子包括但不限于b2m、trf、tfr、afp、cea、gpnmb或her2等。在一些优选的实施方式中，所述靶细胞包括三阴性乳腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞等。
119.本发明的示例性的技术方案可通过如下编号段落中的内容进行说明，但本发明的保护范围并不限于此：
120.1.一种分子印迹及包覆聚合物，其中，所述聚合物包括：
121.印迹空腔，所述印迹空腔包括单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的聚合物；以及
122.包覆层，所述包覆层位于所述印迹空腔的非印迹表面上，且所述包覆层包括聚合的包覆试剂，所述包覆试剂为原硅酸四乙酯。
123.2.如段落1所述的分子印迹及包覆聚合物，其中，所述分子印迹及包覆聚合物还包括位于所述印迹空腔内的纳米内核。
124.3.如段落1或2所述的分子印迹及包覆聚合物，其中，所述分子印迹及包覆聚合物包括单个纳米内核。
125.4.如段落1-3中任一段所述的分子印迹及包覆聚合物，其中，所述纳米内核选自量子点、上转换纳米材料、磁性纳米材料和贵金属纳米颗粒。
126.5.如段落1-4中任一段所述的分子印迹及包覆聚合物，其中，所述单体硅烷化试剂包括氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、脲丙基三乙氧基硅烷(uptes)、苄基三乙氧基硅烷(bntes)、异丁基三乙氧基硅烷(ibtes)和原硅酸四乙酯(teos)。
127.6.如段落1-5中任一段所述的分子印迹及包覆聚合物，其中，所述硼酸功能化硅烷化试剂选自dffpba-aptes或apba-gptes。
128.7.一种制备段落1-6中任一段所述的分子印迹及包覆聚合物的方法，其中，所述方法包括：
129.(1)将亲水模板进行疏水修饰后，得到两亲性的印迹模板，或者选择两亲性分子作为印迹模板；
130.(2)制备反相微乳液，所述反相微乳液包含表面活性剂、助表面活性剂、油相以及水相；
131.(3)向所述反相微乳液中加入所述印迹模板，得到模板锚定的反相微乳液；
100、正己醇、水和氨水构成。
153.26.如段落7-25中任一段所述的方法，其中，在步骤(2)中，通过将分散在油相或者水相中的纳米材料加入到由所述表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相形成的溶液中来制备具有纳米内核的反相微乳液。
154.27.如段落7-26中任一段所述的方法，其中，所述纳米材料包括量子点、上转换纳米材料、磁性纳米材料和贵金属纳米颗粒。
155.28.如段落7-27中任一段所述的方法，其中，所述纳米内核的大小为0-30nm。
156.29.如段落7-28中任一段所述的方法，其中，所述单体硅烷化试剂包括氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)、脲丙基三乙氧基硅烷(uptes)、苄基三乙氧基硅烷(bntes)、异丁基三乙氧基硅烷(ibtes)和原硅酸四乙酯(teos)。
157.30.如段落7-29中任一段所述的方法，其中，所述亲水模板为单糖或聚糖，在步骤(4)中，向所述模板锚定的反相微乳液中加入所述单体硅烷化试剂和硼酸功能化硅烷化试剂的溶液进行反应。
158.31.如段落7-30中任一段所述的方法，其中，在步骤(4)中，向所述模板锚定的反相微乳液中加入单体硅烷化试剂和任选的硼酸功能化硅烷化试剂的环己烷溶液进行反应。
159.32.如段落7-31中任一段所述的方法，其中，所述硼酸功能化硅烷化试剂选自dffpba-aptes或apba-gptes。
160.33.如段落7-32中任一段所述的方法，其中，在步骤(6)中，通过丙酮或者乙醇将所述包覆印迹的分子印迹材料进行破乳处理，并用乙醇和水进行清洗。
161.34.如段落7-33中任一段所述的方法，其中，在步骤(6)中，通过选自如下的洗脱溶液进行所述洗脱：包含乙腈、水和醋酸的洗脱溶液，或冰醋酸溶液。
162.35.如段落7-34中任一段所述的方法，其中，所述洗脱溶液由体积比为(30-70):(69-29):1乙腈、水和醋酸组成。
163.36.如段落7-35中任一段所述的方法，其中，所述分子印迹及包覆聚合物还包括纳米内核。
164.37.如段落36所述的方法，其中，所述分子印迹及包覆聚合物包括单个纳米内核。
165.38.段落1-6中任一段所述的分子印迹聚合物在制备用于识别靶分子或靶细胞的制剂中的用途。
166.39.如段落38所述的用途，其中，所述制剂用于分离纯化、生化分析、靶向识别和生物成像分析中。
167.40.如段落38或39所述的用途，其中，所述靶分子包括b2m、trf、tfr、afp、cea、gpnmb或her2。
168.41.如段落38或39所述的用途，其中，所述靶细胞包括三阴性乳腺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
169.本发明中，对于多肽，可选择目标蛋白的末端多肽作为特征表位，经过碳链修饰后得到具有两亲性质的修饰多肽作为印迹模板，印迹模板因此可以被锚定在反相微乳液的水-油界面上，碳链在油相，多肽从油水界面定向延伸至水相中。选择单体硅烷化试剂对表位多肽的氨基酸序列进行印迹，然后利用非特异相互作用弱、生物兼容性好的聚合试剂作为包覆试剂对印迹材料表面进行包覆。受益于反相微乳液的限定作用，可以得到很薄的包
覆层，既覆盖了材料表面的非特异性吸附位点，又不会掩盖印迹空腔，除去模板分子后得到分子印迹聚合物。对于单糖和聚糖，可以在其末端修饰疏水基团获得模板，也可以选择天然两亲性物质、例如糖脂直接作为印迹模板，在第一次印迹中，除了上述的单体硅烷化试剂外，还需引入硼酸功能化含硼酸的硅烷化试剂。利用反相微乳液的分散及约束作用，可以制备含有单个纳米颗粒内核的分子印迹聚合物，以制备具有特定响应的单个纳米球内核，以应用于亲和分离、生物分析和癌细胞靶向识别等重要领域。本发明所得的分子印迹及包覆聚合物在分离纯化、生化分析、癌细胞靶向识别和生物成像分析等领域中展现出良好的应用潜力。
170.实施例
171.接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。除非另外说明，如下实施例中涉及各操作可按照本领域已知的技术进行(例如参见如下的记载：《分子印迹学-从基础到应用》，[日]小宫山真等著，吴世康、汪鹏飞译，科学出版社，2006年4月；《分子印迹技术及应用》，谭天伟编著，化学工业出版社，2010年7月；《分子印迹技术》，姜忠义、吴洪编著，化学工业出版社，2003年1月；《分子印迹技术与药物分析》，傅强等编著，西安交通大学出版社，2014年9月；《分子印迹聚合物功能材料》，田大听著，科学出版社，2017年3月)。除非另外说明，下述实施例中使用的试剂、材料和设备均为可商购的试剂、材料和设备。
[0172]
实施例1：b2m蛋白c端表位的分子印迹及包覆聚合物的制备
[0173]
制备过程见图1的a子图，包括：
[0174]
步骤1)，反相微乳液体系的构建、印迹溶液的制备以及印迹聚合
[0175]
取1.77g的曲拉通x-100、1.6ml的正己醇、6.5ml的环己烷、480μl的水和100μl的25w/v％～28w/v％氨水于25ml的茄形瓶中，于25℃在700rpm下搅拌30min，形成澄清透明的溶液作为反相微乳液。随后，向其中加入1mg的作为印迹模板的c13单链脂肪酸(十三(烷)酸)修饰的b2m的c端表位(kivkwdrdm；seq id no.1)，继续搅拌30min，得到模板锚定的反相微乳液。
[0176]
将总体积100μl的单体摩尔比aptes:uptes:ibtes:bntes＝20:20:50:10的氨丙基三乙氧基硅烷、脲丙基三乙氧基硅烷、苄基三乙氧基硅烷和异丁基三乙氧基硅烷的混合物溶解在1ml的环己烷中，涡旋1min充分混匀，得到溶液1；将100μl的原硅酸四乙酯溶解在1ml的环己烷中，涡旋1min充分混匀，得到溶液2；最后，将300μl的溶液1和700μl的溶液2充分混合，得到总体积1ml的印迹溶液(溶液3)。
[0177]
最后，将1ml的溶液3缓慢地逐滴加入疏水模板锚定的反相微乳液中，于25℃在700rpm下反应24h，得到分子印迹材料。
[0178]
步骤2)，包覆印迹
[0179]
24h后，取100μl的原硅酸四乙酯，缓慢滴加至所述分子印迹材料中。继续在25℃于700rpm下反应24h，得到包覆印迹的分子印迹材料。
[0180]
步骤3)，破乳以及模板移除
[0181]
首先加入6ml丙酮破乳，在4000rpm下离心30min，并用10ml的乙醇和水各清洗5次。得到的破乳后的包覆印迹的分子印迹材料分散到5ml的洗脱溶液(乙腈:水:醋酸＝50:49:1，v/v/v)中，在25℃下振摇20分钟，上述操作重复三次。通过在4000rpm下离心收集材料，得
到的材料分别用10ml水和无水乙醇各清洗三次，最后过夜冷冻真空干燥，得到分子印迹及包覆聚合物。
[0182]
包覆的非印迹聚合物的制备过程除了不加所述印迹模板之外，其余步骤与制备上述分子印迹及包覆聚合物的步骤完全相同。
[0183]
除了不进行步骤2)的包覆印迹而是在步骤1)后直接进行步骤3)、以及对单体硅烷化试剂的摩尔比进行如下调整之外，仅经常规表位印迹的分子印迹聚合物(下文也称为“常规分子印迹聚合物”)的其它制备过程同上：单体摩尔比aptes/uptes/ibtes/bntes＝20:20:50:10，前述单体硅烷化试剂的总和与teos的摩尔比为20:80。
[0184]
常规分子印迹聚合物相应的非印迹聚合物(下文也称为“常规非印迹聚合物”)的制备过程除了不加所述印迹模板，其余步骤与制备上述常规分子印迹聚合物的步骤完全相同。
[0185]
实施例2分子印迹及包覆聚合物的形貌表征
[0186]
将实施例1中制备的不具有纳米内核的分子印迹及包覆聚合物以及实施例4中制备的具有纳米内核的分子印迹及包覆聚合物通过透射电子显微镜(tem)进行表征，表征结果在图5中示出。
[0187]
实施例3分子印迹及包覆聚合物对于模板分子及干扰物的抓取性能(选择性)测试
[0188]
在肽段水平
[0189]
分别将β2-微球蛋白(b2m)的c端表位(seq id no.1)、转铁蛋白(trf)的c端表位(leactfrrp；seq id no.2)和转铁蛋白受体(tfr)的c端表位(dvwdidnef；seq id no.3)以及甲胎蛋白(afp)的n端表位(rtlhrneyg；seq id no.4)和癌胚抗原(cea)的n端表位(kltiestpf；seq id no.5)溶解到磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)中制备成0.1mg/ml的表位溶液。将2.0mg的实施例1中制备的b2m的c端分子的印迹及包覆聚合物、常规分子印迹聚合物、常规非印迹聚合物和包覆的非印迹聚合物分别加入到200μl的表位溶液中，在25℃下温育30分钟。4000rpm离心收集后，用200μl的磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)清洗三次。然后，将得到的材料重新分散至20μl的洗脱溶液(乙腈:水:醋酸＝50:49:1，v/v/v)中，在25℃下振摇10分钟。最后，4000rpm离心分离材料并收集洗脱液。
[0190]
通过uv分析在214nm处测定洗脱液，结果如图6的a和b所示，在肽段水平，实施例1中制备的b2m的c端表位的分子印迹及包覆聚合物比常规分子印迹聚合物具有更低的交叉反应性。
[0191]
在蛋白水平
[0192]
分别将b2m、核糖核酸酶a(rnase a)、牛血清蛋白(bsa)、核糖核酸酶b(rnase b)和卵清白蛋白(ova)溶解到磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)中制备成0.1mg/ml的蛋白溶液。将2.0mg的实施例1中制备的b2m的c端表位的分子印迹及包覆聚合物、常规分子印迹聚合物、常规非印迹聚合物和包覆的非印迹的聚合物分别加入到200μl的上述蛋白溶液中，在25℃下温育30分钟。4000rpm离心收集后，用200μl的磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)清洗三次。然后，将得到的材料重新分散至20μl的洗脱溶液(乙腈:水:醋酸＝50:49:1，v/v/v)中，在25℃下振摇10分钟。最后，4000rpm离心分离材料并收集洗脱液。
[0193]
通过uv分析在214nm处测定洗脱液，结果如图6的c和d所示，在蛋白水平，实施例1中制备的b2m的c端表位的分子印迹及包覆聚合物比常规分子印迹聚合物同样具有更低的
交叉反应性。
[0194]
实施例4制备以单个量子点为内核的分子印迹及包覆聚合物
[0195]
选取cdse/zns量子点(qd)作为内核，制备gpnmb的n端表位(krfhdvlgn；seq id no.6)印迹的qd520(最大发射波长为520nm的量子点)@cmip和her2的n端表位(tqvctgtdm；seq id no.7)印迹的qd620(最大发射波长为620nm的量子点)@cmip。
[0196]
印迹溶液的制备和反相微乳液体系的构建同实施例1，在反相微乳液体系构建过程中，在形成的澄清透明的溶液稳定10min后，向其中加入700μl的qd520或qd620的环己烷溶液(3mg/ml)，700rpm下搅拌30min，随后加入1mg c13单链脂肪酸(十三(烷)酸)修饰的gpnmb n端表位或c13单链脂肪酸修饰的her2 n端表位并继续搅拌30min，然后按照实施例1所述的制备过程分别得到具有量子点内核的分子印迹及包覆聚合物(在下文中分别称为“qd520@cmip”和“qd620@cmip”)。
[0197]
相应的包覆的非印迹聚合物的制备过程除了不加所述印迹模板，其余步骤与制备上述分子印迹及包覆聚合物的步骤完全相同。
[0198]
实施例5以单个量子点为内核的分子印迹及包覆聚合物的选择性测试
[0199]
选择性测试的详细步骤同实施例3。
[0200]
对于实施例4中制备的gpnmb的n端表位印迹的qd520@cmip来说，以gpnmb的n端表位(seq id no.6)为目标物，her2的n端表位(seq id no.7)和afp的n端表位(seq id no.4)以及b2m的c端表位(seq id no.1)、trf的c端表位(seq id no.2)和tfr的c端表位(seq id no.3)为干扰物，测试了其在肽段水平的选择性；以gpnmb蛋白为目标物，her2、b2m、rnase a、bsa和rnase b为干扰物，测试了其在蛋白水平的选择性。结果如图7所示，所述具有量子点内核的分子印迹及包覆聚合物qd520@cmip在肽段和蛋白水平均具有良好的选择性。
[0201]
对于实施例4中制备的her2的n端表位印迹的qd620@cmip来说，以her2的n端表位(seq id no.7)为目标物，gpnmb的n端表位(seq id no.6)和afp的n端表位(seq id no.4)以及b2m的c端表位(seq id no.1)、trf的c端表位(seq id no.2)和tfr的c端表位(seq id no.3)为干扰物，测试了其在肽段水平的选择性；以her2蛋白为目标物，gpnmb、b2m、rnase a、bsa和rnase b为干扰物，测试了其在蛋白水平的选择性。结果如图8所示，所述具有量子点内核的分子印迹及包覆聚合物qd620@cmip在肽段和蛋白水平均具有良好的选择性。
[0202]
实施例6细胞培养和成像分析
[0203]
将mda-mb-157细胞(三阴性乳腺癌细胞，gpnmb高表达，her2低表达；购自atcc)在含有10％fbs的dmem培养基中培养2-3天(37℃，5％co2)，将mda-mb-361细胞(乳腺癌细胞，gpnmb高表达，her2高表达；购自atcc)在含有10％fbs的dmem培养基中培养2-3天(37℃，5％co2)，将mcf-7细胞(乳腺癌细胞，gpnmb低表达，her2低表达；购自atcc)在含有10％fbs的rpmi-1640培养基中培养2-3天(37℃，5％co2)。每种细胞培养四份。去除培养基后，用1
×
pbs缓冲液清洗细胞两次，分别用15％的多聚甲醛固定15分钟，然后分别加入200μl含有200μg/ml的实施例4中制备的gpnmb的n端表位印迹的qd520@cmip和包覆的非印迹聚合物(qd520@cnip)以及her2的n端表位印迹的qd620@cmip和包覆的非印迹聚合物(qd620@cnip)。将由此得到的培养皿在细胞培养箱中于37℃、5％co2下孵育30分钟后，用1
×
pbs缓冲液清洗三遍，除去未结合的聚合物。随后向所述培养皿中加入100μl的hoechst33342，染色10分钟后，用1
×
pbs缓冲液清洗两遍。最后，向所述培养皿中补充1ml的1
×
pbs缓冲液，在
激光共聚焦荧光显微镜下进行细胞成像。
[0204]
通过细胞成像分析，结果如图9所示，qd520@cmip对mda-mb-157和mda-mb-361细胞表现出非常强的荧光效果，对mcf-7细胞几乎没有效果。qd620@cmip对mda-mb-361细胞表现出显著的荧光效果，对mda-mb-157和mcf-7细胞几乎没有效果。此外，所有的包覆的非印迹聚合物对上述细胞均没有明显的效果。以上结果表明，qd520@cmip能够选择性地结合乳腺癌细胞表面高表达的gpnmb，qd620@cmip能够选择性地结合乳腺癌细胞表面高表达的her2，对比结果能够显著区分出不同类别的三阴性乳腺癌细胞。
[0205]
实施例7以单个量子点为内核的神经节苷脂gm1a分子印迹及包覆聚合物的制备
[0206]
除了如下调整之外，按照实施例4所述的制备方法制备具有单个量子点内核(qd520)的分子印迹及包覆聚合物：将印迹模板调整为1mg神经节苷脂gm1a；将单体硅烷化试剂aptes和uptes以及硼酸功能化硅烷化试剂dffpba-aptes溶解在1ml的环己烷中，制备得到印迹溶液，其中，功能单体aptes:uptes:dffpba-aptes:teos的摩尔比为5:10:15:70；将洗脱溶液调整为100mm的冰醋酸。
[0207]
相应的包覆的非印迹聚合物的制备过程除了不加所述印迹模板之外，其余步骤与上述完全相同。
[0208]
实施例8以单个量子点为内核的神经节苷脂gm1a分子印迹及包覆聚合物的选择性表征
[0209]
在96孔板中加入250μl的h2so4:hno3＝3:1(v/v)混合溶液，在室温下浸泡过夜，用清水洗至ph呈中性，置于烘箱干燥。将250μl的5vol％的十八烷基三乙氧基硅烷的水溶液加入到上述经活化的各孔内，室温下缓慢振摇2小时，分别用无水乙醇和水各清洗5-8次，置于烘箱干燥。往各孔内加入200μl的0.1mg/ml的神经节苷脂(包括gm1a、gm3、ga1、gd1b和gm1b)的乙腈:水＝1:3(v/v)的溶液，室温下孵育2小时，用磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)清洗3次，得到神经节苷脂修饰的96孔板。
[0210]
往神经节苷脂修饰的各孔内加入200μl的1mg/ml的实施例7中制备的分子印迹及包覆聚合物的磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)，在室温下孵育2小时，用磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)清洗3次，再加入200μl的磷酸盐缓冲溶液(10mm，ph 7.4)。用酶标仪在488/520nm处检测荧光强度。结果如图11所示，所述分子印迹及包覆聚合物除了对目标结构gm1a表现出良好的选择性，对于其子结构gm3和ga1仅有较弱的抓取，而对于gd1b和gm1b几乎不抓取。