一种通过调节肠道菌群增加骨密度的功能食品组合物及其制备方法

1.本发明属于食品和保健品技术领域，具体涉及一种通过调节肠道菌群增加骨密度的功能食品组合物及其制备方法。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis)，随着社会人口老龄化加剧，已经成为疾病中的常见病和多发病，是以骨量减少、骨微结构退化为特征、导致骨脆性增高及骨折危险性增加的一种全身代谢性骨病，影响到全世界数以百万人。目前，我国骨质疏松患者已达9000万，而我国骨质疏松患者在1987～2017这30年间增加了300％，在50岁以上人群中，大约三分之一的女性和五分之一的男性在其余生中至少会经历一次骨质疏松性骨折。衰老、妇女绝经、疾病、药物和营养缺乏等均可引起骨骼矿物质的丢失，骨密度降低，出现腰酸背痛、驼背、最终导致骨质疏松，重者可造成骨折、致残、终身卧床。这种骨脆性增加的临床表现是由破骨细胞调节的骨吸收和成骨细胞调节的骨形成失衡引起的。在绝经后妇女中，衰老或激素缺乏会导致骨平衡的代谢紊乱，导致更高的骨转换率，骨形成的速度远不及骨流失的速度。绝经后激素替代疗法(hrt)可以减少骨质疏松性骨折和骨流失，但长期服用会产生诸多的副作用，如增加乳腺癌、子宫内膜癌和心血管等疾病风险。因此，寻找高效低毒的抗骨质疏松症药物是非常迫切和必要的。
3.很多人认为：人到老年，腰背疼，腿脚疼，是“缺钙”造成的！一般来说，骨质疏松症一旦出现明显的疼痛症状时，骨骼中的骨量已经丢失30％～50％以上了。目前抗骨质疏松保健品的作用机制主要以补钙为主，通过促进钙吸收增加骨密度，但是由于靶点过于单一，长期服用不良反应会增多药效减弱，如胃肠道反应、肾功能损害、钙易位沉积引起关节疼痛等。人们在不断补钙的过程中还会出现骨质疏松和矿物质的异位沉积，就是因为矿物质没有得到有效的吸收和利用。肠道菌群是生活在我们肠道内的共生细菌，具有许多调节功能，包括调节宿主代谢和免疫状态。近年来的研究表明，肠道菌群也是骨量的调节剂，并提出肠道菌群对骨量的影响是通过对免疫系统的影响而介导的，而肠道免疫系统反过来调节破骨细胞的生成同时促进矿物质的吸收。所以，通过调节肠道菌群促进矿物质吸收改善骨代谢是一种新的有效途径。
4.在传统中医药中，食品是重要的组成部分，一些传统食品可作为药物来治疗疾病，而一些常用于防治疾病的中药也逐渐在人们的日常饮食中出现，这些食品或中药被统称为药食同源中药。我国中医药治疗骨质疏松症的历史悠久，拥有丰富的药食同源的植物资源，毒副作用小，多成分多靶点共同调节机体的平衡，同时改善多方面的代谢。因此，从药食同源的药材中研发一种通过调节肠道菌群增加骨密度的功能食品组合物是安全有效的途径。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种通过调节肠道菌群增加骨密度的
功能食品组合物及其制备方法，制备工艺简单，疗效好，安全无副作用。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
7.一种通过调节肠道菌群增加骨密度的多功能食品组合物，由如下重量份数的组分组成：黄瓜籽粉20～25份、葛根8～20份、覆盆子8～15份、黑芝麻2～4份、牡蛎2～4份、茯苓2～4份、菊粉1～3份、白芸豆粉1～2份。
8.优选地，所述的多功能食品组合物，由如下重量份数的组分组成：黄瓜籽20份、葛根20份、覆盆子10份、黑芝麻3份、牡蛎4份、茯苓3份、菊粉3份、白芸豆粉1份。
9.优选地，所述的多功能食品组合物，由如下重量份数的组分组成：黄瓜籽25份、葛根15份、覆盆子10份、黑芝麻2份、牡蛎2份、茯苓3份、菊粉2份、白芸豆粉2份。
10.优选地，所述的多功能食品组合物，由如下重量份数的组分组成：黄瓜籽粉24份、葛根8份、覆盆子8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1份。
11.所述通过调节肠道菌群增加骨密度的功能食品组合物的制备方法，具体包括以下步骤。
12.步骤1、将所述各组分原料除杂、净化、晾干后备用。
13.步骤2、将葛根、覆盆子、黑芝麻、茯苓在80℃的烘箱中烘干5h，再粉碎，过120目筛，得到细粉混合物a。
14.步骤3、牡蛎直接粉碎，合并黄瓜籽粉、菊粉和白芸豆粉过100目筛，得到细粉混合物b。
15.步骤4、将混合物a与混合物b均匀混合后制得所需剂型。
16.所述通过调节肠道菌群增加骨密度的功能食品组合物在制备增加骨密度、改善肠道菌群的的药物、食品和保健品中的用途。
17.进一步地，所述的多功能食品组合物加入辅料制备成不同制剂，所加入的辅料为药学上可接受的辅料。
18.所述制剂为口服制剂包括片剂，胶囊剂，散剂，颗粒剂，冲剂，泡腾剂或袋泡剂等。优选药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂和袋泡剂。
19.本发明还可应用到不同食品中。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
21.本发明提供的增加骨密度的多功能食品组合物中黄瓜籽、葛根、覆盆子、黑芝麻、牡蛎、茯苓、菊粉和白芸豆粉8味药材组合在一起，通过调理肠道菌群促进矿物质吸收，调理性补钙，达到增加骨密度的效果的保健食品还未见报道。所述增加骨密度的多功能食品组合物原料均选自国家卫计委2020年发布文件《按照传统既是食品又是中药材物质目录管理办法》征求意见稿的110种药食同源的药材，天然无害，适合长期服用。在平衡了性味归经之后，不会产生寒凉刺激。本发明作为一种组合物的保健品，其中黄瓜籽为老黄瓜籽，葛根为野葛富含大量的异黄酮类成分，牡蛎为牡蛎壳，富含碳酸钙。
22.本发明提供的增加骨密度的多功能食品组合物以中医药组方理论为指导，采用抗骨质疏松药效学参数为验证指标，筛选验证组方的合理性，疗效较佳的抗绝经后骨质疏松配方，按照传统的补肾壮骨中医理论以及中药系统药理学大数据分析得到治疗骨质疏松的组方，根据君臣佐使及药物配伍规律进行组方及拆方研究，并通过现代生物化学的手段进行验证，具有非常显著的增加骨密度的作用。在现有技术中没有利用本配方治疗骨质疏松
的相关报道。配方中的各药物成分协同起效，通过调节肠道菌群促进矿物质吸收实现对骨骼的调理。本发明补肾健脾，活血通络，标本兼顾，即脾健肾精充足，络通而气血旺，致精血充沛，则筋骨强健。
23.本发明提供的增加骨密度的多功能食品组合物本利用tcmsp、david等在线数据库的生物信息学分析手段对组合物主药材的成分、靶点进行了筛选和富集分析以支持本发明组方的合理性和全面性。
附图说明
24.图1为本发明增加骨密度的多功能食品组合物对股骨远心端骨小梁的影响2d图。
25.图2为本发明增加骨密度的多功能食品组合物对肠组织he染色切片的影响。
26.图3-1至图3-4为本发明增加骨密度的多功能食品组合物对肠道菌群物种差异分析科水平的影响。
27.图4-1至图4-2为本发明增加骨密度的多功能食品组合物对粪便和血清中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、总短链脂肪酸的含量的影响。
具体实施方式
28.以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
29.实施例1。
30.称取黄瓜籽20份、葛根20份、覆盆子10份、黑芝麻3份、牡蛎4份、茯苓3份、菊粉3份、白芸豆粉1份，然后按照如下方法制备实施例1的保健食品：步骤1、将所述各组分原料除杂、净化、晾干后备用；步骤2、将葛根、覆盆子、黑芝麻、茯苓在80℃的烘箱中烘干5h，再粉碎，过120目筛，得到细粉混合物a；步骤3、牡蛎直接粉碎，合并黄瓜籽粉、菊粉和白芸豆粉过100目筛，得到细粉混合物b；s4将混合物a与混合物b均匀混合。
31.实施例2。
32.称取黄瓜籽25份、葛根15份、覆盆子10份、黑芝麻2份、牡蛎2份、茯苓3份、菊粉2份、白芸豆粉2份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例2的保健食品。
33.实施例3。
34.称取黄瓜籽粉24份、葛根8份、覆盆子8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例3的保健食品。
35.实施例4。
36.称取葛根8份、覆盆子8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例4的保健食品。
37.实施例5。
38.称取黄瓜籽粉24份、覆盆子8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例5的保健食品。
39.实施例6。
40.称取黄瓜籽粉24份、葛根8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1
份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例6的保健食品。
41.实施例7。
42.称取黄瓜籽粉24份、葛根8份、覆盆子8份、牡蛎2份、茯苓2份、菊粉2份、白芸豆粉1份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例7的保健食品。
43.实施例8。
44.称取黄瓜籽粉24份、葛根8份、覆盆子8份、黑芝麻4份、牡蛎2份、菊粉2份、白芸豆粉1份；然后按照与实施例1相同的制备方法制备实施例7的保健食品。
45.实施例9本发明加骨密度的功能食品组合物组方合理性验证。
46.首先利用文献挖掘从古代方剂和国产保健食品数据库检索抗骨质疏松应用频次较多的中药材，从中选取药食两用的单味药：黄瓜籽、葛根、覆盆子、黑芝麻、牡蛎、茯苓。
47.通过以下数据库tcmsp数据库(http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php)；tcmid数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)；tcm database@taiwan数据库(http://tcm.cmu.edu.tw/)；搜集各原料药的成分(ob》20％,dl》0.18)，建立成分-靶点的网络图，将筛选到的靶点输入到uniprot数据库中规范靶点名称，对应其基因名称。将所有靶点的基因名称上传至david数据库，进行go-bp的生物过程和kegg的通路富集分析，筛选出与骨质疏松发生发展相关的靶点基因。应用cytoscape3.3.1软件将入选的成分、靶点进行成分-靶点的网络构建，验证组方合理性，优选组方。
48.本发明的5味主要原料中药材共筛选出116个潜在活性成分，245个靶点，其中所富集到的与骨质疏松相关的靶点共计51个，肠道相关靶点71个，占到筛选靶点的1/5以上。排名前15的通路都与钙的吸收、骨代谢和肠道免疫过程息息相关，从生物信息学分析的角度，充分说明本发明组方的合理性和具有通过肠道菌群改善骨质疏松功能性的潜在性。
49.实施例10本发明加骨密度的功能食品组合物的方剂的筛选实验。
50.通过网络药理学的预测和传统中医理论组方，确定了组方中主药为黄瓜籽、葛根、覆盆子、黑芝麻、茯苓，然后按不同的配比进行组方的优选，即实施例1-3，对组方中的几味主药进行拆方，验证组方的合理性，减少方中黄瓜籽即实施例4，减少方中葛根即实施例5，减少方中覆盆子即实施例6，减少方中黑芝麻即实施例7，减少方中茯苓即实施例8。然后进行去势大鼠的灌胃给药，三个月后测量大鼠的骨密度。
51.1、造模。
52.大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥钠溶液麻醉，腹位固定后于腹中线距离阴道口3—4cm处去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约2—3cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢。分离脂肪团，便可见粉红色或黄色的卵巢，以止血钳夹住卵巢，然后将卵巢下输卵管用线结扎，剪出卵巢，顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另一侧卵巢。腹肌和皮肤分层缝合后，再次消毒。最后经后肢肌肉注射2万u青霉素。
53.2、动物分组与给药。
54.大鼠经适应性饲养后分组，按照发明组合物实施例1-7配置混悬液(按大鼠体重每kg等计量的生药材给药)，实验动物按体重随机分组为切除卵巢 实施例1、切除卵巢 实施例2、切除卵巢 实施例3、切除卵巢 实施例4、切除卵巢 实施例5、切除卵巢 实施例6、切除卵巢 实施例7、切除卵巢 实施例8、切除卵巢组 溶剂组、假手术组。每组动物10只。每周称
取体重，并按新体重调整灌胃剂量，给药3个月，各组大鼠自由饮水、摄食。
55.3、数据分析。
56.所有实验数据以平均数
±
标准差表示，用spss16.0进行t检验分析。
57.4、测定指标。
58.骨骼标本：采血后脱颈处死大鼠，完整分离大鼠的左右两侧股骨，剔除所有附着的肌肉和结缔组织，每只以10％甲醛溶液固定，进行病理学检查；一只用生理盐水浸泡的纱布包裹，保存于-80℃保存，分别测定股骨的骨密度。
59.用双能x射线骨密度仪测定股骨中点的骨密度。将待测骨放置于测量台上与骨密度仪探测头移动方向垂直；移动待测骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹于测量台上的垂直投影重合。开始测量股骨中点骨密度。
60.5、实验结果。
61.不同组大鼠股骨分别测定骨密度，见表1，模型组股骨中点骨密度降低，提示去卵巢后大鼠股骨的骨密度明显降低；实施例1、2、3不同程度地提高了骨密度，其中实施例3改善的最为明显；实施例4、5、6、7、8与造模组相比无显著性差异，提示拆掉主药中的任何一味药重新组方改善骨密度的药效都不如本发明组方好，证实了组方的合理性。最佳组方配比为实施例3。
62.表1.对去卵巢大鼠骨密度(g/cm2)的影响(n＝10)。组别骨密度实施例10.24
±
0.01*实施例20.23
±
0.01*实施例30.25
±
0.02**实施例40.22
±
0.01实施例50.22
±
0.02实施例60.21
±
0.01实施例70.22
±
0.02实施例80.21
±
0.03造模组0.21
±
0.02#假手术组0.27
±
0.01
63.注：与模型组比较“*”p《0.05，“**”p《0.01，与假手术组比较“#”p《0.05(下同)。
64.实施例11本发明加骨密度的功能食品组合物药效学评价。
65.一、本发明抗骨质疏松的作用。
66.1、测定指标。
67.收集实施例3(ovx f)、去势造模组(ovx)、阳性药己烯雌酚组(ovx des)和假手术组(sham)的血清，测定骨代谢生化指标：大鼠酒石酸酸性磷酸酶5b(tracp-5b)，骨源性碱性磷酸酶(balp)，i性胶原羧基末端肽(ctx),骨保护素(opg)。
68.骨骼标本：采血后脱颈处死大鼠，完整分离大鼠的左右两侧股骨，剔除所有辐照的肌肉和结缔组织，一只以10％甲醛溶液固定，进行病理学检查；一只用生理盐水浸泡的纱布包裹，保存于-80℃保存，分别测定股骨的皮质骨骨密度、骨小梁3d结构。
69.将大鼠右侧股骨从软组织中取材，清洗，固定在4％多聚甲醛中。采用quantum gx
型号微计算机断层扫描(μ-ct)系统(perkinelmer micro-ct,usa)对其进行研究。使用30μm体素尺寸、90kv扫描股骨远端。对于小梁骨，在股骨远端2mm3的干骺端海绵区进行μ-ct评估。这些区域位于股骨生长板上方0.8mm处。使用quantum gx 3.1.4软件对图像进行三维重建和可视化。三维重建后，使用accuct microct analysis 12.0软件进行骨分析。计算或直接测量骨密度(bmd)、骨体积分数(bv/tv)、骨小梁厚度(tb.th)和骨小梁间距(tb.sp)的指标。
70.子宫标本：充分暴露并剥离取出子宫，电子天平称重，计算子宫指数。子宫指数＝(子宫重量
÷
体重)
×
100％在骨、子宫、肠、肝脏、肾脏组织学和组织形态学分析中，我们使用石蜡切片。首先将大鼠左股骨、子宫、肠、肝脏、肾脏组织固定在4％多聚甲醛(pfa)中，按照方案依次脱钙脱水，然后将其嵌入石蜡中，切片成4μm厚的切片。切片用苏木精和伊红(h&e)染色，光镜下观察组织结构。
71.将新鲜粪便样本(n＝5只/组)收集在无菌管并储存在液氮中。采用粪便提纯dna试剂盒，根据制造商的说明书提取粪便样品dna，并通过凝胶电泳检测细菌基因组dna。采用16s rrna基因分析法对4组肠道细菌组成进行分析，将样本dna扩增，用带有条形码的特定引物16s v3
–
v4 rdna区域。引物序列为341f:cctacgggngcwgcag；806r:ggactachvggtatctaat。利用quantifluor tm qubit 3.0和abi steponeplus实时pcr系统回收并定量pcr扩增产物。将纯化的扩增产物等量混合，连接到测序适配器上构建测序库。最后，利用pe250平台在hiseq2500系统上对库进行排序，生成250bp的成对端读。使用qiime(v1.9.1)软件包(微生物生态学定量分析)分析序列。首先，读取被qiime质量过滤器过滤。接下来，我们为每个otu(操作分类单元)选择代表性序列，并使用rdp(核糖体数据库项目)分类器(版本2.2)对每个代表性序列的分类信息进行注释。按大小降序排列的分类等级有域、门、类、目、科、属和种。鉴定了两组样品的属间差异。
72.2、实验结果。
73.(1)对血清ctx，balp，tracp5b，opg骨代谢生化指标的检测。
74.酶联免疫吸附剂测定血清中的大鼠酒石酸酸性磷酸酶5b(tracp-5b)，骨源性碱性磷酸酶(balp)，i性胶原羧基末端肽(ctx)和骨保护素(opg)水平，ctx、balp和tracp-5b含量显著升高与骨质疏松症有关，骨保护素是骨形成的标志物，结果见表2。模型组大鼠血清中四种成分的含量，与假手术对照组比较具有显著性差异，提示造骨质疏松模型成立；本发明降低了血清中ctx、balp和tracp-5b三种成分的含量，而提高了opg的含量，提示本发明对骨质疏松有治疗作用。
75.表2.本发明对去卵巢大鼠血清ctx，balp，tracp-5b和opg骨代谢生化指标的影响(n＝10)。组别ctx(nmol/l)balp(pg/ml)tracp5b(pg/ml)opg(pg/ml)假手术组2.73
±
0.5824.13
±
3.1748.67
±
9.9689.35
±
5.74造模组3.08
±
0.16#36.55
±
3.25##91.08
±
3.69##69.43
±
2.24##本发明组2.74
±
0.07*26.26
±
3.68**60.12
±
5.20**91.15
±
4.14**己烯雌酚2.43
±
0.38**24.14
±
3.57**61.69
±
4.73**84.63
±
5.37*
76.(2)对去卵巢大鼠骨组织病理学的影响。
77.通过micro-ct对大鼠左侧股骨进行扫描，病理诊断结果如图1所示。
78.假手术组：该组股骨骨小梁排列密集，互相连接呈网状结构，骨小梁密度大，间距减小。
79.模型组：骨小梁明显变细，数量明显减少，断裂增多，骨小梁密度明显减小，髓腔扩大，皮质骨变薄。与空白组比较骨小梁髓腔间距增大，造成了骨质疏松。
80.己烯雌酚组：与模型组比较骨小梁变得规则，数目增多，断裂减少，髓腔间隙变小，但骨小梁密度仍小于空白组。
81.本发明组：给本发明组合物后，骨小梁数量增多，密度明显增高，髓腔间隙变小，皮质骨变厚，提示本发明对骨质疏松有治疗作用。
82.(3)对肠道菌群的影响。
83.骨质疏松会导致肠道菌群紊乱，肠道菌群失调引起的炎症状态、自身免疫改变会导致骨质流失，骨形成减少。通过he染色切片观察到，如图2所示，骨质疏松后小肠绒毛结构破坏，出现局灶性浅表固有层水肿，轻度炎症增加，上皮细胞损伤或丢失，杯状细胞形态不规则，而本发明能够明显调节这种紊乱，使其恢复至正常水平，从而增加骨密度，改善骨质疏松。与假手术相比，模型组在科水平，胃瘤球菌科、毛螺菌科、肠杆菌科、理研菌科的丰度异常升高，而普雷沃氏菌科、乳杆菌科的比例异常降低，而在本发明组，这些异常升高的菌科水平明显降低，乳杆菌科水平完全升高至正常水平，整体物种组成比例恢复至正常水平，如图3-1至图3-4所示。提示去势造模会导致大鼠肠道菌群紊乱，而本发明能够明显调节这种紊乱，使其恢复至正常水平。短链脂肪酸是肠道菌群的重要代谢产物，会促进肠道对矿物质的吸收，模型组粪便和血清中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸含量均下降，如图4-1至图4-2所示，服用本发明组合物后，短链脂肪酸含量显著提高，特别是乙酸和丁酸含量显著增加。结合已有研究报道scfa通过调节免疫相关的炎性因子或者直接作用于破骨细胞，可以发挥改善骨质疏松的作用。本发明可以通过调节肠道菌群促进矿物质的吸收从而调节骨代谢发挥抗骨质疏松作用。
84.二、安全性评价。
85.服用本发明三个月的大鼠精神状态良好，皮毛光亮，自主活动正常，子宫指数正常，维持子宫正常形态，肝功、肾功正常，体重平稳下降，纠正肠道菌群失衡，增加益生菌，增加肠壁完整性，维持肠道稳态，对白细胞、红细胞、血小板均无任何影响，安全有效。而服用雌激素己烯雌酚三个月后的大鼠体态消瘦，无精打采，皮毛暗淡，行动迟缓，子宫肿大，子宫内膜增生，转氨酶、尿素、肌酐异常增高，肝脏肿大，肾脏发黑，肝小叶萎缩，肝细胞排列不规则，肾小球空泡，肝肾损伤严重，体重急剧下降，肠道菌群失调，红细胞和血红蛋白数量偏低，引起轻度贫血。因此，本发明通过改善肠道菌群显著增加骨密度，同时辅助降血脂，无不良反应，适宜长期服用。
86.三、人体试食评价。
87.经50例骨质疏松患者(年龄50-70)服用本产品三个月，回馈均有效改善和缓解骨质疏松造成的疼痛症状，筋骨舒展，排便规律，体重稳步下降。