一种脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法、系统以及计算机可读载体

1.本发明涉及微生物种类的测定技术领域，尤其涉及一种脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法。


背景技术：

2.脓肿分枝杆菌可以导致皮肤感染和一定程度的肺炎。脓肿分枝杆菌备受关注的原因因为其存在严重的耐药性，甚至有菌株对现有抗生素全都不敏感。脓肿分枝杆菌包括三个亚种，脓肿分枝杆菌脓肿亚种m.abscessus.subsp abscessu e，和脓肿分枝杆菌bolletii亚种m.abscessus.subsp.bolletii与脓肿分枝杆菌马赛亚种m.abscessus subsp.abscessuse亚种；不同亚型的脓肿分枝杆菌对抗生素的敏感程度不同，因此需要鉴定出准确的脓肿分枝杆菌亚型。而现无专门基于基因组的准确鉴定脓肿分枝杆菌亚群的方法。传统的基于生化反应的方法已经淘汰，分子生物学的基于单基因有无的方法不够准确，基于全基因组鉴定亚种的方法目前无统一的方法和标准，但准确鉴定出脓肿分枝杆菌亚群有指导临床用药的现实意义，因此需要准确鉴定。
3.现有的方法是基于16s rrna或者rpob基因的相似度来进行鉴定的，但本发明人通过搜索ncbi数据库中现有的分枝杆菌库比对发现：16s rrna的鉴定方法甚至不能区分脓肿分枝杆菌与亲缘关系相近的mycobacterium sal moniphilum,mycobacterium immunogenum,mycobacterium stephanolepidis,mycobacterium franklinii,mycobacterium chelonae,and mycobacterium saopa ulense。如附图1所示，从内侧数第一个圆圈展示现有根据16s rrna鉴定的分枝杆菌种属结果。根据现有标准，当大于16s临界值(99％)时(内侧圈一深颜色标注)包含不仅仅是三个脓肿分枝杆菌亚种还有其它的分枝杆菌(myc obacterium salmoniphilum,mycobacterium immunogenum,mycobacterium ste phanolepidis,mycobacterium franklinii,mycobacterium chelonae,and mycoba cterium saopaulense)。而rpob基因能鉴定出脓肿分枝杆菌种，但不能鉴定出分枝杆菌亚种，如附图1所示，从外侧数圆圈，根据rpob鉴定标准当大于临界值是(浅色显示)可以鉴定出为脓肿分枝杆菌，但不能区分出具体亚种。基于基因组相似度(ani)可以判断出脓肿分枝杆菌为同一个种，但无法判断出属于哪个亚种，达不到指导临床的目的。如附图2所示，三角形，菱形和方块混在一起无法区分脓肿分枝杆菌的三个亚种。


技术实现要素：

4.针对上述背景技术，目前已有的分枝杆菌鉴定方法都是鉴定种，但是脓肿分枝杆菌不同亚种之间的耐药表型不同，而现有鉴定方法都是鉴定到种而不能准确区分亚种，特别是m.abscessus.subsp.bolletii亚种与m.abscessus subsp.ab scessuse亚种，本发明目的是提供一种脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法，能显著区分脓肿分枝杆菌及其亚种。
5.本发明一个方面提供的一种脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法，所述鉴定方法采
用全基因序列blast对比的方法，分别进行rpob基因、erm(41)基因和rpls基因。
6.在本发明的具体技术方案中，所述的亚种选自m.abscessus subsp.massiliense、m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii。
7.在本发明的具体技术方案中，所述鉴定方法包括以下步骤：
8.s1)调取待检测菌株的全基因序列；
9.s2)进行全基因序列blast比对，对比的区域为rpob基因，鉴定是否为脓肿分枝杆菌；
10.s3)将鉴定为脓肿分枝杆菌进一步进行全基因序列blast对比，对比的区域为erm(41)基因，鉴定是否是m.abscessus subsp.massiliense；
11.s4)将步骤3)中鉴定为不是m.abscessus subsp.massiliense的，进一步进行全基因序列blast对比，对比的区域为rpls基因，鉴定是m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii。
12.在本发明的具体技术方案中，所述鉴定方法包括以下步骤：
13.s1)获得待检测菌株的全基因序列；
14.s2)将待检测菌株的全基因序列与第一模板序列进行blast比对，第一模板序列的对比的区域为rpob基因，当基因同源性小于97％，则鉴定不是脓肿分枝杆菌，当基因同源性大于等于97％，则鉴定为脓肿分枝杆菌；
15.s3)将鉴定为脓肿分枝杆菌进一步与第二模板序列进行blast对比，第二模板序列的对比的区域为erm(41)基因，当基因同源性大于等于99.58％，则鉴定为是m.abscessus subsp.massiliense；其中erm(41)基因为m.abscessus subsp.massiliense中的不完整erm(41)基因；
16.s4)将步骤3)中对比erm(41)基因后，基因同源性小于99.58％的脓肿分枝杆菌进一步与第三模板序列进行blast对比，第三模板序列的对比的区域为rpls基因，当基因同源性小于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.abscessuse，当基因同源性大于等于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.bolletii。
17.在本发明的技术方案中，第一模板序列如seq id no.1所示。
18.在本发明的技术方案中，第二模板序列如seq id no.2所示。
19.在本发明的技术方案中，第三模板序列如seq id no.3所示。
20.在本发明的具体技术方案中，本发明鉴定方法不使用引用或探针。
21.本发明另一个方面提供了一种脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定系统，所述鉴定系统包括数据输入和记录模块、鉴定浓重分枝杆菌模块、m.abscessus subsp.massiliense分型模块以及m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii分型模块。
22.在本发明的具体技术方案中，所述数据输入和记录模块用于输入和记录脓肿分枝杆菌的全基因序列数据。
23.在本发明的具体技术方案中，鉴定浓重分枝杆菌模块用于进行全基因序列blast比对，对比的区域为rpob基因，并判断待测菌株是否为脓肿分枝杆菌。
24.进一步地，鉴定浓重分枝杆菌模块用于将待检测菌株的全基因序列与第一模板序列进行blast比对，第一模板序列的对比的区域为rpob基因；并进行逻辑判断：当基因同源性小于97％，则鉴定不是脓肿分枝杆菌，当基因同源性大于等于97％，则鉴定为脓肿分枝杆
菌。
25.在本发明的具体技术方案中，m.abscessus subsp.massiliense分型模块用于将鉴定为脓肿分枝杆菌进一步进行全基因序列blast对比，对比的区域为erm(41)基因，并判断待测菌株是否是m.abscessus subsp.massiliense。
26.进一步地，将鉴定为脓肿分枝杆菌进一步与模板菌株的全基因序列进行blast对比，对比的区域为erm(41)基因；并进行逻辑判断：当基因同源性大于等于99.58％，则鉴定为是m.abscessus subsp.massiliense；其中erm(41)基因为m.abscessus subsp.massiliense中的不完整erm(41)基因。
27.在本发明的具体技术方案中，m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii分型模块用于将m.abscessus subsp.massiliense分型模块中鉴定为不是m.abscessus subsp.massiliense的，进一步进行全基因序列blast对比，对比的区域为rpls基因，鉴定是m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii。
28.进一步地，m.abscessus subsp.abscessuse或m.abscessus subsp.bolletii分型模块用于将m.abscessus subsp.massiliense分型模块中对比erm(41)基因后，基因同源性小于99.58％的脓肿分枝杆菌进一步与第三模板序列进行blast对比，对比的区域为rpls基因；并进行逻辑判断：当基因同源性小于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.abscessuse，当基因同源性大于等于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.bolletii。
29.在本发明的技术方案中，第一模板序列如seq id no.1所示。
30.在本发明的技术方案中，第二模板序列如seq id no.2所示。
31.在本发明的技术方案中，第三模板序列如seq id no.3所示。
32.本发明再一个方面提供了一种用于执行脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法计算机可读载体，所述计算机可读存储介质用于存储程序代码，所述程序代码用于执行上述脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法。
33.与现有技术相比，本发明所具有的有益效果为：
34.1)本发明可直接用于现有流程，未知细菌测序后组装，然后自动判断是否为脓肿分枝杆菌及其具体亚型。相比于之前方法，本方法不再需要不同引物，多次分别实验进行鉴定，简化了流程，有利于以后标准化所有菌种鉴定的实现。
35.2)本发明比现有方法更加准确，并且首次将rpls基因引入到脓肿分枝杆菌的鉴定中。之前的方法并不能做的精确鉴定，本方法不仅仅建立三步法精准鉴定体系，并首次将rpls基因引入到脓肿分枝杆菌鉴定中来达到了精准鉴定的目的。
36.本发明建立了一种新的脓肿分枝杆菌亚种的鉴定方法，弥补现有方法的不准确性。本发明脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法，是一套新型的基于基因组序列的鉴定系统，按顺序对筛选出的基因进行相似度比较，通过相似度与阈值比较来实现精准的亚种鉴定。该系统核心为三步法相似度比较，分别通过本地基因组与本方法选取的rpob全长基因，不完整的erm(41)基因，以及rpls基因进行比对，然后根据比对结果与本方法建立的临界值比较来实现脓肿分枝杆菌及其亚种的准确鉴定。
附图说明
37.图1为现有的16s rrna或rpob基因鉴定脓肿分枝杆菌及脓肿分枝杆菌亚种的结果图。
38.图2为基因组相似度(ani)区分脓肿分枝杆菌或脓肿分枝杆菌亚种的结果图注：菱形：m.abscessus subsp.massiliense；方块：m.abscessus subsp.bolletii。
39.图3为本发明对脓肿分枝杆菌及其亚种的鉴定方法的流程示意图。
40.图4为基于核心92个基因ubcg法对数据库中已知的脓肿分枝杆菌进化树。注：方块：m.abscessus subsp.massiliense；三角：m.abscessus subsp.bolletii。
41.图5为数据库中基因组与不完整erm(41)的比对结果，根据本发明选取的临界值进行标注，结果显示本发明标注的结果完全与数据库中备注m.abscessus subsp.massiliense结果吻合示意图。注：方块：m.abscessus subsp.massiliense。
42.图6为数据库中基因组与rpls比对结果，根据本发明选取的临界值进行标注，结果显示本发明标注的结果完全与数据库中备注m.abscessus subsp.bolletii吻合示意图。
43.图7为运用本发明构建的软件检测未知基因组及其鉴定结果界面
具体实施方式
44.下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。
45.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明所保护的范围。
46.实施例1脓肿分枝杆菌鉴定和分型构建方法
47.选取92个核心基因ubcg方法对ncbi数据库中已知的910个脓肿分枝杆菌构建进化树：结果显示可见脓肿分枝杆菌的三个不同的亚种显著分开，而且不同亚种在进化树中分别属于不同的群。
48.将ncbi数据库中所有脓肿分枝杆菌基因组序列与不完整erm(41)的比对，选取本发明中的临界值99.58％。结果显示，根据本发明标注的m.abscessus subsp.massiliense完全与ncbi数据库中备注的m.abscessus subsp.massiliense吻合如附图5所示。因此本发明可以极好的鉴别m.abscessus subsp.massiliense。
49.将ncbi数据库中所有脓肿分枝杆菌基因组序列与rpls比对，选取本发明中的临界值99.53％。结果显示，根据本发明标注的m.abscessus subsp.bolletii完全与ncbi数据库中备注的m.abscessus subsp.bolletii吻合，结果显示本系统的鉴定结果完全正确如附图6所示，因此本发明可以极好的鉴别m.abscessus subsp.bolletii。
50.实施例2脓肿分枝杆菌鉴定和分型方法验证
51.采用以下方法，检测ncbi数据库中全部的脓肿分枝杆菌基因组(910个)序列进行验证，910个结果均符合现有的标注。
52.s1)获得待检测菌株的全基因序列；
53.s2)将待检测菌株的全基因序列与第一模板序列进行blast比对，第一模板序列的
区域为rpob基因，当基因同源性小于97％，则鉴定不是脓肿分枝杆菌，当基因同源性大于等于97％，则鉴定为脓肿分枝杆菌；
54.s3)将鉴定为脓肿分枝杆菌进一步与模板菌株的第二模板序列进行blast对比，第二模板序列对比的区域为erm(41)基因，当基因同源性大于等于99.58％，则鉴定为是m.abscessus subsp.massiliense；其中erm(41)基因为m.abscessus subsp.massiliense中的不完整erm(41)基因；
55.s4)将步骤3)中对比erm(41)基因后，基因同源性小于99.58％的脓肿分枝杆菌进一步与第三模板序列进行blast对比，第三模板序列对比的区域为rpls基因，当基因同源性小于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.abscessuse，当基因同源性大于等于99.53％，则鉴定为m.abscessus subsp.bolletii。
56.第一模板序列的序列号：nc_010397.1:3915755-3919270。序列如下seq id no.1所示：
57.58.[0059][0060]
第二模板序列的序列号：fj358487.1。序列如下seq id no.2所示
[0061][0062]
第三模板序列的序列号：ap014547.1。序列如下seq id no.3所示
[0063][0064]
验证结果说明，本发明的实验方法操作简单，准确率高。
[0065]
实施例3脓肿分枝杆菌鉴定和分型方法自动化
[0066]
而且为了方便临床使用，本发明将该流程实现自动化，加载全基因组序列后，点击query就能确定出具体是不是脓肿分枝杆菌，如果是脓肿分枝杆菌能确定出具体亚种(如图7所示)。
[0067]
上面仅对本发明的较佳实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化，各种变化均应包含在本发明的保护范围之内。
[0068]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。